第15章 新型流式細胞儀應(yīng)用簡介

1、第十五章第十五章 流式細胞儀流式細胞儀 本章學習要求 概述概述 第一節(jié)第一節(jié) 流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的工作原理 第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu) 第三節(jié)第三節(jié) 流式細胞儀的性能指標流式細胞儀的性能指標 第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀的技術(shù)要求流式細胞儀的技術(shù)要求 第五節(jié)第五節(jié) 流式細胞儀的維護流式細胞儀的維護 第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用 本章內(nèi)容小結(jié)本章內(nèi)容小結(jié) 本章主要內(nèi)容概述概述 流式細胞儀的定義流式細胞儀的定義流式細胞術(shù)的定義流式細胞術(shù)的定義生物學顆粒的內(nèi)容生物學顆粒的內(nèi)容流式細胞儀的發(fā)展史流式細胞儀的發(fā)展史概述概述 流式細胞儀的定義流式細胞儀的定義:

2、 :流式細胞儀是以激流式細胞儀是以激光為光源，集流體力學技術(shù)、電子物光為光源，集流體力學技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體以及細胞熒光化學技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。技術(shù)為一體的新型高科技儀器。 概述概述 生物學顆粒包括大的免疫復合物、生物學顆粒包括大的免疫復合物、DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細胞器、細菌、霉菌、染色體、真核細胞、細胞器、細菌、霉菌、染色體、真核細胞、雜交細胞、聚集細胞等，所檢測的生物顆雜交細胞、聚集細胞等，所檢測的生物顆粒的理化性質(zhì)包括

3、細胞大小、細胞形態(tài)、粒的理化性質(zhì)包括細胞大小、細胞形態(tài)、胞漿顆?；潭?、胞漿顆?；潭取NADNA含量、總蛋白質(zhì)含量、含量、總蛋白質(zhì)含量、細胞膜完整性和酶活性等。細胞膜完整性和酶活性等。概述概述 流式細胞術(shù)的定義流式細胞術(shù)的定義: :應(yīng)用流式細胞儀對應(yīng)用流式細胞儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生處于快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行快速的、多參數(shù)的定量分物顆粒進行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細胞術(shù)。析和分選的技術(shù)稱為流式細胞術(shù)。 概述概述 1934 1934年：年：MoldavanMoldavan19671967年：年：Van Dilla Van Dilla 和和Los

4、 AlamosLos Alamos 1965 1965年：年：KamentskyKamentsky 1969 1969年：年：FulwylerFulwyler利用利用SweetSweet 80 80年代年代 90 90年代年代概述概述 1934 1934年年Moldavan Moldavan 使懸浮的血紅細使懸浮的血紅細胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通胞從一個毛細玻璃管中流過，每個通過的細胞可被一個光電裝置記錄下來，過的細胞可被一個光電裝置記錄下來，這可謂流式細胞儀的最初模型。這可謂流式細胞儀的最初模型。 概述概述 1965 1965年年KamentskyKamentsky用紫外吸收和可用紫外

5、吸收和可見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色的見光散射兩個參數(shù)同時測量未染色的細胞，給出了細胞中核酸的含量和細細胞，給出了細胞中核酸的含量和細胞大小，奠定了多參數(shù)流式細胞測量胞大小，奠定了多參數(shù)流式細胞測量的基礎(chǔ)。的基礎(chǔ)。概述概述 1967 1967年年Van Dilla Van Dilla 和和Los AlamosLos Alamos采用了采用了Crosland-TaylorCrosland-Taylor設(shè)計的層流流設(shè)計的層流流動室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、動室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測系統(tǒng)三者互相垂直的照明光軸，檢測系統(tǒng)三者互相垂直的流式細胞儀，成為目前各種流式細胞流式細胞

6、儀，成為目前各種流式細胞測量儀的基礎(chǔ)。測量儀的基礎(chǔ)。 概述概述 1969 1969年年FulwylerFulwyler利用利用SweetSweet的靜電的靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細胞分選術(shù)。細胞分選術(shù)。EhrlichEhrlich和和WheelessWheeless利用利用飛點掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨飛點掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細胞儀變成了低分辨率的流率的流式細胞儀變成了低分辨率的流式細胞儀。式細胞儀。 概述概述 80 80年代以來，流式細胞儀的數(shù)據(jù)年代以來，流式細胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲、顯示、分析日趨完善，采集、存儲、顯示、分析日趨完

