核酸的制備實用教案

1、一、凝膠電泳-Gel electrophoresis瓊脂糖凝膠電泳變性(binxng)瓊脂糖凝膠電泳脈沖場凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳第1頁/共118頁第一頁，共119頁。1，瓊脂糖凝膠電泳一般性檢測采用瓊脂糖凝膠電泳：SAGE-submerged agarose gel electrophoresis核酸樣品從負(fù)極(fj)向正極移動。Nucleic acid samples placed in the gel will migrate towards the positive eletrode from negative electrode in horizontal direction. 第

2、2頁/共118頁第二頁，共119頁。第3頁/共118頁第三頁，共119頁。在中性在中性pHpH條件下，核酸帶負(fù)電荷，主要來自條件下，核酸帶負(fù)電荷，主要來自(li (li z)z)磷酸二酯鍵骨架上的磷酸基團(tuán)。磷酸二酯鍵骨架上的磷酸基團(tuán)。Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. multiple negative charges due multiple negative charges due toto the the phosphate groups on

3、the phosphodiester phosphate groups on the phosphodiester backbone.backbone.第4頁/共118頁第四頁，共119頁。樣品的分離效果與凝膠基質(zhì)的孔隙度有關(guān)。隨樣品的分離效果與凝膠基質(zhì)的孔隙度有關(guān)。隨DNADNA分子增大，凝分子增大，凝膠濃度應(yīng)降低。膠濃度應(yīng)降低。瓊脂糖凝膠可以分離長度為瓊脂糖凝膠可以分離長度為100bp100bp至至60kb60kb的的DNADNA分子。分子。核酸染料核酸染料(rnlio)(rnlio)溴乙錠。紫外線觀察。溴乙錠。紫外線觀察。The degree of separation depended

4、 on the porosity of The degree of separation depended on the porosity of the matrix.the matrix.第5頁/共118頁第五頁，共119頁。第6頁/共118頁第六頁，共119頁。影響泳動率的因素：影響泳動率的因素：包括分子包括分子(fnz)(fnz)大小、電荷多少、顆粒形狀和空間構(gòu)型。大小、電荷多少、顆粒形狀和空間構(gòu)型。顆粒帶電荷的密度越大，泳動速度越快。顆粒帶電荷的密度越大，泳動速度越快。顆粒物理形狀越大，與支持物介質(zhì)摩擦力越大，泳動速度顆粒物理形狀越大，與支持物介質(zhì)摩擦力越大，泳動速度越小。越小。第7頁

5、/共118頁第七頁，共119頁。對于線性雙鏈對于線性雙鏈DNADNA分子，在凝膠電泳中，相對分子質(zhì)量的常用分子，在凝膠電泳中，相對分子質(zhì)量的常用對數(shù)與泳動率成反比關(guān)系。對數(shù)與泳動率成反比關(guān)系。利用利用DNADNA分子長度（分子長度（bpbp）的負(fù)對數(shù)與泳動距離）的負(fù)對數(shù)與泳動距離(jl)(jl)作圖，可作圖，可以方便準(zhǔn)確地測定以方便準(zhǔn)確地測定DNADNA片段的分子量。片段的分子量。第8頁/共118頁第八頁，共119頁。構(gòu)型相同、但相對分子質(zhì)量不同的DNA片段泳動速度不一樣，在電泳過程中可以(ky)彼此分開。相對分子質(zhì)量相同的DNA分子如果它們的空間構(gòu)型不同，其遷移率也不同。質(zhì)粒DNA存在閉環(huán)（

6、型，CC）、單鏈開環(huán)（型，OC）和線性（型，L）三種構(gòu)型，三者之間的遷移率一般為型 型 型第9頁/共118頁第九頁，共119頁。以以pUC19質(zhì)粒為例，有超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒質(zhì)粒為例，有超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（covalently closed circular DNA, 簡稱簡稱(jinchng)cccDNA）、共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒）、共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA一條單鏈一條單鏈斷裂的開環(huán)質(zhì)粒斷裂的開環(huán)質(zhì)粒DNA（open circular DNA, 簡稱簡稱(jinchng)ocDNA）、共價）、共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA兩條單鏈斷裂的線性質(zhì)粒兩條單鏈斷裂的線性質(zhì)粒DNA（lin

