WesternBlot詳解及問題分析學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1WesternBlot詳解及問題詳解及問題(wnt)分析分析第一頁，共43頁。第1頁/共42頁第二頁，共43頁。第2頁/共42頁第三頁，共43頁。第3頁/共42頁第四頁，共43頁。p 高分辨率的電泳技術(shù)p 特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)p 1-5ng中等大小(dxio)的靶蛋白第4頁/共42頁第五頁，共43頁。第5頁/共42頁第六頁，共43頁。l蛋白樣品的制備lSDS-PAGEl轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物(d w)顯色第6頁/共42頁第七頁，共43頁。第7頁/共42頁第八頁，共43頁。第8頁/共42頁第九頁，共43頁。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20

2、mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚藍溴酚藍0.2 g總體積總體積100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚蘭20%甘油ddH2O第9頁/共42頁第十頁，共43頁。第10頁/共42頁第十一頁，共43頁。（1）具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒（2）平均1g 蛋白質(zhì)結(jié)合(jih)1.4g SDS（3）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（4）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比第11頁/共42頁第十二頁，共43頁。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳第12頁/共42頁第十三頁，共43頁。第13頁/共42頁第十四頁，共43頁。第14頁/共42頁第

3、十五頁，共43頁。 聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，簡稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強，具有一定(ydng)的機械強度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。第15頁/共42頁第十六頁，共43頁。單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）； 催化劑：過硫酸胺或核黃素（AP）；加速(ji s)劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機

4、理是通過提供氧游離基(free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化(ynghu)還原作用(catalyst-redox systems)來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（APTEMED）和光化學(xué)催化（核黃素TMTED）體系。第16頁/共42頁第十七頁，共43頁。凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE濃縮膠(5% Acrylamide)及分離(fnl)膠配方表： 第17頁/共42頁第十八頁，共43頁。 作用作用緩沖液緩沖液PHPH凝膠濃度凝膠濃度濃縮膠濃縮膠使蛋白樣品濃縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠分離膠

5、使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳(din yn)緩沖液：pH8.3 Tris-甘氨酸系統(tǒng)。第18頁/共42頁第十九頁，共43頁。ddH2O0.1%SDS:8%第19頁/共42頁第二十頁，共43頁。灌制積層膠 插入(ch r)梳子 第20頁/共42頁第二十一頁，共43頁。Staking gelSeparating gel第21頁/共42頁第二十二頁，共43頁。第22頁/共42頁第二十三頁，共43頁。n第23頁/共42頁第二十四頁，共43頁。第24頁/共42頁第二十五頁，共43頁。第25頁/共42頁第二十六頁，共43頁。第26頁/共42頁第二十七頁，共43頁。第27頁/共

6、42頁第二十八頁，共43頁。一抗、二抗孵育(f y)第28頁/共42頁第二十九頁，共43頁。辣根過氧化物酶法（HRP）堿性(jin xn)磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)第29頁/共42頁第三十頁，共43頁。體與抗原分離，適用于任何化學(xué)體與抗原分離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。發(fā)光底物系統(tǒng)。第30頁/共42頁第三十一頁，共43頁。第31頁/共42頁第三十二頁，共43頁。第32頁/共42頁第三十三頁，共43頁。第33頁/共42頁第三十四頁，共43頁。第34頁/共42頁第三十五頁，共43頁。第35頁/共42頁第三十六頁，共43頁。轉(zhuǎn)移(zhuny)到膜上的蛋白很少蛋白分子量 10KD蛋白的

7、等電點 9SDS濃度不合適凝膠太厚 原因?qū)Σ叩鞍追肿恿?0KD時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜更換高pH值Buffer在陰極buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高轉(zhuǎn)膜效率延長轉(zhuǎn)膜時間第36頁/共42頁第三十七頁，共43頁。膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高 原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度背景(bijng)太高第37頁/共42頁第三十八頁，共43頁。雜交(zjio)信號很弱抗體保存不當抗原不充足膜的漂洗過度 原因?qū)?/p>

8、策抗體長期保存應(yīng)在70，使用前做效價檢測增加蛋白上樣量，做已知標準量蛋白的對照減少漂洗的時間和次數(shù)第38頁/共42頁第三十九頁，共43頁。一抗不是唯一特異的二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合 原因?qū)Σ咧苽鋯慰寺】贵w或者重新選取合成抗原多肽的位點設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異結(jié)合出現(xiàn)(chxin)非特異帶第39頁/共42頁第四十頁，共43頁。第40頁/共42頁第四十一頁，共43頁。第41頁/共42頁第四十二頁，共43頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)會計學(xué)。第1頁/共42頁。針對(zhndu)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)。SDS-PAGE濃縮膠(5% Acrylami