7、善，隨著樣品制備方法的增多，新的熒光隨著樣品制備方法的增多，新的熒光染料和細胞標記物的出現(xiàn)，流式細胞染料和細胞標記物的出現(xiàn)，流式細胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴大。儀的應(yīng)用范圍逐漸擴大。 概述概述 進入進入9090年代，標本制備儀和自動年代，標本制備儀和自動進樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的進樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細胞儀不單克隆抗體的增加，使流式細胞儀不僅出現(xiàn)在大專院校和科研單位，它也僅出現(xiàn)在大專院校和科研單位，它也逐漸進入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科。逐漸進入醫(yī)院的中心實驗室和檢驗科。 第一節(jié)第一節(jié) 流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的工作原理 一、細胞分析原理一、細胞分析原理

8、二、細胞分選原理二、細胞分選原理第一節(jié)第一節(jié) 流式細胞儀的原理流式細胞儀的原理1.1.樣品進入流動室樣品進入流動室 將懸浮分散的單細將懸浮分散的單細胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細胞懸液形成樣品浮在樣品管中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，沿流垂直進入流式細胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動。流動室的軸心向下流動。第一節(jié)第一節(jié) 流式細胞儀的原理流式細胞儀的原理2.2.鞘液的作用鞘液的作用 流動室軸心至外壁的鞘流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞細胞懸液的液也

9、向下流動，形成包繞細胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴成一個圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。相交點稱為測量區(qū)。 第一節(jié)第一節(jié) 流式細胞儀的原理流式細胞儀的原理3.信號的產(chǎn)生與接收信號的產(chǎn)生與接收 染色的細胞在測染色的細胞在測量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被光電倍增生光散射。這些信號分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計算機儲管和光電二極管接收，經(jīng)過計算機儲存、計算、分析這些數(shù)字化信息，就存、計

10、算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細胞大小和核酸含量等指標?？傻玫郊毎笮『秃怂岷康戎笜恕５谝还?jié)第一節(jié) 流式細胞儀的原理流式細胞儀的原理 當某類細胞的特性與要分選的細當某類細胞的特性與要分選的細胞相同時，流式細胞儀就會在這類細胞相同時，流式細胞儀就會在這類細胞形成液滴時給含有這類細胞的液滴胞形成液滴時給含有這類細胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場時，依所帶電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，電荷的符號分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。落入指定的收集器內(nèi)。第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的

11、結(jié)構(gòu) 一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng) 二二、激光光源與光束激光光源與光束形成形成系統(tǒng)系統(tǒng) 三三、光學系統(tǒng)光學系統(tǒng) 四四、信號檢測與分析信號檢測與分析 五五、細胞分選器細胞分選器第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng)一、流動室與液流驅(qū)動系統(tǒng) 流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，個孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，流動室內(nèi)充滿了鞘液流動室內(nèi)充滿了鞘液, ,鞘液的作用是將樣品流環(huán)抱。鞘液的作用是將樣品流環(huán)抱。 樣品流在鞘流的環(huán)抱下形成聚焦，保證每個細胞樣品

12、流在鞘流的環(huán)抱下形成聚焦，保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。胞熒光信息。 第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu) 由右圖可知，空由右圖可知，空氣泵產(chǎn)生壓縮空氣，氣泵產(chǎn)生壓縮空氣，通過鞘流壓力調(diào)節(jié)器通過鞘流壓力調(diào)節(jié)器加在鞘液上一恒定的加在鞘液上一恒定的壓力，這樣鞘液以勻壓力，這樣鞘液以勻速運動流過流動室，速運動流過流動室，在整個系統(tǒng)運行中流在整個系統(tǒng)運行中流速是不變的。速是不變的。 第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu) 由于激光焦點處的由于激光焦點處的能量分布為正態(tài)分布（能量分布為正態(tài)分布（見右圖），中心