7、ear DNA, 簡稱簡稱(jinchng)L DNA）三種構(gòu)型。）三種構(gòu)型。電泳時電泳時cccDNA移動最快，其次為線性移動最快，其次為線性DNA，開環(huán)質(zhì)粒，開環(huán)質(zhì)粒DNA最慢，所以電泳最慢，所以電泳結(jié)果為三條分開的帶。結(jié)果為三條分開的帶。限制性酶切的質(zhì)粒限制性酶切的質(zhì)粒DNA為線性分子。為線性分子。第10頁/共118頁第十頁，共119頁。第11頁/共118頁第十一頁，共119頁。 M 1 2 3 21kb 5.1 4.9 4.2 3.5 2.0 1.9 1.5 1.3 0.94 0.83 M：DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物（相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物（marker）；）；1：pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒DNA經(jīng)經(jīng)

8、EcoR完全完全酶切；酶切；2：pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒DNA經(jīng)經(jīng)EcoR部分部分(b fen)酶切；酶切；3：未酶切的：未酶切的pUC19質(zhì)粒質(zhì)粒DNA，提，提取結(jié)果好時，為一條帶，以超取結(jié)果好時，為一條帶，以超螺旋質(zhì)粒螺旋質(zhì)粒DNA為主，有時結(jié)果為主，有時結(jié)果為三條帶，從下向上分別為超為三條帶，從下向上分別為超螺旋質(zhì)粒、線性質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)螺旋質(zhì)粒、線性質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)粒。粒。第12頁/共118頁第十二頁，共119頁。通常采用的緩沖體系有通常采用的緩沖體系有3 3種：種：Tris.Tris.乙酸乙酸(y sun)(y sun)（TAETAE）、）、Tris.Tris.硼酸（硼酸（TBETBE）和）和Tr

9、is.Tris.磷酸（磷酸（TPETPE）。）。TAETAE緩沖能力很低，長時間電泳會導(dǎo)致電泳槽陰極變?yōu)閴A性，緩沖能力很低，長時間電泳會導(dǎo)致電泳槽陰極變?yōu)閴A性，陽極變?yōu)樗嵝?，從而使緩沖能力降低。陽極變?yōu)樗嵝?，從而使緩沖能力降低。第13頁/共118頁第十三頁，共119頁。瓊脂糖凝膠電泳的分辨力較低，但它操作簡便、應(yīng)用范圍廣、瓊脂糖凝膠電泳的分辨力較低，但它操作簡便、應(yīng)用范圍廣、適合于較大分子的分析。適合于較大分子的分析。DNADNA分子在電泳后短時間內(nèi)位置可以保持不變，該技術(shù)分子在電泳后短時間內(nèi)位置可以保持不變，該技術(shù)(jsh)(jsh)已成為已成為DNADNA、RNARNA分離和檢測的重要手段

10、。分離和檢測的重要手段。TBETBE與與TPETPE均有較強(qiáng)的緩沖能力，但從均有較強(qiáng)的緩沖能力，但從TPETPE凝膠回收的凝膠回收的DNADNA片段中片段中含有較高的磷酸鹽，容易與含有較高的磷酸鹽，容易與DNADNA一起沉淀，進(jìn)而影響一些酶反應(yīng)，一起沉淀，進(jìn)而影響一些酶反應(yīng)，如限制性酶切反應(yīng)。如限制性酶切反應(yīng)。第14頁/共118頁第十四頁，共119頁。瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 %分離范圍分離范圍 kb0.35600.61200.70.8100.90.571.20.40.12不同濃度的瓊脂糖凝膠可分離線性不同濃度的瓊脂糖凝膠可分離線性DNADNA分子的有效分子的有效(yuxio

