血液病相關(guān)分子檢測-華大基因

1、血液病臨床分為三大類型：紅細(xì)胞疾病、白細(xì)胞疾病、出血和血栓性疾病。臨床上常見的疾病有白血病、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥、血小板減少癥、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘟、骨骼纖維化、血友病、地中海貧血等。JAK2基因檢測骨髓增殖性疾?。╩yeloproliferativediseases,MPD是一組造血干細(xì)胞腫瘤增生性疾病。在骨髓細(xì)胞普遍增生的基礎(chǔ)上有一系或多系細(xì)胞尤其突出，呈持續(xù)不斷的過度增殖和外周血中成熟細(xì)胞數(shù)量增多為特征。其臨床表現(xiàn)具有異質(zhì)性，但各亞型幾乎都伴有白細(xì)胞、血小板及巨核細(xì)胞增多，后期出現(xiàn)骨髓纖維化和骨髓衰竭，隨病程進(jìn)展部分可轉(zhuǎn)化為其他疾病。其經(jīng)典的分類主要分為慢性粒細(xì)胞白血病（c

2、hronicmyelogenousleukemia,CML）、真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemiavera,PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essentialThrombocythemia,ET）以及原發(fā)性骨髓纖維化（primarymyelofibrosis,PMF）等。JAK2是酪氨酸蛋白激酶的一種，可以影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。JAK2基因特定位點的突變將破壞正常JAK2蛋白酪氨酸激酶活性的自我抑制作用，導(dǎo)致造血細(xì)胞的異常增生。JAK2V617F突變發(fā)生在65%97%J真性紅細(xì)胞增多癥（PV）、23%57%J原發(fā)性血小板增多癥（ET）及35%57%J原發(fā)性骨髓纖維化（PMF患者中。根據(jù)JAK2

3、突變與骨髓增生性疾病的密切關(guān)系，在修訂的2008世界衛(wèi)生組織（WHO分類系統(tǒng)中，JAK2突變成為慢性骨髓增殖性疾病（MPD主要的診斷指標(biāo)。檢測JAK2基因突變，對診斷慢性骨髓增殖性疾病和白血病都有重要意義。華大基因臨床檢驗中心，可以對JAK2基因的多個突變位點進(jìn)行檢測，不僅自動化、精確度高，還可以檢測新突變基因。STR嵌合體檢測造血干細(xì)胞移植是目前臨床上治療白血病、骨髓瘤、淋巴瘤、重型再生障礙性貧血和地中海貧血等血液系統(tǒng)疾病的根本手段。根據(jù)來源，造血干細(xì)胞移植可以分為自體、異體同基因（如雙胞胎）、異基因（如父母、同胞或無血緣關(guān)系的供者）移植。隨著移植技術(shù)的進(jìn)步以及骨髓庫的完善，異基因造血干細(xì)胞

4、移植在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。異基因干細(xì)胞移植的目的是為受者建立供者型的正常造血與免疫功能，以取代原有的異常的造血及免疫系統(tǒng)。為判斷移植是否成功并及時地實施免疫抑制治療和預(yù)后，人們需要對移植后受體體內(nèi)形成的供、受者外周血細(xì)胞嵌合體進(jìn)行檢測以觀察其變化趨勢。造血細(xì)胞嵌合體是異基因造血干細(xì)胞移植后供者和受者血細(xì)胞共存于受者體內(nèi)的現(xiàn)象。在造血干細(xì)胞移植后，造血嵌合體一般分為3種類型：當(dāng)供者細(xì)胞占受者的骨髓或外周血的比例大于95%時，供者細(xì)胞完全植入，稱為完全的供者嵌合狀態(tài)；若移植后，受者細(xì)胞仍出現(xiàn)在骨髓或外周血中，供者細(xì)胞占25%95%時，稱為混合嵌合狀態(tài)；若供者細(xì)胞占比小于25%,則稱為微嵌合狀態(tài)

5、。供者細(xì)胞嵌合率與移植物排斥及疾病的復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)，因此移植后動態(tài)檢測嵌合狀態(tài)對判斷移植效果、實施臨床干預(yù)尤為重要。檢測STR基因檢測法敏感性高，可如今，嵌合體的監(jiān)測已成為同種異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后患者的常規(guī)檢測項目,方法已由傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)方法發(fā)展到分子生物學(xué)方法。靠性好，定量精確，已成為目前國際骨髓移植登記處(舊MTH推薦的檢測供受嵌合狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。STR,即短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR,也稱做微衛(wèi)星DNA是由幾個堿基對作為核心單位串聯(lián)重復(fù)形成的DNA序列。STR廣泛存在于真核生物基因組中，具有高度的多態(tài)性，按孟德爾規(guī)律呈共顯性遺傳，是目前最理想的DN

