4.免疫電鏡細胞化學技術(shù)

1、 免疫電鏡細胞化學技術(shù)免疫電鏡細胞化學技術(shù)電鏡細胞化學技術(shù)電鏡細胞化學技術(shù) 電鏡細胞化學技術(shù)電鏡細胞化學技術(shù)是電鏡技術(shù)與細胞化學技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一門新技術(shù)，也稱超微結(jié)構(gòu)細胞化學。 目的：目的：將化學研究與形態(tài)觀察相統(tǒng)一，要求在細胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究細胞內(nèi)各種生化物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情況以及這些生化物質(zhì)在細胞內(nèi)的動態(tài)變化，用以闡明細胞、細胞器結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系。 免疫電鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)是免疫化學技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的免疫電鏡技術(shù)是免疫化學技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理，用高電產(chǎn)物，根據(jù)抗原抗體的高度特異性結(jié)合原理，用高電子密度

2、的標記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結(jié)構(gòu)水子密度的標記物（如：金、鐵蛋白等）在超微結(jié)構(gòu)水平上檢測某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一平上檢測某些抗原性物質(zhì)的定位、定性、半定量的一種方法。種方法。 目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠目前免疫電鏡技術(shù)主要包括酶免疫電鏡技術(shù)，免疫鐵蛋白技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標記技術(shù)和鐵蛋白體金技術(shù)，此外還有抗體雜交技術(shù)、凝集素電鏡標記技術(shù)和鐵蛋白-抗抗鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。鐵蛋白電鏡復(fù)合物技術(shù)。用以標記抗體的酶要具備以下條件：用以標記抗體的酶要具備以下條件：1.與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗

3、原）的生物活性。與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）的生物活性。2.酶的純度高、特異性強、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價。酶的純度高、特異性強、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價。3.在體液或組織中不存在該酶的底物。在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標技術(shù)中最常用的標記酶是辣根過氧化物酶（酶標技術(shù)中最常用的標記酶是辣根過氧化物酶（HRP）電鏡免疫細胞化學技術(shù)的標本處理原則電鏡免疫細胞化學技術(shù)的標本處理原則 1 1、取材與固定、取材與固定 取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標本固定要求取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，標本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細胞

4、的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的甲醛短時固定隊抗原性保存好，但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。甲醛短時固定隊抗原性保存好，但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。 （1 1）2%2%多聚甲醛液多聚甲醛液 （2 2）2%2%多聚甲醛多聚甲醛-0.01%-0.01%0.05%0.05%戊二醛戊二醛 （3 3）4%4%多聚甲醛多聚甲醛-0.5%-0.5%苦味酸苦味酸-0.5%-0.5%戊二醛戊二醛 o 2通過冰凍切片或震動切片獲得厚切片。通過冰凍切片或震動切片獲得厚切片。 冰凍切片冰凍切片 8m ，震動切片，震動切片2080m。 o 3漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進行標記

5、染色。漂洗后的厚切片可按免疫組化步驟進行標記染色。o 4DAB顯色后再進行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。顯色后再進行鋨酸后固定以及電鏡包埋切片處理。o 5. 如果確定待測抗原的抗原性不會由于脫水包埋引起失活如果確定待測抗原的抗原性不會由于脫水包埋引起失活的前提下可在包埋切片后做標記染色。的前提下可在包埋切片后做標記染色。三、免疫染色三、免疫染色o包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進行免疫染色，然后包埋前染色：是指在未經(jīng)包埋的預(yù)切厚片上先進行免疫染色，然后再進行脫水包埋超薄切片。再進行脫水包埋超薄切片。 優(yōu)點：優(yōu)點：（1 1）切片染色前未經(jīng)四氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，切片染色前未經(jīng)四

6、氧化鋨固定、脫水、包埋等處理，對抗原性破壞較小。（對抗原性破壞較小。（2 2）可在定位后再進行超薄切片，提高陽性檢）可在定位后再進行超薄切片，提高陽性檢出率出率. .（3 3）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結(jié)構(gòu)的保）免疫染色后，用四氧化鋨后固定，有利于膜型結(jié)構(gòu)的保存。存。o包埋后染色：是指在超薄切片上進行免疫染色。包埋后染色：是指在超薄切片上進行免疫染色。o優(yōu)點：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不優(yōu)點：抗原暴露在超薄切片上，不存在免疫試劑分子穿透障礙，不需要穿透劑。需要穿透劑。2.免疫染色免疫染色 直接法：用酶標抗體直接與標本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，直接法：用酶標抗體