11、)(yuxio)范圍范圍（指能夠清楚地分開）（指能夠清楚地分開）第15頁/共118頁第十五頁，共119頁。2 2，變性瓊脂糖凝膠電泳，變性瓊脂糖凝膠電泳RNARNA分子在變性瓊脂糖凝膠中可以按大小不同分子在變性瓊脂糖凝膠中可以按大小不同(b tn)(b tn)而相互而相互分開。分開。變性指利用變性劑破壞變性指利用變性劑破壞RNARNA的二級結(jié)構(gòu)，消除二級結(jié)構(gòu)對電泳的二級結(jié)構(gòu)，消除二級結(jié)構(gòu)對電泳遷移率的影響，使遷移率的影響，使RNARNA分子的泳動由分子大小來決定。分子的泳動由分子大小來決定。常用的變性劑有甲醛、乙二醛和二甲基亞砜等。常用的變性劑有甲醛、乙二醛和二甲基亞砜等。 第16頁/共118

12、頁第十六頁，共119頁。變性凝膠也可以檢測DNA分子的堿基變異(biny)：恒定變性凝膠電泳，CDGE瞬時溫度梯度凝膠電泳，TTGE溫度梯度凝膠電泳，TGGE第17頁/共118頁第十七頁，共119頁。3 3，脈沖場瓊脂糖凝膠電泳，脈沖場瓊脂糖凝膠電泳大分子大分子DNADNA在電場作用下擠過孔徑在電場作用下擠過孔徑(kngjng)(kngjng)小于分子大小于分子大小的凝膠時，將會改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場方向伸直，小的凝膠時，將會改變無規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場方向伸直，與電場平行，這樣才能通過凝膠。與電場平行，這樣才能通過凝膠。這時大分子通過凝膠的方式均相同，遷移率無差別，不能這時大分子通過凝膠的

13、方式均相同，遷移率無差別，不能達(dá)到分離的目的。達(dá)到分離的目的。第18頁/共118頁第十八頁，共119頁。當(dāng)電場方向改變時，電場內(nèi)的當(dāng)電場方向改變時，電場內(nèi)的DNADNA分子構(gòu)象分子構(gòu)象(u (u xin)xin)也發(fā)生改變，并重新定向，沿新的方向伸直也發(fā)生改變，并重新定向，沿新的方向伸直. .其轉(zhuǎn)向時間與其粘彈性弛豫時間有關(guān)，并顯著地依賴其轉(zhuǎn)向時間與其粘彈性弛豫時間有關(guān)，并顯著地依賴于分子大小。于分子大小。DNADNA分子越大，這種構(gòu)象分子越大，這種構(gòu)象(u xin)(u xin)改變需要的時間改變需要的時間越長。越長。第19頁/共118頁第十九頁，共119頁。在脈沖場瓊脂糖凝膠電泳中，DNA

14、DNA分子在兩個不同方向的均一或不均一電場中不斷(bdun)(bdun)隨電場方向改變分子本身的構(gòu)象，并擠過凝膠。第20頁/共118頁第二十頁，共119頁。DNADNA分子構(gòu)象分子構(gòu)象(u xin)(u xin)改變時間小于脈沖電場周期，改變時間小于脈沖電場周期，DNADNA分子便可以按其分子大小，得到較好的分離效果；分子便可以按其分子大小，得到較好的分離效果；反之，反之，DNADNA分子變換時間大于脈沖電場周期，則凝膠中分子變換時間大于脈沖電場周期，則凝膠中DNADNA分子松弛變形與電場更替時間不相等，達(dá)不到分離目的。分子松弛變形與電場更替時間不相等，達(dá)不到分離目的。 第21頁/共118頁第