13、處能量見右圖），中心處能量最高。因此，當樣本速最高。因此，當樣本速率選擇高速時，處在樣率選擇高速時，處在樣本流不同位置的細胞或本流不同位置的細胞或顆粒，受激光照射的能顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發(fā)量不一樣，從而被激發(fā)出的熒光強度也不相同。出的熒光強度也不相同。 第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)二、激光光源與光束形成系統(tǒng)二、激光光源與光束形成系統(tǒng) 激光是一種相干光源，它能提供單波激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照。由于細胞長、高強度及穩(wěn)定性高的光照。由于細胞的快速流動，每個細胞經(jīng)過光照區(qū)的時間的快速流動，每個細胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為僅為1s1s左右

14、，且細胞所攜帶熒光物質(zhì)被左右，且細胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關(guān)，因此細胞必須達到和激發(fā)光的強度有關(guān)，因此細胞必須達到足夠的光照強度。足夠的光照強度。 第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)三、光學系統(tǒng)三、光學系統(tǒng) FCMFCM的光學系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光的光學系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成。片和小孔組成。濾光片主要分為：濾光片主要分為：1.1.長通濾光片長通濾光片 長通濾光片使特定波長以長通濾光片使特定波長以 上的光通過。上的光通過。2.2.短通濾光片短通濾光片 特定波長以下的光通過。特定波長以下的

15、光通過。3.3.帶通濾光片帶通濾光片 帶通濾光片允許一定波長帶通濾光片允許一定波長 范圍內(nèi)的光通過范圍內(nèi)的光通過第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)四、信號檢測與分析四、信號檢測與分析 當細胞攜帶熒光素標記物，通過激光當細胞攜帶熒光素標記物，通過激光照射區(qū)時，細胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長照射區(qū)時，細胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長的熒光信號。這些信號以細胞為中心，向的熒光信號。這些信號以細胞為中心，向空間空間360360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號。信號。第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)四、信號檢測與分析四、信號檢測與分析 1.1.散射光信號散

16、射光信號 散射光分為前向角散散射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細胞射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù)樣品的制備技術(shù)( (如染色如染色) )，稱為細胞的物，稱為細胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。（1 1）前向角散射）前向角散射 前向角散射與被測細前向角散射與被測細胞的大小有關(guān)胞的大小有關(guān)（2 2）側(cè)向角散射）側(cè)向角散射 側(cè)向散射光可提供細側(cè)向散射光可提供細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)四、信號檢測與分析四、信號檢測與分析 2.2.熒光信號熒光信號 當激光光束與細胞正交

17、當激光光束與細胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析能了解所研究細胞的性質(zhì)和數(shù)量。分析能了解所研究細胞的性質(zhì)和數(shù)量。第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)四、信號檢測與分析四、信號檢測與分析2.2.熒光信號熒光信號 （1 1）熒光信號線性測量和對數(shù)測量）熒

18、光信號線性測量和對數(shù)測量 線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細胞細胞DNADNA含量、含量、RNARNA含量、總蛋白質(zhì)含量等含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。對細胞膜的測量一般選用線性放大測量。對細胞膜表面抗原等參數(shù)進行熒光檢測時，通常使表面抗原等參數(shù)進行熒光檢測時，通常使用對數(shù)放大器。用對數(shù)放大器。第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)四、信號檢測與分析四、信號檢測與分析2.2.熒光信號熒光信號 （2 2）熒光信號的面積和寬度）熒光信號的面積和寬度熒光信號的面積是采用對熒光光通量進熒光信號的面積是采用對熒光光通量進 行積分測量，一般對行

19、積分測量，一般對DNADNA倍體測量時采用倍體測量時采用 面積，這是因為熒光脈沖的面積比熒光面積，這是因為熒光脈沖的面積比熒光 脈沖的高度更能準確反映脈沖的高度更能準確反映DNADNA的含量。的含量。熒光信號的寬度常用來區(qū)分雙連體細胞。熒光信號的寬度常用來區(qū)分雙連體細胞。第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)四、信號檢測與分析四、信號檢測與分析2.2.熒光信號熒光信號 （3 3）光譜重疊的校正）光譜重疊的校正 當細胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)當細胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)射兩種不同波長的熒光時，理論上可選擇射兩種不同波長的熒光時，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測，濾片使