7、直接與標本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，爾后進行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。爾后進行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位。 間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標記的特異性間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標記的特異性抗體即第一抗體，后者與標本中的抗原反應(yīng)。然后使用過抗體即第一抗體，后者與標本中的抗原反應(yīng)。然后使用過氧化物酶標記第二抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。氧化物酶標記第二抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。o 結(jié)果判定結(jié)果判定o 在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，出現(xiàn)高在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，出現(xiàn)高電子密度的顆粒，即指示抗原抗體的存在。電子密度的顆粒，即指

8、示抗原抗體的存在。（二）膠體金免疫電鏡技術(shù)（二）膠體金免疫電鏡技術(shù) 利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質(zhì)，使其利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質(zhì)，使其與抗體相互吸引從而將抗體標記。再以金標記的抗體與抗體相互吸引從而將抗體標記。再以金標記的抗體與待檢抗原相互結(jié)合，由于金顆粒的電子密度高，電與待檢抗原相互結(jié)合，由于金顆粒的電子密度高，電鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。鏡觀察到金顆粒的位置，即抗原所在。2、膠體金的特性 顏色：膠體金的顏色與金粒子的直徑有關(guān)，5-60nm時為紅色，95nm是為藍色，用于免疫細胞化學的膠體金呈紅葡萄酒色。 影響膠體金穩(wěn)定的因素： a.電解質(zhì)：少量有促進穩(wěn)定的作用，過

9、量則破壞。 b.膠體金的濃度：濃度越高容易導(dǎo)致膠體金凝集。 c.溫度：長時間加熱可使穩(wěn)定性有所下降。 檬酸三鈉的用量與膠體金直徑的關(guān)系0.01%氯化金 1%檸檬酸三鈉 膠體金顆粒直徑 （ml) （ml） （nm）100 3.0 19.0100 4.0 15.0100 6.0 12.5100 1.5 24.5100 1.0 41.0100 0.6 71.5（1）膠體金的制備）膠體金的制備 檸檬酸三鈉還原法（檸檬酸三鈉還原法（15nm） 鞣酸鞣酸-檸檬酸鈉還原法（檸檬酸鈉還原法（6nm） 鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備不同大小膠體金顆粒的配方1%檸檬酸三鈉 1%鞣酸 0.025 mol/L K2CO3

10、去離子雙蒸水 膠體金顆粒直徑 （ml) （ml） （ml） （ml） （nm） 4 0.02 0 19.98 15 4 0.1 0 19.90 10 4 0.5 0.5 15.00 6.0 4 3 3 14.00 3.5優(yōu)點：優(yōu)點： 膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的膠體金能穩(wěn)定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不發(fā)生明顯的變化。生物活性不發(fā)生明顯的變化。 金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易精確定位。清晰可辨，易精確定位。不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細胞表

11、面的抗原、受體進行標記定位觀察。掃描電鏡對細胞表面的抗原、受體進行標記定位觀察。膠體金標記物易于制備，而且可以根據(jù)需要制備不同膠體金標記物易于制備，而且可以根據(jù)需要制備不同大小的膠體金，因此可以進行免疫電鏡的雙重標記。大小的膠體金，因此可以進行免疫電鏡的雙重標記。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少，可進根據(jù)抗原抗體反應(yīng)部分結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少，可進行粗略的免疫細胞化學定量研究。行粗略的免疫細胞化學定量研究。 o （2）電鏡包埋前免疫金染色）電鏡包埋前免疫金染色o 新鮮組織經(jīng)適當固定（新鮮組織經(jīng)適當固定（0.5%戊二醛戊二醛-2%多聚甲多聚甲醛固定醛固定0.51h），制成厚切片。），制成厚