15、二十一頁，共119頁。Pulsed-field gel electrophoresis, PFGEField inversion gel electrophoresis, FIGE, 電場倒轉(zhuǎn)凝膠電場倒轉(zhuǎn)凝膠電泳電泳Contour-clamped homogeneous eletric field gel electrophoresis, CHEF, 鉗位均勻電場電泳鉗位均勻電場電泳 六邊形排列的點電極六邊形排列的點電極(dinj)，長而平行的電極，長而平行的電極(dinj)對形成勻強(qiáng)電場對形成勻強(qiáng)電場(夾角夾角120)。 第22頁/共118頁第二十二頁，共119頁。4 4，聚丙烯酰胺凝膠電泳

16、（，聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）聚丙烯酰胺凝膠是一種聚丙烯酰胺凝膠是一種(y zhn)(y zhn)人工合成的凝膠，人工合成的凝膠，由丙烯酰胺單體和甲叉丙烯酰胺在催化劑過硫酸胺和由丙烯酰胺單體和甲叉丙烯酰胺在催化劑過硫酸胺和加速劑加速劑TEMEDTEMED的作用下聚合而成。的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠可分離聚丙烯酰胺凝膠可分離5-500bp5-500bp的小片段的小片段DNADNA分子，所分子，所以手工測序一般只能讀出以手工測序一般只能讀出500500個堿基。個堿基。第23頁/共118頁第二十三頁，共119頁。聚合時，由丙烯酰胺單體聚合成鏈狀物，由交聯(lián)劑甲叉聚合時，由丙烯酰胺單體

17、聚合成鏈狀物，由交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺將鏈與鏈交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成不溶于水的凝膠。雙丙烯酰胺將鏈與鏈交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成不溶于水的凝膠。根據(jù)待分離物質(zhì)根據(jù)待分離物質(zhì)(wzh)(wzh)的分子大小，應(yīng)選用合適的凝的分子大小，應(yīng)選用合適的凝膠濃度。膠濃度。第24頁/共118頁第二十四頁，共119頁。 被分離被分離(fnl)物質(zhì)與凝膠濃度之間的關(guān)系物質(zhì)與凝膠濃度之間的關(guān)系被分離物質(zhì)被分離物質(zhì)被分離物的相對分子被分離物的相對分子質(zhì)量質(zhì)量適用的凝膠濃度適用的凝膠濃度蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)10520%30%15%20%1015%5%10%2%-5%核核 酸酸104104 105105 210815%20%5%10%2%2.6

18、%第25頁/共118頁第二十五頁，共119頁。最常用的蛋白質(zhì)分離體系為最常用的蛋白質(zhì)分離體系為pH8.9pH8.9的堿性緩沖液體系的堿性緩沖液體系. .因為因為(yn wi)(yn wi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點略偏酸性或中大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點略偏酸性或中性，在性，在pH8.9pH8.9的堿性緩沖體系中帶負(fù)電荷，向正極移的堿性緩沖體系中帶負(fù)電荷，向正極移動。動。第26頁/共118頁第二十六頁，共119頁。在有些情況下，需要在緩沖體系中加入解離劑，將分子內(nèi)在有些情況下，需要在緩沖體系中加入解離劑，將分子內(nèi)的非共價鍵破壞，這種體系稱為解離體系。的非共價鍵破壞，這種體系稱為解離體系。常用的解離劑有常用的

19、解離劑有SDSSDS、尿素等，它們同時、尿素等，它們同時(tngsh)(tngsh)也是某也是某些蛋白質(zhì)（如膜蛋白）的促溶劑。些蛋白質(zhì)（如膜蛋白）的促溶劑。解離劑可以減弱分子空間構(gòu)象的差別，有利于了解分子的解離劑可以減弱分子空間構(gòu)象的差別，有利于了解分子的大小與遷移率之間的關(guān)系。大小與遷移率之間的關(guān)系。 第27頁/共118頁第二十七頁，共119頁。PAGEPAGE分為連續(xù)電泳體系和不連續(xù)電泳體系。分為連續(xù)電泳體系和不連續(xù)電泳體系。連續(xù)電泳體系指整個電泳體系中的緩沖液、連續(xù)電泳體系指整個電泳體系中的緩沖液、pHpH值和凝膠孔值和凝膠孔徑大小徑大小(dxio)(dxio)相同，主要用于核酸分析。相