20、每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu) 從右圖中可以看從右圖中可以看出，陰影為探測器檢出，陰影為探測器檢測光譜的范圍，測光譜的范圍，F(xiàn)ITCFITC探測器會探測到少量探測器會探測到少量的的PEPE光譜，而光譜，而PEPE探測探測器則檢測到較多的器則檢測到較多的FITCFITC光譜。光譜。 第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu) 圖中點圖中點A

21、A通過透鏡通過透鏡f f成像在成像在AA處，而點處，而點B B通通過透鏡過透鏡f f成像在成像在BB處。處。在光電倍增管前放上一在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號，排除其它雜散光信號，從而確保了從而確保了A A點光源進不點光源進不了了BB點處，點處，B B點光源也點光源也進不了進不了AA點處。點處。 第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)五五、細胞分選器細胞分選器1 1水滴的形成水滴的形成 壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。壓電晶體帶動流動室振動，液流形成水滴。噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。當噴嘴的振動頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)

22、目。當噴嘴直徑為噴嘴直徑為50m50m時，信號頻率為時，信號頻率為40kHz40kHz，則每，則每秒鐘產(chǎn)生秒鐘產(chǎn)生4 4萬個水滴。若每秒鐘流出的細胞是萬個水滴。若每秒鐘流出的細胞是10001000個，則平均每個，則平均每4040個水滴中只有一個水滴是個水滴中只有一個水滴是有細胞的，其他皆為空白。有細胞的，其他皆為空白。 第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)五五、細胞分選器細胞分選器2 2水滴的充電水滴的充電 為了分選細胞，需要細胞在經(jīng)過測量為了分選細胞，需要細胞在經(jīng)過測量區(qū)時判斷出哪個細胞滿足了分選的條件，區(qū)時判斷出哪個細胞滿足了分選的條件，并產(chǎn)生一個邏輯信號，此信號驅(qū)動充電脈并產(chǎn)生

23、一個邏輯信號，此信號驅(qū)動充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。第二節(jié)第二節(jié) 流式細胞儀的結(jié)構(gòu)流式細胞儀的結(jié)構(gòu)五五、細胞分選器細胞分選器3 3水滴的偏轉(zhuǎn)水滴的偏轉(zhuǎn) 當水滴從流束上將要斷開時給整個流當水滴從流束上將要斷開時給整個流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷對平行板電極形成的靜電場時，帶正電荷的水滴向帶負電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可的水滴向帶負電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可用容器收集水滴。用容器收集水滴。 第三節(jié)第三節(jié) 流式細胞儀的性

24、能指標流式細胞儀的性能指標 一、靈敏度一、靈敏度 二、分辨率二、分辨率 三、分析速度三、分析速度 四、分選指標四、分選指標第三節(jié)第三節(jié) 流式細胞儀的性能指標流式細胞儀的性能指標一、靈敏度一、靈敏度 靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱信號的重要指標。一般以能檢測到單個信號的重要指標。一般以能檢測到單個微球上最少標有微球上最少標有FITCFITC或或PEPE熒光分子數(shù)目熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的來表示，現(xiàn)在的FCMFCM均可達到檢測小于均可達到檢測小于100100個熒光分子的指標。個熒光分子的指標。第三節(jié)第三節(jié) 流式細胞儀的性能指標流式細胞儀的性能指標一、靈敏度一、靈敏度

25、 前向角散射光檢測靈敏度是指能夠前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品檢測到的最小顆粒大小，一般目前商品化的化的FCMFCM可以測量到可以測量到0.20.20.50.5左右。左右。 第三節(jié)第三節(jié) 流式細胞儀的性能指標流式細胞儀的性能指標二、儀器的分辨率二、儀器的分辨率 分辨率是衡量儀器測量精度的指標，分辨率是衡量儀器測量精度的指標，通常用變異系數(shù)通常用變異系數(shù)CV(Coefficient of CV(Coefficient of Variation)Variation)值表示：值表示：(是分布的標準誤差，是分布的標準誤差，是分布的平均值是分布的平均值) )%100CV