6、A匱傳標(biāo)記。在醫(yī)學(xué)親子鑒定中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。華大基因臨床檢驗中心是國內(nèi)少數(shù)幾家掌握STR檢測技術(shù)的臨床檢驗中心。采用該技術(shù)，可以及時準(zhǔn)確地動態(tài)觀察嵌合體的變化，為早期預(yù)測移植排斥和白血病復(fù)發(fā)提供依據(jù)；還可以準(zhǔn)確判斷出復(fù)發(fā)是供者型還是受者型，為臨床治療提供參考。白血病相關(guān)融合基因定量檢測白血病(leukemia)屬于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，是一組高度異質(zhì)性的惡性血液病，其特點為白血病細(xì)胞呈現(xiàn)異常增生伴分化成熟障礙。臨床出現(xiàn)不同程度的貧血、出血、發(fā)熱及肝脾、淋巴結(jié)腫大，可危及生命。白血病融合基因(fusiongene),是白血病的分子生物學(xué)特異性標(biāo)志。近年來，由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對白血病細(xì)胞分

7、子遺傳學(xué)改變的了解也不斷深入。迄今報道白血病涉及至少數(shù)十種融合基因。已經(jīng)認(rèn)識到大部分的白血病中存在著染色體結(jié)構(gòu)畸變，包括缺失、重復(fù)、倒位、易位等，導(dǎo)致原癌基因及抑癌基因結(jié)構(gòu)變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白。有些基因是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)基因發(fā)生變異，直接影響了下游信號傳遞途徑，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、凋亡障礙，分化障礙等，產(chǎn)生白血病表型。一些典型的白血病融合基因是某種白血病的特異性分子診斷標(biāo)志，如BCR-ABLI蟲合基因，可出現(xiàn)在95%A上的慢性粒細(xì)胞白血病(CML?；颊哳A(yù)后效果的好壞，與融合基因的類型有一定關(guān)系，如急性早幼粒細(xì)胞白血病(APD特

8、有的PML-RAR融合基因，對APL患者用全反式維甲酸(ATRA誘導(dǎo)緩解治療，其預(yù)后非常好，復(fù)發(fā)率低。而有些基因，如MLL相關(guān)融合基因，預(yù)后差，死亡率高。白血病微小殘留病，是指在白血病經(jīng)誘導(dǎo)化療獲完全緩解后或是骨髓移植治療后，體內(nèi)仍殘留有少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)。這些殘存的白血病細(xì)胞將可能成為白血病復(fù)發(fā)的根源。白血病一旦復(fù)發(fā)，病情將更加嚴(yán)重。所以，定期檢測白血病微小殘留病很有必要。通過檢測微小殘留病融合基因表達(dá)水平，可更早預(yù)測白血病的復(fù)發(fā)；指導(dǎo)白血病的臨床治療，根據(jù)融合基因表達(dá)水平的多少，決定是否繼續(xù)化療；有利于評價藥物治療效果，是否耐藥，并依此指導(dǎo)臨床更換治療方案；評價造血干細(xì)胞移植的凈化效果。

9、華大基因臨床檢驗中心采用實時熒光定量PCR基因檢測法檢測白血病的相關(guān)融合基因，靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以為白血病的診斷、分型、臨床治療和預(yù)后判斷提供可靠的依據(jù)。人類白細(xì)胞抗原(HLA)高分辨基因分型檢測目前我國約有400萬名患者等待造血干細(xì)胞移植，同時每年新發(fā)病例4萬人左右。造血干細(xì)胞移植是白血病患者、再生障礙性貧血、地中海貧血、重癥放射病等人體造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)嚴(yán)重疾病患者徹底治愈的唯一希望。而在移植過程中，人類白細(xì)胞抗原(HumanLeukocyteAntigen,HLA)是決定移植排斥反應(yīng)高低的重要因素。在進(jìn)行骨髓和其它器官移植時，供者和受者之間HLA越接近，排斥反應(yīng)的發(fā)生率就越低，移植成