20、同，主要用于核酸分析。第28頁/共118頁第二十八頁，共119頁。不連續(xù)電泳體系不連續(xù)電泳體系(tx)(tx)中，除了電泳槽中的緩沖體系中，除了電泳槽中的緩沖體系(tx)(tx)和和pHpH值與凝膠中不同外，凝膠本身也由緩沖體系值與凝膠中不同外，凝膠本身也由緩沖體系(tx)(tx)、pHpH值和凝膠孔徑不同的兩種凝膠堆積而成，該體系值和凝膠孔徑不同的兩種凝膠堆積而成，該體系(tx)(tx)主要主要用于蛋白質(zhì)樣品的分離。用于蛋白質(zhì)樣品的分離。不連續(xù)電泳體系不連續(xù)電泳體系(tx)(tx)制膠比較麻煩，但它對樣品有高效濃制膠比較麻煩，但它對樣品有高效濃縮效應(yīng)，可以大大提高分辨能力。縮效應(yīng)，可以大大提

21、高分辨能力。第29頁/共118頁第二十九頁，共119頁。蛋白質(zhì)分子的分離鑒定采用不連續(xù)電泳體系進(jìn)行，在蛋白質(zhì)分子的分離鑒定采用不連續(xù)電泳體系進(jìn)行，在電泳時除具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)外，還有濃縮效電泳時除具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)外，還有濃縮效應(yīng)。應(yīng)。濃縮效應(yīng)主要濃縮效應(yīng)主要(zhyo)(zhyo)在濃縮膠中完成，濃縮膠在濃縮膠中完成，濃縮膠pHpH為為6.96.9。第30頁/共118頁第三十頁，共119頁。在濃縮膠中，蛋白質(zhì)樣品在快慢離子間被濃縮形成一狹在濃縮膠中，蛋白質(zhì)樣品在快慢離子間被濃縮形成一狹小的中間層，并按其蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷量多少小的中間層，并按其蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷量多少(dusho)(

22、dusho)依次排列成帶。依次排列成帶。濃縮的樣品進(jìn)入分離膠后，膠的孔徑變小，濃縮的樣品進(jìn)入分離膠后，膠的孔徑變小，pHpH值升高，值升高，電場強(qiáng)度恒定，蛋白質(zhì)的分離取決于它們的電荷性質(zhì)、電場強(qiáng)度恒定，蛋白質(zhì)的分離取決于它們的電荷性質(zhì)、分子大小和形狀。分子大小和形狀。第31頁/共118頁第三十一頁，共119頁。SDS-PAGESDS-PAGE可用于蛋白質(zhì)分子量的測定可用于蛋白質(zhì)分子量的測定SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，在溶液中能（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，在溶液中能與蛋白質(zhì)分子的疏水部分定量結(jié)合，把大多數(shù)蛋白質(zhì)拆分成與蛋白質(zhì)分子的疏水部分定量結(jié)合，把大多數(shù)蛋白質(zhì)拆

23、分成亞單位，變成線狀，并帶上陰離子。這些亞單位，變成線狀，并帶上陰離子。這些(zhxi)(zhxi)陰離子陰離子掩蓋了蛋白質(zhì)分子本身所帶的電荷差異。掩蓋了蛋白質(zhì)分子本身所帶的電荷差異。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳消除了電荷效應(yīng)，只有分子篩效應(yīng)，聚丙烯酰胺凝膠電泳消除了電荷效應(yīng)，只有分子篩效應(yīng)，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子量，遷移率與分子量對蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子量，遷移率與分子量對數(shù)呈線性關(guān)系。數(shù)呈線性關(guān)系。第32頁/共118頁第三十二頁，共119頁。用于核酸分離的聚丙烯酰胺凝膠的緩沖體系是連續(xù)體系，用于核酸分離的聚丙烯酰胺凝膠的緩沖體系是連續(xù)體系，主要分離較小的核酸（主要