26、 第三節(jié)第三節(jié) 流式細胞儀的性能指標流式細胞儀的性能指標三、三、FCMFCM分析速度分析速度 分析速度以每秒分析的細胞數(shù)來表示。分析速度以每秒分析的細胞數(shù)來表示。當細胞流過光束的速度超過當細胞流過光束的速度超過FCMFCM儀器響應(yīng)速儀器響應(yīng)速度時，細胞產(chǎn)生的熒光信號就會丟失，這度時，細胞產(chǎn)生的熒光信號就會丟失，這段時間稱為儀器的死時間。段時間稱為儀器的死時間。 死時間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一死時間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達到般可達到3000300060006000個個/ /秒左右。大型機已秒左右。大型機已達到每秒幾萬個細胞。達到每秒幾萬個細胞。 第三節(jié)第三節(jié) 流式細胞儀的性能指標流式細

27、胞儀的性能指標四、四、FCMFCM分選指標分選指標 分選指標主要包括分選速度、分選純分選指標主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。度和分選收獲率。 分選速度指每秒可提取所要細胞的個數(shù)。分選速度指每秒可提取所要細胞的個數(shù)。 分選純度指要分選的目的細胞占分選出分選純度指要分選的目的細胞占分選出 細胞的百分比。細胞的百分比。 分選收獲率指被分出的細胞與原來溶液分選收獲率指被分出的細胞與原來溶液 中該細胞的百分比。中該細胞的百分比。 第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀的技術(shù)要求流式細胞儀的技術(shù)要求 流式細胞分析儀器是一項集多學科流式細胞分析儀器是一項集多學科知識綜合應(yīng)用的復雜儀器，除了對儀器知識綜合應(yīng)用的復雜

28、儀器，除了對儀器各方面性能指標有嚴格的要求以外，在各方面性能指標有嚴格的要求以外，在實驗設(shè)計與樣品處理方面也需要有豐富實驗設(shè)計與樣品處理方面也需要有豐富的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗。的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗。 一、檢測樣品制備的重要性一、檢測樣品制備的重要性 二、常用的熒光染料與標記染色二、常用的熒光染料與標記染色 三、三、FCMFCM操作技術(shù)的質(zhì)量控制操作技術(shù)的質(zhì)量控制 第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀的技術(shù)要求流式細胞儀的技術(shù)要求 一、檢測樣品制備的重要性一、檢測樣品制備的重要性 因為流式細胞儀測量的是每個細胞因為流式細胞儀測量的是每個細胞所產(chǎn)生的散射光和熒光信號，如果兩個所產(chǎn)生的散射光和熒光信號，如果兩個或

29、多個細胞間粘連重疊或細胞碎片過多，或多個細胞間粘連重疊或細胞碎片過多，都會影響信號的收集及所收集信號的真都會影響信號的收集及所收集信號的真實性，所以制備單細胞懸液是進行流式實性，所以制備單細胞懸液是進行流式細胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。細胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。 第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀的技術(shù)要求流式細胞儀的技術(shù)要求 二、常用的熒光染料與標記染色二、常用的熒光染料與標記染色 散射光信號是激光照在細胞上所產(chǎn)生散射光信號是激光照在細胞上所產(chǎn)生的前向光和側(cè)向光信號。熒光信號來自于的前向光和側(cè)向光信號。熒光信號來自于細胞的自發(fā)熒光或被分析細胞經(jīng)特異性熒細胞的自發(fā)熒光或被分析細胞經(jīng)特異性熒光標記染色后通過激

30、光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。光標記染色后通過激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。因此，被分析細胞在制備成單細胞懸液后，因此，被分析細胞在制備成單細胞懸液后，經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機進行檢測。經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機進行檢測。 第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀的技術(shù)要求流式細胞儀的技術(shù)要求 三、流式細胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制三、流式細胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制 在臨床檢測中，應(yīng)對各個工作環(huán)節(jié)和在臨床檢測中，應(yīng)對各個工作環(huán)節(jié)和儀器性能進行嚴格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操儀器性能進行嚴格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操作，以保證各項檢測數(shù)據(jù)和指標的可靠性。作，以保證各項檢測數(shù)據(jù)和指標的可靠性。 1 1光路與流路校正光路與流路校正 2 2PMTPM

