第4章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝

1、武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝第第4章章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝2本章內(nèi)容4.1 制藥動(dòng)物細(xì)胞4.2 動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)特征4.4 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)4.5 重組人紅細(xì)胞生成素的生產(chǎn)工藝武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝34.1 制藥動(dòng)物細(xì)胞武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝4一 動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核沒(méi)有細(xì)胞壁亞細(xì)胞器武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝5動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制葡萄糖限制：通過(guò)增加谷氨酰氨消耗得以補(bǔ)償，反之通過(guò)增加谷氨酰氨消耗得以補(bǔ)償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳

2、酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累。另一條途徑為TCA循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量乳酸，對(duì)細(xì)胞有毒性。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝6Gln代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以補(bǔ)償。 離體動(dòng)物細(xì)胞系，轉(zhuǎn)氨作用是主要代謝途徑。谷氨酰胺在脫氨酶的催化下，脫氨產(chǎn)生氨，對(duì)細(xì)胞有毒性。谷氨酰氨與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸，進(jìn)入培養(yǎng)液并積累。Gln能量：Glu轉(zhuǎn)化為-酮戊二酸，進(jìn)入TCA循環(huán)。流加葡萄糖或谷氨酰氨，控

3、制整個(gè)代謝過(guò)程，避免有毒廢物的積累。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝7蛋白質(zhì)糖基化與分泌表達(dá) 蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體 糖基化場(chǎng)所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成各種糖類，粗糙內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾。 不同細(xì)胞系糖基化特征不同，選擇適宜細(xì)胞 系。 對(duì)于分泌型蛋白，分泌泡與細(xì)胞膜融合，釋放 到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。 武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝8二 制藥動(dòng)物細(xì)胞的種類目前用于制藥的動(dòng)物細(xì)胞有4類：原代細(xì)胞系二倍體細(xì)胞系異倍體細(xì)胞系融合的或重組的工程細(xì)胞系武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝9細(xì)胞系分類來(lái)源：原代細(xì)胞，傳代細(xì)胞。壽命：有限細(xì)胞系，無(wú)限細(xì)胞系。染色體數(shù)目：二倍體細(xì)胞系，異倍體細(xì)胞系。獲得方式

4、：工程細(xì)胞系，癌變細(xì)胞系。生長(zhǎng)特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型細(xì)胞系。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝104.2 動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)特征武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝11一 對(duì)培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感無(wú)細(xì)胞壁保護(hù)，細(xì)胞膜直接接觸外界。物理化學(xué)因素：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力等耐受力很弱，容易受傷害。與細(xì)菌和植物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格地多。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝121 溫度哺乳動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度為 37雞細(xì)胞為 39 40；昆蟲類細(xì)胞為 25 28。耐受溫度范圍較窄，3537細(xì)胞受傷：3940 1小時(shí)，但能恢復(fù)。受傷嚴(yán)重：4142，部分可恢復(fù)。 死亡：43以上。武漢科技大

5、學(xué)制藥過(guò)程與工藝132氧氣動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)必須有氧氣，缺氧時(shí)不能生存。離體培養(yǎng)的氣體：含有 5CO2和95空氣，其中氧濃度為 中氧濃度為21。高氧環(huán)境：O2濃度 60%以上，對(duì)細(xì)胞毒性較大，抑制生長(zhǎng)和增殖，出現(xiàn)染色體異常等現(xiàn)象。 有時(shí)充以 有時(shí)充以N2氣稀釋O2濃度。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝143 pH值低于6.8或超過(guò) 7.6會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重影響甚 至使細(xì)胞死亡。 機(jī)體細(xì)胞的pH 范圍為68，而且在血液和體 液中，變化范圍很小。 人體 ：血液pH比較恒定，7.367.44。 低于7.05 發(fā)生酸中毒，高于 7.45發(fā)生堿中毒。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝154 滲透壓正常血漿滲透壓為280310

