第二十章 常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用

1、常用分子生物學(xué)技術(shù)的常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第二十章第二十章常用分子生物學(xué)技術(shù)的常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology第一節(jié)第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Techniquen核酸分子雜交核酸分

2、子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA復(fù)性過程中，如果把不同復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈成雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理復(fù)性復(fù)性RNADNA（一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子

3、轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素移到硝酸纖維素( (NC)等各種膜上，使之成為固相化等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為因此稱之為“blotting”，譯為，譯為。目前這種技術(shù)已廣泛用于目前這種技術(shù)已廣泛用于DNADNA、RNARNA和蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的檢測。的檢測。 n常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜。、尼龍膜、化學(xué)活化膜。n轉(zhuǎn)膜的方法轉(zhuǎn)膜的方法1 1、毛細(xì)管虹吸法：、毛細(xì)管虹吸法： 利用高鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用和虹吸作用。雖轉(zhuǎn)移利用高鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用和虹吸作用。雖轉(zhuǎn)

4、移率不高，但應(yīng)用廣泛。率不高，但應(yīng)用廣泛。2 2、電轉(zhuǎn)印法：、電轉(zhuǎn)印法： 利用電泳作用將凝膠中的利用電泳作用將凝膠中的DNADNA轉(zhuǎn)移到膜上。適用于轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到膜上。適用于轉(zhuǎn)移大片段移大片段DNADNA。 3 3、真空轉(zhuǎn)移：、真空轉(zhuǎn)移： 原理同毛細(xì)管虹吸，需真空泵。原理同毛細(xì)管虹吸，需真空泵。用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術(shù)（

5、二）探針技術(shù)n探針的種類探針的種類 人工合成的寡核苷酸片段、基因組人工合成的寡核苷酸片段、基因組DNADNA片段、片段、cDNAcDNA片片段段、RNARNA片段。片段。n探針的標(biāo)記物探針的標(biāo)記物1 1、核素標(biāo)記物、核素標(biāo)記物：（放射性同位素）：（放射性同位素） 靈敏度高，特異性強，常用靈敏度高，特異性強，常用3232P P，3535S S，3 3H H，125125I I，1414C C。易造成。易造成放射性污染，同位素半衰期短，必須隨用隨標(biāo)。放射性污染，同位素半衰期短，必須隨用隨標(biāo)。2 2、非核素標(biāo)記物：、非核素標(biāo)記物： 靈敏度低，特異性差，但無放射性污染，探針標(biāo)記后可長靈敏度低，特異性差

6、，但無放射性污染，探針標(biāo)記后可長期保存（期保存（2 2年以上）。常用生物素、地高辛、辣根過氧化物酶年以上）。常用生物素、地高辛、辣根過氧化物酶（HRPHRP）、熒光素（）、熒光素（FITCFITC、羅丹明類）、化學(xué)發(fā)光劑。、羅丹明類）、化學(xué)發(fā)光劑。二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern blotting)（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern blotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western blotting)用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 用于用于RNA的定

7、性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern blotting)1、制備待測、制備待測DNA，DNA的限制性內(nèi)切酶消化；的限制性內(nèi)切酶消化；2、待測、待測DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳分離；樣品的瓊脂糖凝膠電泳分離；3、凝膠中核酸的原位變性；、凝膠中核酸的原位變性；4、轉(zhuǎn)膜；、轉(zhuǎn)膜；5、雜交；、雜交；6、洗膜；、洗膜；7、雜交結(jié)果的檢測、雜交結(jié)果的檢測-放射自顯影。放射自顯影。用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。印跡印跡放放射射自自顯顯影影照照片片Southe

8、rn blottingSouthern blotting（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性定量分析的定性定量分析 其技術(shù)原理與其技術(shù)原理與Southern blotting相同。相同。 RNA分子較小，轉(zhuǎn)移前無需限制酶切割；在變性劑分子較小，轉(zhuǎn)移前無需限制酶切割；在變性劑存在下（防止形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)）直接進行瓊脂糖凝膠電泳；存在下（防止形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)）直接進行瓊脂糖凝膠電泳；電泳結(jié)束后，不需要再進行變性和中和，直接轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)電泳結(jié)束后，不需要再進行變性和中和，直接轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移效率也比較高。移效率也比較高。 盡管盡管RNA印跡技術(shù)檢測印跡技術(shù)檢測mRN

