第七章病毒(下)

1、第七章第七章 病毒（下）病毒（下）病毒的復(fù)制v病毒是活細(xì)胞內(nèi)寄生物，只能在活細(xì)胞內(nèi)繁殖。v為完成其“繁殖”周期，必須吸附和進(jìn)入細(xì)胞。v這個(gè)周期高度依賴于宿主細(xì)胞的代謝機(jī)制，在很多情況下，病毒接管并協(xié)調(diào)宿主細(xì)胞的代謝機(jī)制，使之適合自己的復(fù)制，通常抑制宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與核酸合成系統(tǒng)。v其結(jié)果是產(chǎn)生成百個(gè)子代病毒粒子，通過細(xì)胞裂解或出芽，將細(xì)胞殺死，并擴(kuò)散去感染更多的細(xì)胞或組織。I 病毒復(fù)制的一般過程病毒復(fù)制的一般過程侵入吸附侵入脫殼成熟裝配成熟離開復(fù)制基因組復(fù)制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯）1： 吸附吸附（Attachment)Attachment) 吸附： 是通過病毒與細(xì)胞質(zhì)膜上的受體發(fā)生特異性的作用而

2、完成的。細(xì)胞受體決定了病毒的細(xì)胞趨向性和種類趨向性。單純皰疹病毒（HSV）至少通過兩個(gè)包膜糖蛋白與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖及6-磷酸甘露糖受體結(jié)合；HIV通過它主要的包膜蛋白（gp120）吸附于T細(xì)胞表面的CD4分子；流感病毒有較廣的宿主范圍和組織噬性，其血凝素能與各種細(xì)胞上的唾液酸分子結(jié)合，引起病毒在動(dòng)物或人群間傳播。l 病毒與細(xì)胞相互作用的第一步；l 病毒吸附蛋白吸附蛋白與細(xì)胞受體受體分子特異性地結(jié)合；l 過程：病毒粒子作隨機(jī)的布朗運(yùn)動(dòng)遭遇敏感細(xì)胞表面的受體分子吸附蛋白與受體發(fā)生特異性結(jié)合l 由于布朗運(yùn)動(dòng)與溫度無關(guān)，吸附在低溫下也能進(jìn)行。病毒病毒吸附蛋白吸附蛋白 ( viral Attachm

3、ent protein,VAP) 能夠特異性地識別細(xì)胞受體并與之結(jié)合的毒粒表面的結(jié)構(gòu)蛋白分子，也稱反受體。腺病毒的吸附蛋白：頂端突起T4噬菌體的吸附蛋白：尾絲流感病毒血凝素神經(jīng)氨酸酶基質(zhì)蛋白M1核糖核蛋白包膜四個(gè)主要四個(gè)主要的抗原性的抗原性變化區(qū)域變化區(qū)域受體結(jié)合位點(diǎn)受體結(jié)合位點(diǎn)雙層脂膜構(gòu)雙層脂膜構(gòu)成的包膜成的包膜血凝素細(xì)胞受體細(xì)胞受體(Receptor)指細(xì)胞表面與病毒吸附蛋白相互作用的分子。噬菌體的受體：噬菌體的受體：l細(xì)菌表面脂多糖的糖基側(cè)鏈，如沙門氏菌O抗原；l噬菌體多吸附于細(xì)胞壁，有時(shí)也在纖毛和鞭毛上；植物病毒的受體：植物病毒的受體：l植物外部的蠟質(zhì)和細(xì)胞壁，給病毒感染和病毒擴(kuò)散造成

4、困難。l病毒感染的方式有所不同： 通過傷口感染，或刺吸式口器昆蟲取食時(shí)侵入，通過胞間連絲傳遍整個(gè)植株。動(dòng)物病毒的受體：動(dòng)物病毒的受體：細(xì)胞膜表面分子；通常都有自身的功能，盡管有些還不清楚；細(xì)胞受體的類型細(xì)胞受體的類型l 蛋白質(zhì)類受體 最常見 特異性強(qiáng)l 碳水化合物類受體l 糖脂類受體細(xì)胞表面2：侵入：侵入l病毒吸附到目標(biāo)細(xì)胞膜上受體后，通常很快地侵入細(xì)胞內(nèi).l與吸附不同，侵入細(xì)胞通常是一個(gè)需要能量的過程，即只有在代謝活躍的細(xì)胞中才會發(fā)生病毒侵入.l因此，低溫下可以發(fā)生吸附，但不會發(fā)生侵入.v病毒吸附在細(xì)胞表面后，引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)化作用而使病毒穿入。v有包膜病毒的包膜與細(xì)胞膜融合使核衣殼進(jìn)入胞質(zhì)，或