6、 mOsm/kg高滲溶液：高于310 mOsm/kg低滲透壓溶液：低于280mOsm/kg。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)滲透壓有較強(qiáng)的耐受性離體培養(yǎng)細(xì)胞的滲透壓應(yīng)控制為等滲透溶液。 增減 NaCl 的濃度調(diào)整滲透壓，每增加 1mg/ml NaCl，滲透壓增加32 mOsm/kg。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝16二 對(duì)培養(yǎng)基組成要求高動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高完全異養(yǎng)，容易利用、相對(duì)低分子量的營(yíng)養(yǎng)物12中必需氨基酸8種以上維生素多種無(wú)機(jī)鹽和微量元素多種附加成分：生長(zhǎng)類、細(xì)胞因子和貼壁因子因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)能源：?jiǎn)翁?，葡萄糖，谷氨酰氨氮源：氨基酸單體化合物武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝17三 天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物完善的

7、翻譯后蛋白質(zhì)修飾功能游離核糖體：合成細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)。與膜結(jié)合的核糖體：合成分泌性和膜整合蛋白，多數(shù)為糖蛋白。修飾：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工，高爾基體加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌，糖鏈。糖基化、磷酸化、酰胺化等?；钚苑肿樱貉b配折疊形成精確的三維結(jié)構(gòu)。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝18四 生產(chǎn)工藝特征產(chǎn)品與天然的產(chǎn)物一致：適于臨床使用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)：70蛋白質(zhì)藥物。培養(yǎng)工藝：難度大，產(chǎn)量低，成本高。胞外分泌產(chǎn)物：分離純化簡(jiǎn)單。有潛在的血源性污染危險(xiǎn)。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝194.3 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝20一 細(xì)胞生長(zhǎng)和基質(zhì)依賴性生長(zhǎng)基質(zhì)接觸抑制貼壁依賴性細(xì)胞非貼壁依賴性細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞武漢科技大

8、學(xué)制藥過(guò)程與工藝211 生長(zhǎng)基質(zhì)概念：growth substratum把改變生長(zhǎng)表面特性，促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì)。胞外基質(zhì)成分：多聚賴氨酸膠原武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝222 接觸抑制概念：contact inhibition細(xì)胞在生長(zhǎng)基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞互相接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖。特點(diǎn)：保持充足的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加。有：大多數(shù)細(xì)胞無(wú)：少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（癌細(xì)胞）武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝233 貼壁依賴性細(xì)胞概念：anchoraged-dependent cell需要有適量帶電荷的固體或半固體支持表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬

9、于此類。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝244 非貼壁依賴性細(xì)胞概念：anchoraged-independent cell不依賴于固體支持物表面生長(zhǎng)的細(xì)胞，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，被稱為懸浮細(xì)胞。舉例：血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞，Namalwa細(xì)胞。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝255 兼性貼壁依賴性細(xì)胞概念：對(duì)支持物的依賴性不嚴(yán)格，既可貼壁生長(zhǎng)，也可懸浮生長(zhǎng)。舉例：CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、L929細(xì)胞。理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝26二 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本過(guò)程1 原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)2 傳代細(xì)胞培養(yǎng)武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝271 原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程動(dòng)物組織或器官洗滌 粉碎酶

10、解消化離心或過(guò)濾洗滌培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞接種培養(yǎng)從體內(nèi)取出組織或器官經(jīng)過(guò)粉碎、消化而獲得單細(xì)胞進(jìn)行體外接種培養(yǎng)。37消化，胰蛋白酶，膠原酶工作濃度：0.1-0.3 mg/ml武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝282 傳代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程概念：對(duì)長(zhǎng)滿表面的細(xì)胞進(jìn)行消化分離，接種到新的培養(yǎng)基上，進(jìn)行新一輪培養(yǎng)。傳代時(shí)期：剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞。消化方法：過(guò)程與原代細(xì)胞相同。傳代的次數(shù)：不能無(wú)限次傳代，保證特性。防止細(xì)胞系之間、非細(xì)胞生物的污染。要領(lǐng)：適宜的時(shí)期和方法，不要過(guò)度。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝29三 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1 單層貼壁培養(yǎng)2 懸浮培養(yǎng)3 微載體培養(yǎng)4 固定化培養(yǎng)武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝301