9、A表達(dá)水平的敏感性較表達(dá)水平的敏感性較PCR法低，但其特異性強，假陽性率低，仍然被認(rèn)為是法低，但其特異性強，假陽性率低，仍然被認(rèn)為是最可靠的最可靠的mRNA和和miRNA定量分析方法之一。定量分析方法之一。（三）蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western blotting)用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究1、混合蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；、混合蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；2、將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到、將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜或其他膜上（電轉(zhuǎn)移）；膜或其他膜上（電轉(zhuǎn)移）；3、第一抗體第一抗體首先與轉(zhuǎn)移膜上相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子結(jié)合；首先與轉(zhuǎn)移膜上相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子結(jié)合；

10、4、第二抗體第二抗體（放射性核素或堿性磷酸酶、辣根過氧化（放射性核素或堿性磷酸酶、辣根過氧化 物酶標(biāo)記）與之結(jié)合；物酶標(biāo)記）與之結(jié)合；5、放射自顯影或底物顯色來檢測蛋白質(zhì)區(qū)帶的信號。、放射自顯影或底物顯色來檢測蛋白質(zhì)區(qū)帶的信號。三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較斑點印跡斑點印跡 (dot blotting) 不經(jīng)電泳分離直接將樣品點在膜上用于雜交分析不經(jīng)電泳分離直接將樣品點在膜上用于雜交分析 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip)將多種已知序列的排列在一定

11、大小的尼龍膜或?qū)⒍喾N已知序列的排列在一定大小的尼龍膜或其他支持物上用于檢測細(xì)胞或組織樣品中的核酸種類。其他支持物上用于檢測細(xì)胞或組織樣品中的核酸種類。n其他：其他：DNADNA芯片芯片技術(shù)技術(shù)第二節(jié)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用技術(shù)的原理與應(yīng)用The Principle and Application of PCR Technology PCR（polymerase chain reaction) 中文全稱中文全稱為為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外，又稱體外DNA擴增技術(shù)。擴增技術(shù)。是近年來發(fā)展起來的一種是近年來發(fā)展起來的一種體外擴增特異體外擴增特異DNA片片段的技術(shù)段的技術(shù)。 PCR技

12、術(shù)是技術(shù)是1985年由美國年由美國 Cetus 公司的公司的Kary Mullis 首創(chuàng)，可以將微量目的首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴片段擴增一百萬倍以上。增一百萬倍以上。 PCR具有具有敏感度高、特異性強、產(chǎn)率高、敏感度高、特異性強、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡便重復(fù)性好以及快速簡便等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于微等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實驗室，大大簡化了傳統(tǒng)的分普及到許多普通實驗室，大大簡化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對目的基因進行子克隆技術(shù)，從而比較容易地對目的基因進行分析、鑒定。分析、鑒定。 Kary

13、 Mullis本人因此獲本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)年諾貝爾化學(xué)獎。獎。一、一、PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理 用于擴增位于兩段已知序列之間的用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA片段，片段，類似于天然類似于天然DNA的復(fù)制過程。的復(fù)制過程。 以擬擴增的以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與分子為模板，以一對分別與模板模板5末端和末端和3末端相互補的寡核苷酸片段為引物，末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這合成，重復(fù)這一過程，即可使目的一過程，

14、即可使目的DNA片段得到擴增。片段得到擴增。n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟1. 變性變性 (Denaturation)： 加熱加熱到到94使模板使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈條單鏈，同時引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得同時引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以消除。以消除。2. 退火退火 (復(fù)性復(fù)性) (Annealling): 將溫度下降至適宜溫度（較將溫度下降至適宜溫度（較Tm低低5 - 55 ），），模模板板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，也存在兩條模與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)

15、簡單的特點，板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡單的特點，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟3. 延伸延伸 (Extension): 將反應(yīng)溫度將反應(yīng)溫度升至酶的最適溫度升至酶的最適溫度 72 ，DNA聚合酶聚合酶以以4種種 dNTP為底物為底物，以引物的，以引物的 3 端開始，結(jié)合單核苷酸，端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新形成與模板鏈互補的新DNA鏈鏈。 上述上述 3 步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的量應(yīng)該增加一倍

16、，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過模板，經(jīng)過2530個循環(huán)后個循環(huán)后DNA可擴增可擴增106 109 倍。倍。 變性變性9494C C延伸延伸7272C C退火退火5555C C5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 目目 錄錄Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴大可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。目目 錄錄PCR技術(shù)原理示意圖技術(shù)原理示意圖 PCR擴增的特異性是由一對寡核苷酸

