抗體檢測(cè)技術(shù)與類風(fēng)濕因子ppt課件

1、凝集反響l 凝集反響是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反響出現(xiàn)的可見性景象。顆?？乖缤旰玫募?xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反響中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。沉淀反響1、絮狀沉淀反響2、環(huán)狀沉淀反響3、雙向分散4、單向免疫分散l雙向分散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測(cè)定抗體效價(jià)，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測(cè)抗原的存在和定性抗原?？乖贵w為單一體系時(shí)，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同： 抗原抗體為多體系時(shí)，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾。 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定

2、實(shí)驗(yàn) (ELISA) Enzyme linked immunosorbent assay ELISA既可測(cè)抗原又可測(cè)抗體，根據(jù)試劑來(lái)源、標(biāo)本性狀以及檢測(cè)的詳細(xì)條件，可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測(cè)方法： 1.直接法 2.間接法 3.雙抗體夾心法 4.雙夾心間接法l A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and

3、binds to antigen; (4) enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.l一 免疫吸附劑l1.固相載體l 要求： 吸附力強(qiáng)l 能堅(jiān)持Ag或Ab活性l 不參與化學(xué)反響 載體性能比較載體性能比較 要求：載體資料要求：載體資料+、- 結(jié)果差別大結(jié)果差別大 檢測(cè)方法：檢測(cè)方法：10ug/L IgG包被包被,加酶標(biāo)抗加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測(cè)，

4、顯色后，測(cè)20孔的孔的OD，要求，要求CV10% 常用載體：常用載體： 資料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯資料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等等 外形：小試管、小珠、微量反響板2. Ag或或Ab：純度高、效價(jià)高、結(jié)合力：純度高、效價(jià)高、結(jié)合力高高3. 免疫吸附劑免疫吸附劑(固相固相Ag或或Ab)： 包被：將包被：將Ag或或Ab固相化的過程固相化的過程 包被包被緩沖液緩沖液 封鎖：包被后在用封鎖：包被后在用1-5%小牛血潔白蛋小牛血潔白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾白再包被，以消除非特異吸附的干擾 酶結(jié)合物：酶結(jié)合物：1. 要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專注性強(qiáng)、要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專注性強(qiáng)

5、、性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、標(biāo)志后穩(wěn)定性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、標(biāo)志后穩(wěn)定2. 常用酶：常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等半乳糖苷酶等 3. 底物：底物：HRP可溶性底物及呈色：可溶性底物及呈色： 鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)：橙紅：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)；四甲基聯(lián)苯胺苯胺(TMB)：藍(lán)色：藍(lán)色(450nm) 5-氨基水楊酸氨基水楊酸(5-ASA)：棕色：棕色(550nm) 魯咪魯咪諾諾+H2O2：熒光：熒光HRP不可溶性底物及呈色：不可溶性底物及呈色： DAB：棕黃色：棕黃色 -萘酚：紅色萘酚：紅色 3-氧基氧基-9-乙乙基卡唑：紅色基卡唑：紅色 4-氯氯-1-萘酚：灰藍(lán)色萘酚：灰藍(lán)色AP可溶性底

6、物及呈色：可溶性底物及呈色： 對(duì)硝基苯磷酸酯對(duì)硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色：黃色(405nm) 4-甲基傘基磷酸酯甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光：熒光AP不可溶性底物及呈色：不可溶性底物及呈色： NBT和和BCIP混合液：紫色混合液：紫色 鞏固紅和萘酚鞏固紅和萘酚ASMX混合液：紅色混合液：紅色 -半乳糖苷酶：半乳糖苷酶： 4-甲基傘基甲基傘基-半乳糖苷：熒光半乳糖苷：熒光4. 酶結(jié)合物的制備：酶結(jié)合物的制備： 戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法用途l Dr Dennis E Bidwell and Alister Voller created the ELISA

7、test to detect various kind of diseases, such as malaria, Chagas disease, and Johnes disease. ELISA tests also are used as in in vitro diagnostics in medical laboratories. The other uses of ELISA include:l detection of Mycobacterium antibodies in tuberculosisl detection of rotavirus in fecesl detect

8、ion of hepatitis B markers in seruml detection of enterotoxin of E. coli in fecesWESTERN BLOTl步驟：l試劑預(yù)備：l1、SDS-PAGE試劑:見電泳實(shí)驗(yàn)。l2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。l3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。l4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2

9、HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。l5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液5%脫脂奶粉，現(xiàn)配：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。l6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0l。l l樣品制備l含量測(cè)定lSDSPAGE電泳l轉(zhuǎn)膜l免疫反響l化學(xué)發(fā)光類風(fēng)濕因子l類風(fēng)濕因子rheumatoid factor,RF可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型注：在臨床內(nèi)科學(xué)中描畫為四型，沒有IgD型；但在實(shí)驗(yàn)室診斷學(xué)中描畫

10、為5型，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中針對(duì)IgG FC片段上抗原表位的一類本身抗體，類風(fēng)濕因子陽(yáng)性患者較多伴有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如皮下結(jié)節(jié)及血管炎等。類風(fēng)濕因子l約90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎R(shí)A患者的RF呈陽(yáng)性。lIgA-RF與骨質(zhì)破壞有關(guān)，早期IgA-RF升高常提示病情嚴(yán)重，預(yù)后不良；IgE-RF升高時(shí)，已屬病情晚期。l某些本身免疫病，如冷球蛋白血癥、進(jìn)展性全身性硬化癥、枯燥綜合征、SLE等患者都有較高的陽(yáng)性率；一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現(xiàn)RF。類風(fēng)濕因子l近年來(lái)對(duì)IgM型類風(fēng)濕因子的生物作用已有所了解，這些生物作用包括：l1 、調(diào)理體內(nèi)免疫反響；l2、激活補(bǔ)體，加快去除微生物感染；l3、去除免疫復(fù)合物使機(jī)體免受循環(huán)復(fù)合物的損傷。類風(fēng)濕因子l測(cè)定IgG、IgA、IgM類RF通常用ELISA間接法，即用熱凝集兔IgG包被反響板微孔，參與檢樣后，再分別加抗人IgG、IgA、IgM酶標(biāo)志抗體，使反響后再與底物呈色。為防止各Ig類別RF相互