11、 單層貼壁培養(yǎng)概念與過(guò)程細(xì)胞貼附于一定的固體支持表面上，形成單層細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程。生長(zhǎng)過(guò)程：接種，細(xì)胞經(jīng)過(guò)吸附、接觸而貼附于基質(zhì)表面；進(jìn)行生長(zhǎng)、分裂繁殖，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期。數(shù)天就長(zhǎng)滿整個(gè)表面，形成致密單層細(xì)胞。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝31單層貼壁培養(yǎng)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：容易更換培養(yǎng)液，灌注培養(yǎng)時(shí)，能達(dá)到高細(xì)胞密度；有利于產(chǎn)物的分泌表達(dá)，可改變培養(yǎng)液與細(xì)胞的比例。缺點(diǎn)：操作較繁雜，檢測(cè)受到限制，培養(yǎng)條件難以均一，傳質(zhì)和傳氧差，放大培養(yǎng)是瓶頸。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝322 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件相對(duì)均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易放大培養(yǎng)。缺點(diǎn)：細(xì)胞體積小

12、，密度低，培養(yǎng)病毒易失去標(biāo)記而降低免疫能力。適用范圍：懸浮細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞，雜交瘤借鑒微生物發(fā)酵理論和經(jīng)驗(yàn)，發(fā)揮動(dòng)物細(xì)胞的特性武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝333 微載體培養(yǎng)概念：細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養(yǎng)液中的培養(yǎng)過(guò)程。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高，重復(fù)性好，減少了勞動(dòng)強(qiáng)度，容易放大。兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點(diǎn)微載體，多孔微載體應(yīng)用：工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝344 固定化培養(yǎng)概念：用物理、化學(xué)方法將細(xì)胞固定在載體介質(zhì)上，然后進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。應(yīng)用：貼壁依賴性和非貼壁依賴性細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞密度高、抗剪切力和污染，生產(chǎn)首選方法共價(jià)交聯(lián)：

13、雙功能試劑處理，細(xì)胞之間交聯(lián)。吸附：物理吸附使細(xì)胞貼附在固體載體表面。包埋：細(xì)胞包埋在載體內(nèi)部。微囊法：親水半透膜把細(xì)胞包埋在微囊內(nèi)。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝354.4 重組人紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)工藝武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝36一 概述天然紅細(xì)胞生成素的發(fā)現(xiàn)與種類理化性質(zhì)重組人紅細(xì)胞生成素及其臨床應(yīng)用重組人紅細(xì)胞生成素表達(dá)研究武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝371 天然紅細(xì)胞生成1890：現(xiàn)象，低氧壓下紅細(xì)胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）。形式：hEPO-及hEPO-，二者氨基酸組成及順序相同，166aa，活性類似。糖基

14、化及其含量不同：EPO-含有較多的N-乙酰葡糖胺，總含糖量比EPO-高。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝382 EPO的理化性質(zhì)大?。?66aa糖鏈占分子量的39%。糖基化程度與準(zhǔn)確性對(duì)活性影響很大。pI4.24.6，對(duì)熱和pH變化相對(duì)穩(wěn)定。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝393 重組人紅細(xì)胞生成素第一代：兩種，rhEPO-和rhEPO-。1989：Amgen,Epogen；1990, Ortho Biotech, ProcritCHO、BHK細(xì)胞系生產(chǎn)第二代：EPO突變體，2001,Amgen,Arasnep長(zhǎng)效。二聯(lián)體或三聯(lián)體EPO：高活性，長(zhǎng)效（35倍）適應(yīng)癥：腎性貧血、艾滋病患者貧血、癌癥相關(guān)貧血