17、引物所擴增的特異性是由一對寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期，原來的決定的。反應(yīng)初期，原來的DNA擔(dān)負(fù)起始模板的擔(dān)負(fù)起始模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板，片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴增產(chǎn)物最終的擴增產(chǎn)物是介于兩種引物是介于兩種引物5 端之間的端之間的DNA片段片段。 模板模板DNA PCR技術(shù)對模板質(zhì)和量的要求并不十分嚴(yán)格。技術(shù)對模板質(zhì)和量的要求并不十分嚴(yán)格。 一般來一般來說宜用說宜用ng量的克隆量的克隆DNA，g水平的染色體水平的染色體DNA作起始材料。作起始材料。 特異性引物特異性引物 預(yù)擴增核酸片段兩

18、端的已知序列，決定特異性。預(yù)擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶（耐熱耐熱Taq DNA聚合酶聚合酶 ） dNTPs Mg2+ 緩沖液緩沖液 水水n PCR反應(yīng)反應(yīng)體系的基本組成成分體系的基本組成成分 利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為模板獲得為模板獲得已知目的基因片段已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；為模板獲得目的片段； 利用簡并引物從利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；列相似的基因片段

19、； 利用隨機引物從利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基文庫或基因組文庫中克隆基因。因。 二、二、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺±美肞CR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。變等改造。 PCR技術(shù)高度敏感，對模板技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量的量要求很低，是要求很低，是DNA和和RNA微量分析的最好微量分析的最好方法。方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因的體外突變（二）基因的體外突變將將PCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNA序

20、列測定，使測序序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測待測DNA片段既可克隆到特定的載體后片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性因突變檢測的敏感性 。（四）（四）DNA序列測定序列測定（五）基因突變分析（五）基因突變分析 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是將是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。應(yīng)用的一種技術(shù)。 RT-PCR是目前

21、從組織或細(xì)胞中獲得目的基因是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分進行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù)三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù) 原位原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個細(xì)胞內(nèi)進行的涂片上的單個細(xì)胞內(nèi)進行的PCR反應(yīng)，然后反應(yīng)，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。是否在該組織或細(xì)胞中存在。 原位原位PCR方法彌補了方法彌補了PCR技術(shù)和原

22、位雜交技技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)術(shù)的不足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。合的一種最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù)（三）實時（三）實時PCR技術(shù)技術(shù)實時實時PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動態(tài)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為對定量分析的干擾，亦被稱為定量定量PCR。定量定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了技術(shù)實現(xiàn)了mRNA和和miRNA水平的快速、準(zhǔn)確的定量分析，已經(jīng)在基因水平的快速、準(zhǔn)確的定量分析，已經(jīng)在基因診斷方面得到臨床應(yīng)用。診斷方面得到臨床應(yīng)用。n 實時

23、實時PCR技術(shù)原理技術(shù)原理實時實時PCR的基本原理是引入了熒光標(biāo)記分的基本原理是引入了熒光標(biāo)記分子，并使熒光信號強度與子，并使熒光信號強度與PCR產(chǎn)物量成正比，產(chǎn)物量成正比，對每一反應(yīng)時刻的熒光信號進行實時分析，即對每一反應(yīng)時刻的熒光信號進行實時分析，即可計算出可計算出PCR產(chǎn)物量。也稱為實時熒光定量產(chǎn)物量。也稱為實時熒光定量PCR或熒光定量或熒光定量PCR。n 實時實時PCR分類分類實時實時PCR非探針類：非探針類：加入了能與雙鏈加入了能與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，結(jié)合的熒光染料， SYBRGreen-DNA小溝，熒光信號強度小溝，熒光信號強度 與結(jié)合雙鏈與結(jié)合雙鏈DNA量成正比，可實時監(jiān)量

24、成正比，可實時監(jiān) 測測PCR產(chǎn)物量的多少產(chǎn)物量的多少-大量應(yīng)用大量應(yīng)用探針類探針類1. TaqMan探針法探針法 2. 分子信標(biāo)探針法分子信標(biāo)探針法 3. 熒光熒光共振能量轉(zhuǎn)移共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針法探針法 1、TaqMan探針法探針法 5-熒光報告基團熒光報告基團-R3-熒光淬滅基團熒光淬滅基團-QTaqMan探針：探針：TaqMan探針能與模板探針能與模板DNA特異性結(jié)合。特異性結(jié)合。 沒有擴增反應(yīng)時，探針保持完整，沒有擴增反應(yīng)時，探針保持完整，R和和Q同時同時存在于探針上，無熒光信號釋放；存在于探針上，無熒光信號釋放； 隨著隨著PCR進行，聚合酶在鏈上延伸遇到熒光探進行，聚合酶在鏈