12、切片。o 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗漂洗3次，每次次，每次15min。o 0.1mol/L甘氨酸漂洗甘氨酸漂洗10min，滅活自由醛基。，滅活自由醛基。o TBS漂洗，漂洗，5min3次，次，o 1%牛血清孵育組織塊牛血清孵育組織塊30min。o 第一抗體第一抗體4孵育過夜后室溫繼續(xù)放置孵育過夜后室溫繼續(xù)放置2h。o TBS漂洗，漂洗，5min3次，次，o 室溫下適當稀釋度的膠體金標記探針（二抗膠體金探室溫下適當稀釋度的膠體金標記探針（二抗膠體金探針或蛋白針或蛋白A膠體金探針等）孵育膠體金探針等）孵育60min。o TBS漂洗，漂洗，3min3次，后再用雙蒸水漂洗切片。次，后再

13、用雙蒸水漂洗切片。o 2%戊二醛戊二醛-2多聚甲醛固定多聚甲醛固定1h，1%鋨酸固定鋨酸固定3060min，常規(guī)脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。，常規(guī)脫水，包埋，切片染色后電鏡觀察。（3）電鏡包埋后免疫金染色法 o 超薄切片5070nm，置于鎳網(wǎng)或金網(wǎng)中。o 1% H2O2蝕刻，使試劑能穿透標本。EPON包埋的組織蝕刻時間約10min，而LRWhite、LR Gold包埋的組織蝕刻時間則常小于5min.o 雙蒸水漂洗雙蒸水漂洗3次，每次次，每次10min。o 1%牛血清孵育切片牛血清孵育切片15min。o 載網(wǎng)不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在室溫孵育載網(wǎng)不沖洗，摔干后直接移至第一抗滴上，在

14、室溫孵育12h或或41824h。o TBS漂洗，漂洗，3min3次。次。o 室溫下適當稀釋度的膠體金標記探針（二抗膠體金探針或蛋白室溫下適當稀釋度的膠體金標記探針（二抗膠體金探針或蛋白A膠體金探膠體金探針等）孵育針等）孵育3060min。o TBS漂洗，漂洗，3min3次，后在用雙蒸水漂洗切片。次，后在用雙蒸水漂洗切片。o 醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。醋酸鈾和硝酸鉛輕微染色后電鏡觀察。2.電鏡免疫金染色 用于電鏡的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根據(jù)抗原的性質(zhì)加以選擇。 染色方法也有直接法和間接法。o (5)染色結(jié)果判斷染色結(jié)果判斷o 假陽性染色和假陰性染色假陽性染色和假陰性染

15、色o 可以通過調(diào)整固定液種類、濃度、固定時間，改變可以通過調(diào)整固定液種類、濃度、固定時間，改變一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時間、溫度等減一抗和二抗膠體金探針濃度、孵育時間、溫度等減少假陽性和假陰性染色。少假陽性和假陰性染色。雙標記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm, 20nm圖7-11 血小板表面膠體金標記GPIb單抗 9000鐵蛋白標記電鏡免疫細胞化學技術(shù) 鐵蛋白標記抗體是由Singer（1959）首創(chuàng)的一種免疫細胞化學技術(shù)。這技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于病毒和細胞表面抗原的檢測。鐵蛋白作為電鏡觀察的標記物，具有顆粒大、分辨率高、散射力強的特點，可用于細胞膜表面抗原的準確定位。所以，雖然40年后的今天已發(fā)展

16、了多種免疫電鏡細胞化學技術(shù)，但鐵蛋白標記法仍然是一種基本技術(shù)。 基本原理：基本原理： 鐵蛋白是一種直徑鐵蛋白是一種直徑101012nm12nm的球形的蛋白質(zhì)（分的球形的蛋白質(zhì)（分子量子量450kD450kD）, ,它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約7.5nm7.5nm），該核心含），該核心含2000200050005000個鐵原子，分布于四個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成四個圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，個區(qū)域，形成四個圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，因此可用于電鏡觀察?？贵w與鐵蛋白通過低分子量的因此可用于電鏡觀察。抗體與鐵蛋白通過低分子量的偶聯(lián)劑形成抗體偶聯(lián)劑形成抗體- -鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有高電子密度的鐵膠的