5、由細(xì)胞的吞飲作用，形成吞飲體而入胞。v無包膜病毒與細(xì)胞結(jié)合后，引發(fā)衣殼的變構(gòu)使核酸直接通過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)，或以吞飲體方式入胞。 帶有可收縮尾部的噬菌體：帶有可收縮尾部的噬菌體：尾部收縮，將核酸注射入細(xì)胞內(nèi)。尾部收縮，將核酸注射入細(xì)胞內(nèi)。舉例：舉例：T T偶數(shù)噬菌體尾部可收縮，伸長時(shí)偶數(shù)噬菌體尾部可收縮，伸長時(shí)有有2424個(gè)環(huán)；個(gè)環(huán)；吸附后，尾部收縮，亞基匯合，形吸附后，尾部收縮，亞基匯合，形成成1212個(gè)環(huán)；個(gè)環(huán)；尾部的核心不可收縮，被推著穿過尾部的核心不可收縮，被推著穿過細(xì)胞膜；細(xì)胞膜；頭部也收縮，將頭部也收縮，將DNADNA壓出；壓出；噬菌體尾部帶有溶菌酶，可溶解細(xì)噬菌體尾部帶有溶菌酶，可

6、溶解細(xì)胞壁；胞壁；病毒鞘上還有多個(gè)病毒鞘上還有多個(gè)ATPATP分子，提供分子，提供能量；能量；噬菌體的侵入噬菌體的侵入噬噬菌菌體體感感染染時(shí)，時(shí)，只只有有核核酸酸進(jìn)進(jìn)入入細(xì)細(xì)胞胞T4噬菌體感染，核酸被注射入細(xì)菌噬菌體感染，核酸被注射入細(xì)菌動(dòng)物病毒的侵入有三種主要的機(jī)制：動(dòng)物病毒的侵入有三種主要的機(jī)制：i. 轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位ii.融合融合iii.吞飲吞飲細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜受體i. i. 轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位l整個(gè)病毒粒子跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)位l無包膜病毒l受體介導(dǎo)l了解最少ii. 膜融合膜融合l 病毒包膜與細(xì)胞膜融合，使病毒進(jìn)入細(xì)胞l 融合部位：細(xì)胞表面融合內(nèi)吞作用后在囊泡中進(jìn)行的融合l 除了病毒吸附蛋白外，還需特定的融合蛋白病毒帶

7、有專門的融合蛋白吸附蛋白同時(shí)具有促進(jìn)融合的功能融合蛋白：流感病毒的血凝素；HIV gp41l 融合方式：pH依賴性的：需要有酸性的環(huán)境非pH依賴性的：不需特殊pH，與受體結(jié)合后直接誘導(dǎo)融合l病毒吸附蛋白與受體分子結(jié)合，使膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，刺激吞飲發(fā)生；l細(xì)胞將病毒吞入細(xì)胞囊泡內(nèi)；l可能是病毒侵入細(xì)胞的最常見的機(jī)制；l吞入的病毒仍然在囊泡內(nèi)，尚不能開始復(fù)制，需要通過轉(zhuǎn)位或膜融合才能真正進(jìn)入細(xì)胞。 iii. 吞飲吞飲3：脫殼：脫殼l 脫殼：病毒衣殼被完全或部分地脫去病毒基因組以核蛋白的形式暴露出來l 過程細(xì)節(jié)知道很少l 脫殼方式受體介導(dǎo)脫殼在內(nèi)小體中脫殼細(xì)胞質(zhì)中脫殼進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)脫殼不完全脫殼 病毒

8、與受體結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象變化，引起脫殼 舉例：細(xì)小RNA病毒的脫殼i.i.受體介導(dǎo)的脫殼受體介導(dǎo)的脫殼 吞飲進(jìn)入細(xì)胞的病毒首先存在于內(nèi)小體(endosome)中，脫殼可在其中進(jìn)行。 內(nèi)小體內(nèi)酸化，pH降低，誘導(dǎo)病毒衣殼構(gòu)象變化，解體，釋放基因組ii. ii. 在內(nèi)小體中脫殼在內(nèi)小體中脫殼l病毒顆粒在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后構(gòu)象發(fā)生變化，釋放基因組核酸。iii.iii.在細(xì)胞質(zhì)中脫殼在細(xì)胞質(zhì)中脫殼Semliki Forest Virus 在細(xì)胞質(zhì)中脫殼iv. iv. 進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)脫殼進(jìn)入細(xì)胞核時(shí)脫殼l侵入后衣殼結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但總體仍然保持完整。基因組仍然留在衣殼中；l病毒吸附到細(xì)胞骨架上，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核；l在核