31、T校準校準 3 3絕對計數(shù)的校準絕對計數(shù)的校準第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀的技術(shù)要求流式細胞儀的技術(shù)要求 1 1光路與流路校正光路與流路校正 主要目的在于確保激光光路與樣品流主要目的在于確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，使儀器檢測時的變異減少處于正交狀態(tài)，使儀器檢測時的變異減少到最小，從而控制儀器的到最小，從而控制儀器的CVCV值。在流路校值。在流路校正物中，有標準大小的熒光微球，其物理正物中，有標準大小的熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學特性和化學特性均經(jīng)過標定。性質(zhì)、生物學特性和化學特性均經(jīng)過標定。 第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀的技術(shù)要求流式細胞儀的技術(shù)要求 2 2光電信增管（光電信增管（PMTPMT）

32、校準）校準 流式細胞儀在使用過程中，光電倍流式細胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時間的增加，其放大功率會有所增管隨時間的增加，其放大功率會有所改變，對樣品檢測的靈敏度會產(chǎn)生影響。改變，對樣品檢測的靈敏度會產(chǎn)生影響。為保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀為保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進行態(tài)，采用質(zhì)控品進行PMTPMT校準，必要時校準，必要時進行電壓補償。進行電壓補償。 第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀的技術(shù)要求流式細胞儀的技術(shù)要求 3 3絕對計數(shù)的校準絕對計數(shù)的校準 為保證儀器在計數(shù)時的準確性，儀為保證儀器在計數(shù)時的準確性，儀器應(yīng)采用絕對計數(shù)標準品建立絕對計數(shù)器應(yīng)采用絕對計數(shù)標準品建立絕對計

33、數(shù)標準。該標準品是經(jīng)標定的，如以計算標準。該標準品是經(jīng)標定的，如以計算10001000個細胞為個細胞為1ml1ml，作為設(shè)定標準。，作為設(shè)定標準。在樣本測定時，以此為標準進行絕對計在樣本測定時，以此為標準進行絕對計數(shù)，從而獲得絕對計數(shù)的標準值。數(shù)，從而獲得絕對計數(shù)的標準值。第五節(jié)第五節(jié) 流式細胞儀的維護流式細胞儀的維護 一、儀器的維護一、儀器的維護1.1.激光電源的波動范圍應(yīng)小于激光電源的波動范圍應(yīng)小于10%10%。2.2.冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。3.3.室溫在室溫在18182424，相對濕度小于，相對濕度小于85%85%。4.4.安裝單獨的可靠

34、的地線。安裝單獨的可靠的地線。5.5.儀器操作必須有經(jīng)過培訓的人員操作。儀器操作必須有經(jīng)過培訓的人員操作。6.6.樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。 第五節(jié)第五節(jié) 流式細胞儀的維護流式細胞儀的維護 故障信息故障信息 引起故障的原因引起故障的原因 解決方法解決方法 清洗液高度錯誤清洗液高度錯誤 清洗液少了清洗液少了 加清洗液加清洗液 清洗液高度警示清洗液高度警示 清洗液傳感器失清洗液傳感器失靈靈 與公司聯(lián)系與公司聯(lián)系 數(shù)據(jù)處理速率錯數(shù)據(jù)處理速率錯誤誤 數(shù)據(jù)太大，難以數(shù)據(jù)太大，難以處理處理 稀釋樣品稀釋樣品 文件名錯誤文件名錯誤 輸入的文件名與輸入的文件名與系

35、統(tǒng)沖突系統(tǒng)沖突 輸入另一個文件輸入另一個文件名名 二、常見故障及排除二、常見故障及排除第五節(jié)第五節(jié) 流式細胞儀的維護流式細胞儀的維護 故障信息故障信息 引起故障的原因引起故障的原因 解決方法解決方法 存取數(shù)據(jù)時發(fā)生存取數(shù)據(jù)時發(fā)生錯誤錯誤 流式細胞儀不能流式細胞儀不能存取數(shù)據(jù)存取數(shù)據(jù) 關(guān)開計算機重試關(guān)開計算機重試 程序錯誤程序錯誤 軟件不能執(zhí)行該軟件不能執(zhí)行該程序程序 選擇主菜單上的選擇主菜單上的重建項重建項 程序號太大程序號太大 程序號不能大于程序號不能大于32 32 取消一些程序，取消一些程序，再輸入相應(yīng)號碼再輸入相應(yīng)號碼 沒有激光束沒有激光束 激光器關(guān)閉激光器關(guān)閉 檢查電源，開激檢查電源，

