中樞系統(tǒng)(解剖學(xué))研究方法進(jìn)展

1、 顯示腦血管、主要核團(tuán)和纖維束、腦室等。塑化標(biāo)本用于斷 面解剖學(xué)。 固定、切片、染色 1.H.E染色 2. 硝酸鹽鍍?nèi)荆簷C(jī)制不清(顯示神經(jīng)元輪廓和突起的行向)。 3. Nissl法：堿性染料-核酸結(jié)合(焦油紫、甲苯胺藍(lán)、培花青等)。 生化學(xué)+組織學(xué)：固定良好，稱量準(zhǔn)確，器皿潔凈，嚴(yán)格操作。 1. 酶組化：底物 (有色)原位沉淀 四氮唑鹽或金屬(鉛、鈷、銅) (1)膽堿能神經(jīng)元的檢測：乙酰硫膽堿 硫膽堿 鐵氰化物 亞鐵氰化物 (2)NO能神經(jīng)元的檢測： 還原輔酶A 藍(lán)色沉淀 硝基四氮唑藍(lán)酶AchECu 棕色沉淀+(黃遞酶)NOS 自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光： 紫外光 標(biāo)本 激發(fā)濾片 物鏡 吸收濾片 目鏡

2、1. 單胺熒光組化：(1)甲醛誘發(fā)熒光：(2)乙醛酸誘發(fā)熒光：CA 四氫異喹啉 雙氫異喹啉 5HT 四氫-咔啉 二氫-咔啉FAorGA蛋白催化H+(綠色熒光)FAorGA蛋白催化H+(黃色熒光)1.原理：抗原抗體反應(yīng)。 重鏈 N端 可變區(qū) 抗體活性部分 Fab段 輕鏈 C端 穩(wěn)定區(qū) 抗原決定簇 Fc段C端FcFabN端重鏈輕鏈C區(qū)V區(qū)C區(qū)抗原第一抗體F標(biāo)記物直接法抗原第一抗體間接法第二抗體F標(biāo)記物2. PAP法的原理注意事項(xiàng)： 1)一抗的特異性要強(qiáng)，效價要高。 2)二抗的量要足(雙橋PAP法)。 3)PAP復(fù)合體與一抗來自同一動物種屬。 4)要設(shè)對照試驗(yàn)(吸收試驗(yàn)、置換試驗(yàn)、交叉試驗(yàn))。 5)

3、提高染色質(zhì)量的措施：H2O2甲醇液去內(nèi)源性HRP；Triton X-100增加通透性；酶消化，微波重新釋放抗原?；驹恚猴@示標(biāo)記物改酶標(biāo)為熒光素(異硫氰酸熒光素 FITC、四甲基異硫氰酸羅達(dá)明TRITC)，在熒 光顯微鏡下觀察。 AB直接直接(A)和間接和間接(B)免疫熒光法原理示意圖免疫熒光法原理示意圖1. 原理：是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和力與免疫反應(yīng)結(jié)合 起來的技術(shù)。 這些物質(zhì)包括：植物凝集素與糖類，生物素與親合素，葡萄球菌A蛋白與IgG，陽離子與陰離子，激素與受體。2. ABC法的原理(Avidin Biotin-peroeidase Complex)親合素生物素過氧化物酶復(fù)合體3.

4、 ABC法的優(yōu)點(diǎn)： (1)靈敏度高； (2)非特異性著色較少； (3)使用和操作較簡便。4. SABC法的原理(Strept Avidin Biotin-enzyme Complex): 鏈酶親合素生物素酶復(fù)合物親合素鏈酶親合素分子中含寡糖不含糖鏈等電點(diǎn)高(1010.5)等電點(diǎn)不高(66.5)非特異性染色+(與人源性凝集素樣蛋白質(zhì)結(jié)合；與細(xì)胞膜、核起反應(yīng))1. 原理：是用堿基序列已明了的，并被同位素標(biāo)記的核酸探針與組織或細(xì)胞中待測的核酸雜交，對待測核酸進(jìn)行定性、定位和相對定量的技術(shù)。多用于蛋白質(zhì)合成的動態(tài)變化、遞質(zhì)共存、亞核和追蹤定性等方面的研究。cDNAmRNA(轉(zhuǎn)錄)多肽鏈蛋白質(zhì)RNA聚合

5、酶反轉(zhuǎn)錄酶tRNA核糖體G C T A(DNA)C G A TG C U A(RNA)C G A U2. 注意事項(xiàng)：戴手套；器械高壓消毒；固定的要求更嚴(yán)格；標(biāo)本制備過程中盡量避免RNA酶的污染。1. 原理：神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸：順行、逆行。2. 種類： (1)游離HRP： (2)結(jié)合HRP：麥芽凝集素HRP(Wheat Germ agglutininHRP) 霍亂毒素HRP(Cholera toxinHRP) 為酶標(biāo)配體。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，用量小，顯示充分，降解時程長。(3)主要步驟： HRP的引入存活。最佳存活期(日)(束路長度毫米/350毫米)+1日固定取材。 切片。 組織化學(xué)反應(yīng)： DAB法