25、上延伸遇到熒光探針，其針，其53核酸外切酶活性將探針逐步切斷，核酸外切酶活性將探針逐步切斷，R與與Q分離，產(chǎn)生熒光信號，被熒光檢測系統(tǒng)接收，分離，產(chǎn)生熒光信號，被熒光檢測系統(tǒng)接收，用于數(shù)據(jù)分析。用于數(shù)據(jù)分析。TaqMan探針法實時探針法實時PCR技術(shù)原理技術(shù)原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物RQ 3355TaqMan探針法實時探針法實時PCR原理示意圖原理示意圖2、分子信標(biāo)探針法、分子信標(biāo)探針法 與與TaqMan探針法相似，也標(biāo)記有探針法相似，也標(biāo)記有R和和Q基團，但基團，但不同的是分子信標(biāo)探針是一種呈不同的是分子信標(biāo)探針是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)寡核發(fā)夾結(jié)構(gòu)

26、的莖環(huán)寡核苷酸探針苷酸探針，即其兩端的核苷酸序列互補配對。，即其兩端的核苷酸序列互補配對。 探針未與靶序列雜交時形成發(fā)夾狀態(tài)探針未與靶序列雜交時形成發(fā)夾狀態(tài)R與與Q靠近，靠近，熒光幾乎完全淬滅；熒光幾乎完全淬滅； 雜交后，發(fā)夾展開，雜交后，發(fā)夾展開， R與與Q分開，熒光得以恢復(fù)，分開，熒光得以恢復(fù)，熒光檢測系統(tǒng)即可接收到熒光信號。熒光檢測系統(tǒng)即可接收到熒光信號。3、FRET探針法：探針法：雙雜交探針或雙雜交探針或Light Cycle探針探針 有兩條能與模板互補、且相鄰的特異探針組成（有兩條能與模板互補、且相鄰的特異探針組成（15bp），上游探針的），上游探針的3端標(biāo)記熒光供體基團，下游探針的

27、端標(biāo)記熒光供體基團，下游探針的5端標(biāo)記端標(biāo)記Red640熒光受體基團。熒光受體基團。 復(fù)性時，兩探針同時結(jié)合在模板上，供體基團和受復(fù)性時，兩探針同時結(jié)合在模板上，供體基團和受體基團緊密相鄰，激發(fā)供體產(chǎn)生熒光能量被受體基團吸收體基團緊密相鄰，激發(fā)供體產(chǎn)生熒光能量被受體基團吸收（發(fā)生（發(fā)生FRET），可檢測到），可檢測到Red640發(fā)出的熒光；發(fā)出的熒光； 變性時，兩探針游離，兩熒光基團距離遠(yuǎn)，不能檢變性時，兩探針游離，兩熒光基團距離遠(yuǎn)，不能檢測到測到Red640的熒光。的熒光。 FRET探針法探測的是實時信號，是可逆的，在突變探針法探測的是實時信號，是可逆的，在突變分析、分析、SNP基因分型等方

28、面更具有優(yōu)勢?；蚍中偷确矫娓哂袃?yōu)勢。第三節(jié)第三節(jié)基因文庫基因文庫Gene Library 基因組基因組DNA文庫文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫文庫(cDNA library) n 基因文庫基因文庫( (gene library)是指一個包含了某一生物體全部是指一個包含了某一生物體全部DNADNA序列的克隆群體。序列的克隆群體。一、基因組一、基因組DNA文庫文庫基因組基因組DNADNA文庫是指生物的文庫是指生物的基因組基因組DNA的的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群體。

29、n 基因組基因組DNADNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫的構(gòu)建和篩選 分離純化細(xì)胞基因組分離純化細(xì)胞基因組DNA； 限制性內(nèi)切酶消化基因組限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，獲得一定大小的，獲得一定大小的DNA片片段（段（20Kb左右）；左右）； 選擇載體（選擇載體（ 噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等）；噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等）； 將基因組將基因組DNA片段連接入載體片段連接入載體 ； 將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌可獲得擴增；將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌可獲得擴增； 用探針進行雜交，篩選陽性克隆，獲得目的基因。用探針進行雜交，篩選陽性克隆，獲得目的基因?；蚪M基因組DNADNA文庫和文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫

30、的構(gòu)建和篩選第一輪篩選第一輪篩選第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例基因組文庫篩選結(jié)果舉例cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。 二、二、cDNA文庫文庫n cDNAcDNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫的構(gòu)建和篩選 提純組織細(xì)胞提純組織細(xì)胞mRNA； mRNA 逆轉(zhuǎn)錄合成逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA； 選擇載體（選擇載體（質(zhì)?；蛸|(zhì)?；蚴删w

31、）；噬菌體）； 將將cDNA連接入載體連接入載體 ； 將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌可獲得擴增；將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌可獲得擴增； 用探針進行雜交，篩選陽性克隆，獲得目的基因。用探針進行雜交，篩選陽性克隆，獲得目的基因?；蚪M基因組DNADNA文庫和文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫的構(gòu)建和篩選l cDNA文庫特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定文庫特異地反映某種組織或細(xì)胞中，在特定發(fā)育發(fā)育 階段階段表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼基因，因此cDNA文庫具有組文庫具有組 織或細(xì)胞織或細(xì)胞特異性特異性。 l cDNA文庫顯然比文庫顯然比基因組基因組DNA文庫文庫小得多，能夠比較小得多，能夠比較

32、容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對 真核細(xì)胞真核細(xì)胞來說，從基因組來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從文庫獲得的基因與從 cDNA文庫獲得的不同，基因組文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶文庫所含的是帶 有有內(nèi)含子內(nèi)含子和和外顯子外顯子的基因組基因，而從的基因組基因，而從cDNA文庫中文庫中 獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。 l cDNA文庫在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)文庫在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá) 狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，從狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定

33、方面具有特殊的優(yōu)勢，從 而使它在而使它在個體發(fā)育個體發(fā)育、細(xì)胞分化細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞細(xì)胞 衰老衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的 應(yīng)用價值，是研究工作中最常使用到的應(yīng)用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫基因文庫。 第四節(jié)第四節(jié)生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique一、基因芯片一、基因芯片n 基因芯片基因芯片(gene chip) 是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA片段有規(guī)律地緊密排列固定片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品于單位面積的

34、支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作亦被稱作DNADNA微陣列微陣列(DNA microarray)(DNA microarray)。 基因芯片可在同一時間內(nèi)分析大量的基因，實現(xiàn)基因芯片可在同一時間內(nèi)分析大量的基因，實現(xiàn)了基因信息的大規(guī)模檢測?；蛐酒貏e適用于分析了基因信息的大規(guī)模檢測?；蛐酒貏e適用于分析不

35、同組織細(xì)胞或同一細(xì)胞不同狀態(tài)下的基因差異表達(dá)不同組織細(xì)胞或同一細(xì)胞不同狀態(tài)下的基因差異表達(dá)情況。情況。一、基因芯片一、基因芯片n 基因芯片基因芯片(gene chip)n 基因芯片的原理：基因芯片的原理：雙色熒光探針雜交雙色熒光探針雜交 將兩個不同來源樣品的將兩個不同來源樣品的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA時時用不同的熒光分子（正常用紅色，腫瘤用綠色）進行標(biāo)用不同的熒光分子（正常用紅色，腫瘤用綠色）進行標(biāo)記，標(biāo)記的記，標(biāo)記的cDNA 等量混合后與基因芯片進行雜交，在等量混合后與基因芯片進行雜交，在兩組不同的激發(fā)光下檢測，獲得兩個不同樣品在芯片上兩組不同的激發(fā)光下檢測，獲得兩個不同樣品在芯

36、片上的全部雜交信號。綠色熒光的全部雜交信號。綠色熒光-該基因只在腫瘤組織表達(dá)；該基因只在腫瘤組織表達(dá)；紅色熒光紅色熒光-正常組織表達(dá)；黃色正常組織表達(dá)；黃色-兩種組織均表達(dá)。兩種組織均表達(dá)。雙色熒光標(biāo)記探針基因芯片工作流程示意圖雙色熒光標(biāo)記探針基因芯片工作流程示意圖二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片 蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)：抗原蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)：抗原- -抗體或受體抗體或受體- -配體配體最常用的探針蛋白是抗體。最常用的探針蛋白是抗體。n 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)n 蛋白質(zhì)芯片作用原理蛋白質(zhì)芯片作用原理 是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定是將高度密集排列的蛋白分

37、子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。定量分析的一種技術(shù)。樣品標(biāo)記法蛋白質(zhì)芯片工作流程示意圖樣品標(biāo)記法蛋白質(zhì)芯片工作流程示意圖第五節(jié)第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交酵母雙雜交 各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析熒光共振能量