36、開激光器光器 二、常見故障及排除二、常見故障及排除 第五節(jié)第五節(jié) 流式細胞儀的維護流式細胞儀的維護 故障信息故障信息 引起故障的原因引起故障的原因 解決方法解決方法 激光器開啟錯誤激光器開啟錯誤 激光器門打開激光器門打開 關(guān)激光器門關(guān)激光器門 參數(shù)太多參數(shù)太多 選擇的參數(shù)應(yīng)小選擇的參數(shù)應(yīng)小于于8個個 取消某些參數(shù)，取消某些參數(shù)，重新選擇重新選擇 參數(shù)不存在參數(shù)不存在 程序中無此參數(shù)程序中無此參數(shù) 重新建立程序重新建立程序 二、常見故障及排除二、常見故障及排除第五節(jié)第五節(jié) 流式細胞儀的維護流式細胞儀的維護 故障信息故障信息 引起故障的原因引起故障的原因 解決方法解決方法 樣品壓力錯誤樣品壓力錯誤

37、 因為樣品管壞了，因為樣品管壞了，樣品不能被壓入樣品不能被壓入流動室流動室 換一個樣品管換一個樣品管 建立樣品壓力錯建立樣品壓力錯誤誤 流式細胞儀連接流式細胞儀連接錯誤錯誤 檢查連接，開關(guān)檢查連接，開關(guān)機重試機重試 鞘液高度錯誤鞘液高度錯誤 鞘液太少鞘液太少 補充鞘液補充鞘液 二、常見故障及排除二、常見故障及排除第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用 六、六、FCMFCM對自身免疫性疾病對自身免疫性疾病HLAHLA抗原的分析抗原的分析 二、流式細胞儀在血液學中的應(yīng)用二、流式細胞儀在血液學中的應(yīng)用 三、流式細胞儀在細胞生物學中的應(yīng)用三、流式細胞儀在細胞生物學中的應(yīng)用 四、流式細胞儀在腫瘤

38、學中的應(yīng)用四、流式細胞儀在腫瘤學中的應(yīng)用 五、流式細胞儀在五、流式細胞儀在AIDSAIDS病檢測中的分析病檢測中的分析 七、流式細胞儀在藥物學方面的應(yīng)用七、流式細胞儀在藥物學方面的應(yīng)用 一、流式細胞儀在免疫學中的應(yīng)用一、流式細胞儀在免疫學中的應(yīng)用第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用一、流式細胞儀在免疫學中的應(yīng)用一、流式細胞儀在免疫學中的應(yīng)用 流式細胞術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫理論研流式細胞術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫理論研究及其臨床實踐，所以有人稱之為現(xiàn)代免究及其臨床實踐，所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體的結(jié)疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體的結(jié)合應(yīng)用，在淋巴細胞及其亞群分析、淋巴合

39、應(yīng)用，在淋巴細胞及其亞群分析、淋巴細胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細細胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫檢測、研究細胞周期等方面都起胞的免疫檢測、研究細胞周期等方面都起著相當重要的作用。著相當重要的作用。第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用二、流式細胞儀在血液學中的應(yīng)用二、流式細胞儀在血液學中的應(yīng)用 血液病多為腫瘤性、免疫性和遺傳性血液病多為腫瘤性、免疫性和遺傳性疾病，惡性血液病約占其總數(shù)一半以上。疾病，惡性血液病約占其總數(shù)一半以上。FCMFCM在血液細胞的分類、分型，造血細胞在血液細胞的分類、分型，造血細胞分化的研究，血細胞中各種酶的定量分析，分化的研究，血細胞中各種酶的