15、等。隔日注射一次，長(zhǎng)效EPO：每周一次。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝404 rhEPO的表達(dá)研究 由再生障礙性貧血患者的尿液中純化而得，人源的紅細(xì)胞生成素。產(chǎn)量極其有限。 SV40病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)載體，在COS-1中瞬時(shí)表達(dá)紅細(xì)胞生成素 昆蟲SF9細(xì)胞中桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)rhEPO。產(chǎn)率有所改善，但糖基化程度較小 干擾素-基因啟動(dòng)子的rhEPO表達(dá)載體，BALL-1細(xì)胞，產(chǎn)生較高量的rhEPO。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝41 大腸桿菌中表達(dá)，僅具有體外抗原結(jié)合活性。 家蠶體內(nèi)的表達(dá)系統(tǒng)，糖基化簡(jiǎn)單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問(wèn)題。 在CHO、BHK細(xì)胞系統(tǒng)中穩(wěn)定表達(dá)，獲得的重組紅細(xì)胞生成素

16、與天然紅細(xì)胞生成素相似?，F(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中多采用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)紅細(xì)胞生成素進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝42二 CHO培養(yǎng)工藝工程CHO細(xì)胞系建立種子細(xì)胞制備反應(yīng)器培養(yǎng)工藝培養(yǎng)過(guò)程控制武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝431 工程CHO細(xì)胞系共轉(zhuǎn)染，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝44穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選培養(yǎng)胰蛋白酶消化，1：5稀釋，在含有1 nMMTX培養(yǎng)基上培養(yǎng)，34d更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)1014天，至性克隆出現(xiàn)。胰酶消化，1：5稀釋，按1 nM5 nM25 nM100 nM200 nM1000 nM使MTX濃度逐次升高，篩選抗性克隆?？剐钥寺∨囵B(yǎng)于100 mm培養(yǎng)皿中，按1：500

17、稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)35天，集落2-4 mm。酶聯(lián)免疫分析：確認(rèn)表達(dá)人紅細(xì)胞生成素武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝452 種子細(xì)胞制備 凍存的細(xì)胞株37水浴，無(wú)菌離心。 加適量DMEM培養(yǎng)基（10%小牛血清）。 37、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。 細(xì)胞消化后接種，制成接種細(xì)胞濃度。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝463 灌流培養(yǎng) 反應(yīng)器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩沖液，高壓滅菌1.5h。 接種：排出PBS緩沖液，加DMEM培養(yǎng)基，接種。 貼壁培養(yǎng)：pH7，50r/min，37，DO 50-80%。 擴(kuò)增培養(yǎng)：80100r/min。 灌流培養(yǎng)：控制溫度、DO、pH值等培養(yǎng)條件，進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)基連續(xù)

18、培養(yǎng)。 收獲培養(yǎng)物，48保存。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝474 培養(yǎng)工藝過(guò)程控制 攪拌控制：接種后,攪拌速度緩慢，使細(xì)胞貼附于載體上，隨著細(xì)胞數(shù)量的增加逐漸提高攪拌速度。 溫度控制：較為嚴(yán)格，恒定37 pH值控制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。 溶解氧控制：在50-80的范圍內(nèi)，通入氧氣、空氣或氮?dú)獾谋壤旌蠚怏w。 葡萄糖控制：流加補(bǔ)料 代謝廢物控制：監(jiān)測(cè)氨、乳酸鹽類等，維持較低濃度，減少對(duì)細(xì)胞損害。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝48三 rhEPO的分離純化工藝初級(jí)分離精制純化產(chǎn)品質(zhì)量控制武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝491 初級(jí)分離收獲培養(yǎng)液：離心過(guò)濾：濾膜親和色譜：NaClTris平衡，梯度洗脫，收集活性洗脫峰透析：0.1mM Tris，過(guò)夜，換液4次。過(guò)濾：0.22 m濾膜。武漢科技大學(xué)制藥過(guò)程與工藝502 純化精制DEAE離子交換：NaCl-Tris