9、孔處進(jìn)行脫殼，核蛋白穿過核孔，進(jìn)入細(xì)胞核；l舉例：腺病毒腺病毒的侵入和脫殼l 有些病毒需要在病毒粒子中進(jìn)行復(fù)制，脫殼不完全。如：呼腸孤病毒：（雙鏈RNA病毒）病毒帶有專一性多聚酶（以雙鏈RNA為模板合成單鏈RNA），轉(zhuǎn)錄就在不完全脫殼的病毒顆粒中進(jìn)行痘病毒：（雙鏈DNA病毒）細(xì)胞中與DNA復(fù)制有關(guān)的酶在細(xì)胞核中，但該病毒在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制不完全脫殼的病毒顆粒帶有多種酶，在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行病毒基因的轉(zhuǎn)錄和病毒DNA復(fù)制反轉(zhuǎn)錄病毒：侵入后，在病毒核心顆粒中利用所帶反轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生DNA呼腸孤病毒侵入與脫殼4：生物合成：生物合成 病毒大分子的生物合成： 病毒基因組各不相同，其復(fù)制形式亦有多種。病毒

10、基因組的轉(zhuǎn)錄是分期進(jìn)行的。 發(fā)生在病毒核酸復(fù)制以前的轉(zhuǎn)錄為早期轉(zhuǎn)錄。 在病毒核酸復(fù)制開始或復(fù)制后所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄為晚期轉(zhuǎn)錄，晚期基因編碼的晚期蛋白主要是構(gòu)成子代毒粒所需的結(jié)構(gòu)蛋白。 如雙鏈DNA噬菌體的增殖過程。雙鏈?zhǔn)删w通過三階段轉(zhuǎn)錄的增殖過程雙鏈?zhǔn)删w通過三階段轉(zhuǎn)錄的增殖過程mRNAI.dsDNAIIa.(-)ssDNAIIb.(+)ss DNAVI.ssRNAIV.(+)ssRNAV. (-)ssRNAIII.dsRNAVII.ds/ssDNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)l 復(fù)制位置：多在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行（利用核內(nèi)的酶系） 除了痘病毒l 復(fù)制分階段 后一階段依賴于前一階段的完成 表達(dá)水平逐級放大mRNA極早期極

11、早期調(diào)控蛋白、酶子代DNAmRNA早期早期(酶、調(diào)控、結(jié)構(gòu)蛋白)mRNA晚期晚期結(jié)構(gòu)蛋白mRNA病毒蛋白(酶、調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)蛋白)子代ssDNA子代病毒dsDNA細(xì)胞蛋白細(xì)胞蛋白l復(fù)制位置：細(xì)胞核中復(fù)制l高度依賴細(xì)胞因子l形成dsDNA中間體l復(fù)制階段不明顯病毒蛋白(酶、調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)蛋白)子代dsRNA+ssRNA(mRNA)初級初級轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄-病毒酶次級次級轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄ssRNA-病毒酶l復(fù)制位置：細(xì)胞質(zhì)l病毒粒子帶有依賴dsRNA的RNA多聚酶酶l病毒不完全脫殼，初級轉(zhuǎn)錄在其中進(jìn)行l(wèi)ssRNA(mRNA)與病毒蛋白形成新的病毒顆粒l在新的病毒顆粒中再形成子代dsRNACapAAAACapAAAA復(fù)制酶

12、復(fù)制酶CapAAAACapAAAA結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白l 基因組本身就可作為mRNAl 復(fù)制位置：細(xì)胞質(zhì)l 兩類復(fù)制方式： 合成一個(gè)多聚蛋白，再切割為成熟蛋白，行使功能 分兩步轉(zhuǎn)錄，先合成復(fù)制酶，再由該酶合成亞基因組片段，合成其它蛋白-ssRNA多聚蛋白+ssRNA初級表達(dá)產(chǎn)物病毒蛋白(酶、調(diào)節(jié)、與結(jié)構(gòu)蛋白)蛋白酶蛋白酶亞基因組mRNA次級表達(dá)產(chǎn)物ABl 復(fù)制位置：細(xì)胞質(zhì)l 首先依賴病毒粒子中攜帶的酶轉(zhuǎn)錄形成mRNAl 分兩類： 分段基因組：每個(gè)片段分別轉(zhuǎn)錄成mRNA，合成蛋白，并作為模板合成子代基因組(-)(+)病毒蛋白病毒蛋白(-)(+)病毒蛋白病毒蛋白 不分段基因組：由病毒的轉(zhuǎn)錄酶合成單個(gè)基