24、分離較小的核酸（5-500bp5-500bp），遷移率與分子大小），遷移率與分子大小(dxio)(dxio)和構(gòu)型（如線性、缺口環(huán)化、超螺旋）有關(guān)。和構(gòu)型（如線性、缺口環(huán)化、超螺旋）有關(guān)。如果樣品中所有的如果樣品中所有的DNADNA分子均為線性分子，可用遷移率比較分子均為線性分子，可用遷移率比較其大小其大小(dxio)(dxio)（以標(biāo)準(zhǔn)核酸片段作標(biāo)準(zhǔn)對照）。（以標(biāo)準(zhǔn)核酸片段作標(biāo)準(zhǔn)對照）。第33頁/共118頁第三十三頁，共119頁。核酸序列測定采用核酸序列測定采用(ciyng)(ciyng)以尿素為解離劑的聚丙烯酰胺以尿素為解離劑的聚丙烯酰胺凝膠。凝膠。 第34頁/共118頁第三十四頁，共11

25、9頁。二、核酸的序列二、核酸的序列(xli)(xli)測定測定DNA sequencingDNA sequencing基本原理：將基本原理：將DNADNA的序列的序列(xli)(xli)測定轉(zhuǎn)化為測定轉(zhuǎn)化為DNADNA片段的長度分析。片段的長度分析。第35頁/共118頁第三十五頁，共119頁。1 1，化學(xué)法測序，化學(xué)法測序-Maxam-Gilbert (chemical) sequencing-Maxam-Gilbert (chemical) sequencing Allan Maxam and Walter Gilbert Allan Maxam and Walter Gilbert （19

26、771977） 用化學(xué)物質(zhì)在特定堿基位置斷裂用化學(xué)物質(zhì)在特定堿基位置斷裂(dun li)DNA(dun li)DNA分子，產(chǎn)生分子，產(chǎn)生總體上只差一個堿基的一套總體上只差一個堿基的一套DNADNA片段。片段。chemicals are used chemicals are used toto cleave the DNA at certain cleave the DNA at certain positions, generating a set of fragments that differ positions, generating a set of fragments that di

27、ffer by one nucleotide.by one nucleotide.第36頁/共118頁第三十六頁，共119頁。DNADNA片段的一條鏈在片段的一條鏈在5 5 端用端用32P32P標(biāo)記。標(biāo)記。然后進(jìn)行特定的化學(xué)修飾然后進(jìn)行特定的化學(xué)修飾(xish)(xish)。將修飾將修飾(xish)(xish)的堿基從脫氧核糖分子上除去后用哌啶斷的堿基從脫氧核糖分子上除去后用哌啶斷裂（裂（piperidinepiperidine）。）。 The reaction conditions are chosen so that,on The reaction conditions are chose

28、n so that,on average, only one modification will be introduced average, only one modification will be introduced into each copy of the DNA o each copy of the DNA molecule.第37頁/共118頁第三十七頁，共119頁?；瘜W(xué)法使用特異的化學(xué)試劑修飾化學(xué)法使用特異的化學(xué)試劑修飾DNADNA分子中的不同堿基，然后分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷多核苷酸鏈；用哌啶切斷多核苷酸鏈；通過四組不同的特異反應(yīng)，就可以將末

29、端（通過四組不同的特異反應(yīng)，就可以將末端（3-3-或或5-5-端）端）帶有放射性標(biāo)記的帶有放射性標(biāo)記的DNADNA分子切成不同長度的寡核苷酸片段。分子切成不同長度的寡核苷酸片段。這些這些(zhxi)(zhxi)寡核苷酸的長度相當(dāng)于從特異反應(yīng)引起的切點寡核苷酸的長度相當(dāng)于從特異反應(yīng)引起的切點到標(biāo)記末端之間的長度。到標(biāo)記末端之間的長度。第38頁/共118頁第三十八頁，共119頁。用分辨力極高的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將這些不同用分辨力極高的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將這些不同長度長度(chngd)(chngd)的寡核苷酸片段分離開來并進(jìn)行自顯影的寡核苷酸片段分離開來并進(jìn)行自顯影。在四組反應(yīng)中，整體上相鄰