10、功率和移植器官長期存活率就越高；反之，就越容易發(fā)生排斥反應(yīng)。病人同胞間HLA相合的可能性為四分之一，而非血緣關(guān)系為1/5000-1/10000,對于一些罕見的HLA類型的患者，配型成功的幾率為幾萬甚至幾十萬分之一。而我國大部分是獨生子女家庭，在骨髓庫中尋找與患者HLA匹配的志愿者，成為發(fā)現(xiàn)供者的主要途徑。HLA的命名含有四組數(shù)字，代表HLA基因的不同部分，如HLA-A*01:01:01:02。第一組數(shù)字表示HLA低分辨基因分型，第二組及以上的數(shù)字表示高分辨分型。正如下圖，HLA的低分辨只能識別HLA的抗原特異性，就像在地圖上看天安門，只識其大概；而高分辨則可以在基因水平上準(zhǔn)確識別HLA,如同看

11、天安門的高清圖，可以確切地看到細(xì)節(jié)。目前我國骨髓庫(即中華骨髓庫，全稱中國造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫)中的HLA分型數(shù)據(jù)多數(shù)是低分辨的，并不能確保供者和患者的HLA真正匹配，患者首先需要在骨髓庫中篩選出低分辨配型匹配的志愿者，再和這多個低分辨匹配的志愿者逐一進(jìn)行高分辨復(fù)核，才有可能找到真正合適的供者。有的患者與數(shù)十個低分辨匹配的志愿者進(jìn)行復(fù)核后，發(fā)現(xiàn)他們均不是合適的供者，甚至有的患者始終找不到匹配的供者，只能在HLA部分匹配的情況下就進(jìn)行造血干細(xì)胞移植，導(dǎo)致術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，需要服用大量藥物來維持生命。即使最后能夠找到較為適合的供者，在低配篩選和多次高配復(fù)核的過程中，患者的維持更為重要的是，

12、先低配篩選再逐一費用和多次低配和高配的配型費用就是一個龐大的數(shù)目。高配復(fù)核的方法，消耗了大量的時間，很多患者等不到配型成功就已經(jīng)因并發(fā)癥而離開人世。因此，推廣HLA高分辨配型可以從根本上提高骨髓配型的效率和準(zhǔn)確率。如果骨髓庫全部“高分入庫”，那么查找匹配骨髓的時間將有可能從幾個月縮短為幾分鐘一一患者的HLA高分?jǐn)?shù)據(jù)數(shù)據(jù)直接與骨髓庫中的高分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行比對，一步到位找出供者。HLA高分辨分型技術(shù)的推廣不僅將為患者節(jié)約多次低配費用的額外負(fù)擔(dān)，更重要的是，為患者爭取到了大量“救命”的時間。華大基因是中華骨髓庫的合作伙伴，承擔(dān)了國內(nèi)和國際上大量的HLA配型檢測任務(wù)。目前，華大基因應(yīng)用新一代的測序技術(shù)，只需

13、通過一次實驗就能夠讀取數(shù)千份樣本的HLA序列數(shù)據(jù)，并一次性達(dá)到HLA分型的高分辨率，同時還可發(fā)現(xiàn)新的等位基因。在檢測通量、數(shù)據(jù)質(zhì)量和成本控制等方面都有質(zhì)的飛躍。2009年，華大基因保質(zhì)保量地完成了中華骨髓庫高分辨入庫項目，樣本結(jié)果質(zhì)評準(zhǔn)確率達(dá)到99.75%（骨髓庫準(zhǔn)確率標(biāo)準(zhǔn)為97%）,真正實現(xiàn)效率和準(zhǔn)確率的雙贏。華大基因的HLA高分辨分型技術(shù)，使建立高分辨HLA數(shù)據(jù)庫成為現(xiàn)實。這將幫助廣大患者快速準(zhǔn)確地找到合適的供者，也將極大地提高骨髓庫的使用率，還可以為HLA的科學(xué)研究與技術(shù)創(chuàng)新提供基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)支持。人類血小板抗原（HPA）分型血小板是血液中的有形成分之一，在止血及維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性方

14、面具有重要作用。目前，血小板輸注已成為腫瘤、惡性血液病、骨髓衰竭等疾病及外周造血干細(xì)胞移植患者治療的一個重要治療手段。HPA即人類血小板抗原，血液供者和受者的HPM相合可導(dǎo)致血小板輸注無效（PTR、輸血后紫瘢（PTP）以及新生兒同種免疫性血小板減少性紫瘢（NAITP）等。因此，建立準(zhǔn)確的HPA分型技術(shù)對于血小板減少癥的診斷和血小板輸注等臨床醫(yī)療活動具有非常重要的意義。一直以來，醫(yī)學(xué)上一直用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法進(jìn)行HPA分型，由于缺乏高質(zhì)量、高效價抗血清等多種因素的制約，始終無法對HPA進(jìn)行全面準(zhǔn)確的分型。隨著對HPA基因的深入研究，將基因檢測技術(shù)應(yīng)用于血小板分型中，極大地提高了HPA分型的水平。華