40、定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應(yīng)用如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應(yīng)用廣泛。廣泛。 第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用三、流式細胞儀在細胞生物學中的應(yīng)用三、流式細胞儀在細胞生物學中的應(yīng)用 細胞生物學研究中，應(yīng)用最頻繁也最細胞生物學研究中，應(yīng)用最頻繁也最普通的是細胞周期分析，研究細胞周期或普通的是細胞周期分析，研究細胞周期或DNADNA倍體與細胞表面受體及抗原表達的關(guān)系，倍體與細胞表面受體及抗原表達的關(guān)系，包括細胞周期各時相的百分比和細胞周期包括細胞周期各時相的百分比和細胞周期動力學參數(shù)的測定等內(nèi)容。對同一細胞的動力學參數(shù)的測定等內(nèi)容。對同一細胞的參數(shù)測定技術(shù)則導致了對細

41、胞周期的一些參數(shù)測定技術(shù)則導致了對細胞周期的一些新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。 第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用四、流式細胞儀在腫瘤學中的應(yīng)用四、流式細胞儀在腫瘤學中的應(yīng)用 近年來熒光細胞化學技術(shù)的發(fā)展，以近年來熒光細胞化學技術(shù)的發(fā)展，以及熒光探針標記的單克隆抗體，為流式細及熒光探針標記的單克隆抗體，為流式細胞技術(shù)研究各種腫瘤抗原、腫瘤蛋白、致胞技術(shù)研究各種腫瘤抗原、腫瘤蛋白、致癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤學的研究水平，并為流式細胞技術(shù)在腫瘤學的研究水平，并為流式細胞技術(shù)在腫瘤學的研究中開辟

42、了更廣闊的應(yīng)用前景。學的研究中開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。 第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用五、流式細胞儀在五、流式細胞儀在AIDSAIDS病檢測中的分析病檢測中的分析 流式細胞術(shù)用于流式細胞術(shù)用于AIDSAIDS免疫功能的檢測免疫功能的檢測是最重要的檢測手段，采用三參數(shù)熒光標是最重要的檢測手段，采用三參數(shù)熒光標記計數(shù)可對記計數(shù)可對T T淋巴細胞及亞群進行分析，淋巴細胞及亞群進行分析，并通過動態(tài)監(jiān)測并通過動態(tài)監(jiān)測T T細胞亞群可以對細胞亞群可以對HIVHIV感染感染者或者或AIDSAIDS發(fā)病者進行區(qū)別。發(fā)病者進行區(qū)別。 第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用六、六、FCMF

43、CM對自身免疫性疾病對自身免疫性疾病HLAHLA抗原的分析抗原的分析 利用利用FCMFCM可以進行可以進行HLA-B27HLA-B27HLA-B7HLA-B7雙標記抗體檢測雙標記抗體檢測HLA-B27HLA-B27陽性細胞，同時陽性細胞，同時又可排出交叉反應(yīng)。通常又可排出交叉反應(yīng)。通常58589797的的強直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而強直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而正常人僅正常人僅2 27 7可檢出這種抗原?？蓹z出這種抗原。FCMFCM檢測檢測HLA-B27HLA-B27快速、特異、敏感，為強直快速、特異、敏感，為強直性脊柱炎的臨床診斷提供了有力的幫助。性脊柱炎的臨床診斷提供了有力的幫助

44、。第六節(jié)第六節(jié) 流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的應(yīng)用七、流式細胞儀在藥物學方面的應(yīng)用七、流式細胞儀在藥物學方面的應(yīng)用 流式細胞儀在檢測藥物在細胞中的分流式細胞儀在檢測藥物在細胞中的分布，研究藥物的作用機制方面應(yīng)用廣泛。布，研究藥物的作用機制方面應(yīng)用廣泛。亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤細亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤細胞的凋亡機制，可通過測胞的凋亡機制，可通過測DNADNA凋亡峰，凋亡峰，Bcl-2Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等進行觀察。凋亡調(diào)節(jié)蛋白等進行觀察。 本章小結(jié)本章小結(jié) 本章簡要介紹了流式細胞術(shù)和流式本章簡要介紹了流式細胞術(shù)和流式細胞儀的基本概念。細胞儀的基本概念。 論述了流式細胞儀的基本原理、論述了流式細胞儀的基本原理、流式細胞儀的分類