13、因的mRNA病毒蛋白(酶、調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)蛋白)子代-ssRNA 病毒酶mRNA蛋白mRNA雙義編碼雙義編碼l復(fù)制位置：細(xì)胞核l雖是正鏈RNA，但不作為mRNA，而是先反轉(zhuǎn)錄形成dsDNA原病毒l病毒帶有反轉(zhuǎn)錄酶，在不完全脫殼的病毒顆粒中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄l原病毒DNA整合到染色體，與染色體一起復(fù)制、轉(zhuǎn)錄l轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物既是mRNA，又是子代基因組病毒蛋白(酶、調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)蛋白)mRNAdsDNA原病毒反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)錄錄-病毒反轉(zhuǎn)錄酶l復(fù)制位置：細(xì)胞核l復(fù)制過程類似雙鏈DNA病毒l子代基因組不是直接由DNA復(fù)制而來，而由mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而來病毒蛋白(酶、調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)蛋白)mRNAdsDNA閉環(huán)修補(bǔ)修補(bǔ)dsDNA(帶缺口)反

14、轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄5：裝配與釋放：裝配與釋放l裝配與釋放：病毒的裝配部位取決于基因組的復(fù)制部位和有無包膜。除痘病毒外，DNA病毒的核衣殼都在細(xì)胞核內(nèi)裝配，通過核膜或細(xì)胞膜獲得包膜，痘類病毒和RNA病毒的核衣殼在胞質(zhì)內(nèi)裝配，但流感病毒在核內(nèi)裝配。l包膜裝配發(fā)生在細(xì)胞膜上，并以芽生方式釋放病毒。無包膜病毒在細(xì)胞質(zhì)中裝配后溶解細(xì)胞釋放病毒。吸附吸附侵入侵入宿主細(xì)胞功能宿主細(xì)胞功能裝配裝配(成熟成熟)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄基因組復(fù)制基因組復(fù)制釋放釋放脫殼脫殼轉(zhuǎn)譯轉(zhuǎn)譯I I 病毒的一步生長曲線病毒的一步生長曲線l通過組織培養(yǎng)的細(xì)胞可以分析這個(gè)復(fù)制周期的過程，一般稱這個(gè)過程為一步生長周期，此周期是由一系列的步驟組成的，包括吸附

15、和進(jìn)入、核酸合成和轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、成熟、裝配和釋放。l在病毒感染細(xì)胞后的不同時(shí)間，測定感染性病毒，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒的數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制獲得一步生長曲線。一步生長曲線一步生長曲線1.1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)：1 1個(gè)菌體被個(gè)菌體被1 1個(gè)噬菌體感染個(gè)噬菌體感染, ,避免二避免二次吸附；細(xì)菌群體被噬菌體同步感染。次吸附；細(xì)菌群體被噬菌體同步感染。2.2. 實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程: : 敏感菌敏感菌10ml Phage 1ml 混勻，混勻，5min,使之吸附使之吸附 離心或用抗離心或用抗phage血清處理血清處理, 去除過量去除過量phage 高倍稀釋高倍稀釋,吸附吸附phage的菌懸液的菌

16、懸液(避免多次吸附避免多次吸附) 37培養(yǎng)培養(yǎng),定時(shí)取樣定時(shí)取樣 取樣人為裂解處理（每取樣人為裂解處理（每5min） 樣品中加入氯仿裂解細(xì)胞樣品中加入氯仿裂解細(xì)胞 24-48h 裂解液加入敏感菌液中裂解液加入敏感菌液中 適當(dāng)稀釋混合液適當(dāng)稀釋混合液 涂布于瓊脂培養(yǎng)基上涂布于瓊脂培養(yǎng)基上 計(jì)數(shù)噬菌斑計(jì)數(shù)噬菌斑噬菌斑噬菌斑: :概念：概念：將少量噬菌體與大量敏將少量噬菌體與大量敏感菌混合培養(yǎng)在營養(yǎng)瓊脂中，感菌混合培養(yǎng)在營養(yǎng)瓊脂中，在平板表面布滿宿主細(xì)胞的在平板表面布滿宿主細(xì)胞的菌苔上菌苔上, ,可以用肉眼看到一可以用肉眼看到一個(gè)個(gè)透明的不長菌的小圓斑，個(gè)個(gè)透明的不長菌的小圓斑，稱為噬菌斑。稱為噬菌