15、大基因臨床檢驗中心（簡稱華大臨檢中心）掌握了多種HPA基因分型方法，可以滿足不同的分型需求。華大臨檢中心提供的HPA基因檢測服務(wù)不僅通量高，適合大量樣本的規(guī)模檢測；而且結(jié)果穩(wěn)定；并能夠檢測出18個血小板抗原系統(tǒng)。華大臨檢中心的HLA分型技術(shù)已經(jīng)非常成熟，患者在進(jìn)行血小板輸注前，可以進(jìn)行HPA聯(lián)合HLA分型檢測，更具可靠性和和安全性；而且中心對HPA進(jìn)行高通量檢測，在成本、準(zhǔn)確性上比起其他機(jī)構(gòu)更具優(yōu)勢。華大臨檢中心提供的HPA分型檢測結(jié)果，不僅可以作為血小板減少癥的診斷和血小板輸注的依據(jù)；還可以在更大范圍里建立血小板數(shù)據(jù)庫，一方面可以讓受者找到與之匹配的供者，及時進(jìn)行疾病治療；另一方面可以更好的

16、研究HPA在中國人群中分布白基因頻率，給HPA相關(guān)疾病研究提供依據(jù)。KirPCR-SSP分型檢測Kir（Thekillercellimmunoglobulin-likereceptor）,即殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體，在病毒感染、腫瘤形成、移植受者免疫狀態(tài)和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。在造血干細(xì)胞移植中，供者和受者的HLA（人類白細(xì)胞抗原）相合程度越高，移植就越容易成功；而Kir則相反，研究表明，供者和受者的Kir不相合，會降低排斥的發(fā)生風(fēng)險。因此Kir分型可以為骨髓移植供受者的選擇提供參考，有效的提高骨髓移植成功率。華大基因臨床檢驗中心采用PCR-SS限術(shù)對kir進(jìn)行分型檢測，不僅簡單、快

17、速、低成本，而且準(zhǔn)確性高，可以成為供臨床治療參考的可靠依據(jù)。地中海貧血基因檢測地中海貧血（俗稱“軟癌”）是一種遺傳性溶血性貧血，是由珠蛋白基因的缺陷導(dǎo)致血紅蛋白組成成分發(fā)生改變。地中海貧血，按照血紅蛋白受損傷的位置，主要有“地中海貧血（構(gòu)成血紅蛋白的氨基酸的a鏈?zhǔn)艿綋p傷）和3地中海貧血（構(gòu)成血紅蛋白的氨基酸的3鏈?zhǔn)艿綋p傷）。也可以按照基因缺損的數(shù)目來分為輕型，中間型和重型地中海貧血。據(jù)世界衛(wèi)生組織和國際地中海貧血協(xié)會資料，全世界大約7%勺人群攜帶地中海貧血基因，每年有50萬重型地中海貧血新生兒出生。在我國，地中海貧血主要發(fā)生在長江流域以南的廣東、廣西、四川、云南、貴州、湖南、江西、浙江、福建、

18、海南等地，其中兩廣、云貴以及海南是高發(fā)區(qū)。我國人群的地貧基因攜帶率為1.92%14.95%,其中廣東、廣西、海南省人群中“地貧”基因攜帶者占本省總?cè)丝诘?1麻25%,每年有數(shù)千重型地貧患兒出生。若夫妻為同型地中海貧血的攜帶者，每次懷孕，其子女有1/4的機(jī)會為正常，1/2的機(jī)會為帶因者，另1/4的機(jī)會為重型地中海型貧血患者，因此，在遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷方面,這是非常重要的疾病。li型患者正常攜帶者父4B輕顰）埠I0段設(shè)父Io熟型母t口般SHK（a«W母（B況也1越正常1工中間用亶型需要青憚證的糖基因分析才借用海下一0£力中回盟或鬟地申箕盤等*的凡軍胎兒蒯I樓聚產(chǎn)mtth£案最香狗魚地中海髓血盤看地中海貧血的癥狀有1 .重型：出生數(shù)日即出現(xiàn)貧血，肝脾腫大進(jìn)行性加重，黃疸，發(fā)育不良，頭大，眼距寬，馬鞍鼻,前額兩頰突出，少數(shù)患者在肋骨和脊椎之間發(fā)生胸腔腫塊，亦可見膽石癥，下肢潰瘍，常見并發(fā)癥有急性心包炎，繼發(fā)性脾功能亢進(jìn)，血色病