6、成色劑+H2O2(二氨基聯(lián)苯胺) TMB法(四甲基聯(lián)苯胺) HRP+H2O2 HRP H2O2絡(luò)合物 HRP H2O2+(CHR)H2 CHR +2H2O2吲哚胺聚合體 吩嗪多聚體壓力注射法電泳法(HRP溶液接正電極，實(shí)驗(yàn)動物接負(fù)電極)1. 原理：2. 特點(diǎn)： (1)種類多，熒光顏色各異。 (2)標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞的部位各異。 (3)可單、雙、多標(biāo)記，用以研究軸突分支投射。 (4)切片易褪色，熒光顯微鏡的濾片要齊全。1. 原理：將3H、14C標(biāo)記的氨基酸注入神經(jīng)組織，被神經(jīng)元胞體吸收后參與神經(jīng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，然后合成的物質(zhì)隨軸漿運(yùn)輸至末梢，借助放射性同位素發(fā)出的射線使膠片或乳膠感光，經(jīng)顯影、定影后

7、就能產(chǎn)生黑色的銀粒，從而可確定神經(jīng)元的纖維投射區(qū)。2. 特點(diǎn)： (1)順行追蹤。 (2)不存在過路纖維 攝取干擾的問題。3. 基本步驟：1. 原理：利用某些化學(xué)性神經(jīng)毒物質(zhì)選擇性地?fù)p毀特定性質(zhì)的神經(jīng)元胞體或末梢，引起神經(jīng)的順行潰變或逆行潰變(變性)。 2. 單胺能毒劑： NA CA 5-HT5,6-或5,7-DHT(5,6-或5,7-雙羥色胺， 為5-HT的同系物) 對神經(jīng)元細(xì)胞膜上胺攝取機(jī)制中的載體有高的親和力，進(jìn)入胞體后自行氧化，形成對細(xì)胞毒性很強(qiáng)的苯醌類化合物而導(dǎo)致細(xì)胞潰變，染色質(zhì)溶解、核偏心，胞體膨脹死亡。電鏡下線粒體膨脹、溶解、基質(zhì)電子密度增高，突觸囊泡分解、消失。 對其敏感性：末梢

8、軸突胞體6-OH-DA(6羥多巴胺，為去甲腎上腺素的同系物) 1. 用電子束代替光源。 2. 成像部分：用電磁透鏡代替光鏡中的聚光器、物鏡和目鏡。 (電子射線發(fā)生曲折) (可見光發(fā)生曲折) 3. 觀察部分：電子流熒光屏可見熒光 1. 固定、取材、修塊(1mm3)、后固定(1%餓酸2h)。 2. 脫水。 3. 包埋：樹脂類，不同溫度聚合，保證硬度適宜。 4. 切片：超薄切片(玻璃刀、鉆石刀，銅網(wǎng))。 5. 電子染色：增加對比度(鉛、鈾)。 吸附重金屬強(qiáng)部位透過的電子熒光屏弱光暗區(qū) 吸附重金屬弱部位透過的電子熒光屏強(qiáng)光亮區(qū) 一部分電子穿透 電子束標(biāo)本 另一部分電子將樣品表面原子的外層電子打落 “二

9、次電子” 收集、成像主要方法步驟： (1)灌注、取材。 (2)再固定及脫水。 (3)置換：用醋酸異戊酯置換酒精，用液態(tài)的CO2置換無水液體。 (4)臨界點(diǎn)干燥。 (5)噴金：真空噴鍍儀(防止放電，防止電子束損傷，增強(qiáng)反差，限定于樣品表面)。(醋酸異戊酯) 是一種使抗原或抗體在超微結(jié)構(gòu)水平上定位的方法，是免疫細(xì)胞化學(xué)與電鏡技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。1. 主要步驟： 包埋前染色(振動切片、平板包埋、解剖顯微鏡下精確取材后，用502膠水粘貼在環(huán)氧樹酯柱上作超薄切片。 包埋后染色(鎳網(wǎng)或金網(wǎng)上作免疫細(xì)胞化學(xué)染色，抗體顯示系統(tǒng)多用膠體金技術(shù)，雙重染色的結(jié)果可以用兩種不同直徑的膠體金顆粒顯示)。2. 用途與評價：

10、可用于超微結(jié)構(gòu)水平上神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的定性，研究神經(jīng)元之間聯(lián)系的性質(zhì)，以及遞質(zhì)共存等，包埋前染色對組織的抗原性保存較好，但不適于可溶性物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位，包埋后染色，則與此相反。 (Laser Scanning Confocal Microseope, LSCM)激光束做光源，為高能量、密度的相干光，光敏度高。 共聚焦：光源針孔 檢測針孔 (1)提高分辨率和敏感性。 (2)實(shí)現(xiàn)三維重建。微動步進(jìn)馬達(dá)控制載物臺升降“細(xì)胞CT”。 (3)擴(kuò)大信息范圍。 (4)客觀準(zhǔn)確地記錄熒光強(qiáng)度，以數(shù)據(jù)代替+、+。 (5)熒光攝影方便，如是紫外光下照射30秒，熒光亮度降低50%。 (6)可同時顯示多種標(biāo)記物。三色同顯，雙標(biāo)、三標(biāo)(三個獨(dú)立的PMT)定量熒光測定，細(xì)胞內(nèi)離子測定，細(xì)胞間通訊的研究，神經(jīng)細(xì)胞和細(xì)胞器的三維圖像重組等等。樣品(對樣本內(nèi)焦平面上的第一點(diǎn)進(jìn)行掃描)焦平面上的光(一) HRP+ICC(二)