17、斑。( (每個(gè)噬菌斑每個(gè)噬菌斑一般是由一個(gè)噬菌體粒子形一般是由一個(gè)噬菌體粒子形成的。成的。) ) 應(yīng)用應(yīng)用: : 噬菌斑可用于檢出、噬菌斑可用于檢出、分離、純化噬菌體和進(jìn)行噬分離、純化噬菌體和進(jìn)行噬菌體的計(jì)數(shù)。菌體的計(jì)數(shù)。噬菌斑噬菌斑病毒的一步生長曲線病毒的一步生長曲線成熟的噬菌體粒子，除成熟的噬菌體粒子，除M13等少數(shù)噬菌體外，均等少數(shù)噬菌體外，均借宿主細(xì)胞裂解而釋放。細(xì)菌的裂解導(dǎo)致一種肉眼可借宿主細(xì)胞裂解而釋放。細(xì)菌的裂解導(dǎo)致一種肉眼可見的培養(yǎng)物溶解。噬菌體的這種生長見的培養(yǎng)物溶解。噬菌體的這種生長(繁殖繁殖)方式稱為方式稱為一步生長。一步生長。如果只觀察一個(gè)被感染的細(xì)胞，噬菌體數(shù)目的增如

18、果只觀察一個(gè)被感染的細(xì)胞，噬菌體數(shù)目的增殖過程將是一條垂直于時(shí)間的直線：殖過程將是一條垂直于時(shí)間的直線：10050時(shí)間(分)釋放噬菌體相對數(shù)釋放噬菌體相對數(shù)菌B菌D菌C菌A1021 2530 33病毒一步生長曲線病毒一步生長曲線l病毒數(shù)量臺階式增長；病毒數(shù)量臺階式增長；l每一個(gè)臺階代表一個(gè)復(fù)制周期；每一個(gè)臺階代表一個(gè)復(fù)制周期；l每個(gè)周期都以一個(gè)潛伏期開始，這時(shí)培養(yǎng)液中病毒數(shù)量不變；每個(gè)周期都以一個(gè)潛伏期開始，這時(shí)培養(yǎng)液中病毒數(shù)量不變；l潛伏期后，細(xì)胞外病毒數(shù)量大增潛伏期后，細(xì)胞外病毒數(shù)量大增暴發(fā)式增長；暴發(fā)式增長；l病毒完成一個(gè)復(fù)制周期后引起細(xì)胞破裂，病毒釋放出來；病毒完成一個(gè)復(fù)制周期后引起細(xì)

19、胞破裂，病毒釋放出來；l釋放出的病毒又感染新的細(xì)胞，開始下一輪復(fù)制。釋放出的病毒又感染新的細(xì)胞，開始下一輪復(fù)制。病毒的一步生長曲線病毒的一步生長曲線l病毒的一步生長曲線分為：隱蔽期（病毒的一步生長曲線分為：隱蔽期（eclipse period）；）；對數(shù)增對數(shù)增長期（長期（logrithmic phase）和細(xì)胞死亡。和細(xì)胞死亡。l從曲線中可獲得病毒繁殖的兩個(gè)特征性數(shù)據(jù)：潛伏期（從曲線中可獲得病毒繁殖的兩個(gè)特征性數(shù)據(jù)：潛伏期（latent period）和裂解量（和裂解量（burst size）。）。l潛伏期是毒粒吸附于細(xì)胞到受染細(xì)胞釋放出子代毒粒所需最短潛伏期是毒粒吸附于細(xì)胞到受染細(xì)胞釋放出子代毒粒所需最短時(shí)間。時(shí)間。l裂解量是每個(gè)受染細(xì)胞所產(chǎn)生的子代毒粒的平均數(shù)目。裂解量是每個(gè)受染細(xì)胞所產(chǎn)生的子代毒粒的平均數(shù)目。l隱蔽期發(fā)生在病毒感染的早期，在感染細(xì)胞內(nèi)不能檢出感染性病隱蔽期發(fā)生在病毒感染的早期，在感染細(xì)胞內(nèi)不能檢出感染性病毒顆粒。它包括病毒的粘附、穿入、脫殼和生物合成。毒顆粒。它包括病毒的粘附、穿入、脫殼和生物合成。l對數(shù)增長期產(chǎn)生大量感染性病毒顆粒，引起細(xì)胞死亡，發(fā)生在病對數(shù)增長期產(chǎn)生大量感染性病毒顆粒，引起細(xì)胞死亡，發(fā)生在病毒感染的后期，包括病毒的裝配和釋放。毒感染的后期，包括病毒的裝配和釋放。烈性噬菌體與溫和噬菌體的生活史比較：烈性噬菌體與溫和噬菌體的生活史比較