【課件】3.2.1目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建課件2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

1、第2節(jié)目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建第一課時(shí)一條小蟲引發(fā)的科技大戰(zhàn) 中國(guó)農(nóng)科院棉花研究所開發(fā)抗蟲棉紀(jì)實(shí)中國(guó)農(nóng)科院棉花研究所開發(fā)抗蟲棉紀(jì)實(shí)思考問(wèn)題：1.你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？ 2.培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟呢？ 抗蟲棉的培育過(guò)程基因工程的基本操作程序目的基因的 篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定1.概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。2.實(shí)例：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。一、目的基因資料：

2、蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt 抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt 抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因那么，如何篩選目的基因呢？二、篩選合適的目的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）序列比對(duì)工具（如BLAST）公共生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)、分析分子及基因組數(shù)據(jù)的軟件工具NCBI從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選目的基因問(wèn)題：篩選出來(lái)的目的基因，該怎么獲得它呢？三、 目的基因獲取方法基因組文庫(kù) （包含一種生物的所有基因）部分基因文庫(kù)（包含一種生物的一部分基因）（）2.基因文庫(kù)類型:（一）從基因文庫(kù)中直接獲取(二）人工合成（三）利用PCR

3、技術(shù)獲取和擴(kuò)增cDNA：先由mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下獲得單鏈DNA，再利用DNA聚合酶，將單鏈DNA復(fù)制，產(chǎn)生雙鏈DNA，即為cDNA。 1.概念： 將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。提取某種生物的全部DNA多個(gè)一定大小的DNA片段將DNA片段與載體連接，導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈罨蚪M文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)的構(gòu)建某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄酶催化DNA聚合酶催化部分基因文庫(kù)（如cDNA文庫(kù)）構(gòu)建 構(gòu)建（三）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR是聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

4、反應(yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA復(fù)制所需的基本條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶（體外用高溫代替）打開DNA雙鏈DNA兩條母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料Taq DNA聚合酶催化合成DNA子鏈與兩條母鏈結(jié)合的2種引物使DNA聚合酶能夠從引物 端開始連接脫氧核苷酸DNA的半保留復(fù)制1概念：2條件：3PCR原理：閱讀P77，獲取PCR的定義、條件、大致過(guò)程。說(shuō)明說(shuō)明：PCR所用原料實(shí)為dNTP，dNTP和ATP類似可以通過(guò)基團(tuán)轉(zhuǎn)移為反應(yīng)提供能量。4擴(kuò)增過(guò)程：

5、凱利穆利斯（Kary Mullis）4擴(kuò)增過(guò)程：5 33 5 3 5 5 35 3引物13 5 引物23 5 5 33 5 引物25 3引物15 3引物13 5 引物23 5 引物25 3引物1目的基因條件：DNA模板、4種脫氧核苷酸、引物和TaqDNA聚合酶過(guò)程：變性復(fù)性延伸DNA模板，四種脫氧核苷酸，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，耐高溫的DNA聚合酶3) PCR和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的不同點(diǎn)PCR過(guò)程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長(zhǎng)度通常為2030個(gè)脫氧核苷酸1） DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只有當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后， DNA聚合酶才能從引物的3端

6、開始延伸DNA鏈， DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸2) 緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)5關(guān)于PCR的幾點(diǎn)說(shuō)明：PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子6PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過(guò)程比較1 .下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述,錯(cuò)誤的是()A.每一次循環(huán)后目的基因的數(shù)量可以增加一倍B.PCR反應(yīng)過(guò)程中需要3個(gè)不同的溫度范圍C.PCR反應(yīng)過(guò)程中加入的酶的顯著特性是耐高溫D.模板DNA和引物能在每一次

7、擴(kuò)增中重復(fù)使用D當(dāng) 堂 自 評(píng)當(dāng) 堂 自 評(píng)2.在核酸分子雜交技術(shù)中,常常使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針(探針是指以放射性同位素、生物素或熒光染料等進(jìn)行標(biāo)記的已知核苷酸序列的核酸片段)。為了獲得B鏈作探針,可應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,應(yīng)選擇的引物種類是()A.引物1與引物2B.引物3與引物4C.引物2與引物3D.引物1與引物4C1、用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？思考?不能！由于RNA不穩(wěn)定，需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行擴(kuò)增。2、獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過(guò)幾次循環(huán)才能分離出目的基因？至少要三次循環(huán)。3、如何對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？瓊脂糖凝膠電泳 DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些

8、基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就叫電泳。思考?DNA片段基因1 基因2 基因3放大終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 4.4.如果如果直接把目的基因?qū)胧荏w直接把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，可能細(xì)胞，可能會(huì)出現(xiàn)什么樣的結(jié)果？會(huì)出現(xiàn)什么樣的結(jié)果？ 如何避免該結(jié)果的發(fā)生呢？如何避免該結(jié)果的發(fā)生呢？知識(shí)拓展：基因結(jié)構(gòu)：游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)直接被分解，且游離的DNA片段不能穩(wěn)定遺傳。n 編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成n 非編碼區(qū)：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)一、基因表達(dá)載體的作用-基因工程的核心1.使目的基因在

9、受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；2.使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。二、基因表達(dá)載體的組成位置：位置：功能：功能：RNARNA聚合酶聚合酶驅(qū)動(dòng)驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出基因轉(zhuǎn)錄出mRNAmRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)?；虻氖锥嘶虻氖锥耍ㄒ欢斡刑厥饨Y(jié)構(gòu)的（一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNADNA片段）片段）人們所需要的基因人們所需要的基因終止終止mRNAmRNA用來(lái)鑒別用來(lái)鑒別或篩選或篩選含有重組含有重組DNADNA分子的分子的細(xì)胞細(xì)胞載體表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。-基因工程的核心三、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程載體（

10、質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種問(wèn)題：該過(guò)程需要用到基因工程哪些工具？注意：1、目的基因應(yīng)插到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。2、目的基因的插入不能破壞標(biāo)記基因。3、切割質(zhì)粒和獲取目的基因的限制酶必須產(chǎn)生相同的末端。 （堿基互補(bǔ)，便于連接）-基因工程的核心問(wèn)題探討：1、使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會(huì)得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接 反向連接1122122122112.如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？雙酶切-G-CTTAA-A-TCTAG問(wèn)題探討：3.某目基因兩側(cè)的 DNA序列所含的限制酶酶切位點(diǎn)如圖所示,下列可作該目的基因最佳載體的是 () A B C DA當(dāng) 堂 自 評(píng)【情境】4.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前,需構(gòu)建基因表達(dá)載體,圖甲、乙表示質(zhì)粒及目的基因所在DNA片段,圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。任 務(wù) 活 動(dòng)(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要使用的工具酶為。 (2)用圖中的質(zhì)粒和DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),不能使用Sma切割,原因是 。 (3)構(gòu)建基因表達(dá)載體