30、的兩條帶僅相差一個堿基在四組反應(yīng)中，整體上相鄰的兩條帶僅相差一個堿基，由此可讀出所測定的，由此可讀出所測定的DNADNA的序列。的序列。第39頁/共118頁第三十九頁，共119頁。G G反應(yīng)反應(yīng) 用硫酸二甲脂（用硫酸二甲脂（dimethyl sulfatedimethyl sulfate，簡稱，簡稱DMSDMS）使鳥嘌）使鳥嘌呤上的呤上的N7N7原子甲基化。原子甲基化。甲基化的鳥嘌呤與脫氧戊糖之間的糖苷鍵在中性環(huán)境甲基化的鳥嘌呤與脫氧戊糖之間的糖苷鍵在中性環(huán)境(hunjng)(hunjng)中加熱而斷裂，鳥嘌呤堿基脫落，多核苷酸中加熱而斷裂，鳥嘌呤堿基脫落，多核苷酸骨架在鳥嘌呤處發(fā)生斷裂。骨架

31、在鳥嘌呤處發(fā)生斷裂。第40頁/共118頁第四十頁，共119頁。G+AG+A反應(yīng)反應(yīng)(fnyng) (fnyng) 用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤環(huán)上的嘌呤環(huán)上的N N原子質(zhì)子化，使糖苷鍵變原子質(zhì)子化，使糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使嘌呤脫落。得不穩(wěn)定，再用哌啶使嘌呤脫落。第41頁/共118頁第四十一頁，共119頁。T+CT+C反應(yīng)反應(yīng) 用肼（用肼（hydrazinehydrazine）使）使T T和和C C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去除去(ch q)(ch q)堿基。堿基。C C反應(yīng)反應(yīng) 當(dāng)有當(dāng)有NaClNaCl存在時，只有存在時，只有C C與肼發(fā)生反應(yīng)，與肼發(fā)生反應(yīng)，

32、T T不發(fā)生反不發(fā)生反應(yīng)。斷裂的應(yīng)。斷裂的C C可用哌啶除去可用哌啶除去(ch q)(ch q)。哌啶也可使脫。哌啶也可使脫去堿基處的磷酸二酯鍵斷裂。去堿基處的磷酸二酯鍵斷裂。 第42頁/共118頁第四十二頁，共119頁。上述四組反應(yīng)中，應(yīng)控制時間只讓很小一部分堿基被修飾上述四組反應(yīng)中，應(yīng)控制時間只讓很小一部分堿基被修飾(xish)(xish)，這樣在一種，這樣在一種DNADNA分子形成的群體中，每個相關(guān)位點都分子形成的群體中，每個相關(guān)位點都有可能被切斷形成一種末端帶標(biāo)記的寡核苷酸片段。有可能被切斷形成一種末端帶標(biāo)記的寡核苷酸片段。但用哌啶切斷鏈的反應(yīng)必須是定量的。但用哌啶切斷鏈的反應(yīng)必須是定

33、量的。第43頁/共118頁第四十三頁，共119頁。反應(yīng)完畢后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳反應(yīng)完畢后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳（7mol/L7mol/L尿素，尿素，8%8%膠）進(jìn)行分析。膠）進(jìn)行分析。電泳時電壓在電泳時電壓在4000V4000V左右，凝膠的溫度保持在左右，凝膠的溫度保持在6565，以保證以保證DNADNA在變性狀態(tài)下進(jìn)行電泳。在變性狀態(tài)下進(jìn)行電泳。電泳完畢后，將膠抽干電泳完畢后，將膠抽干(chu n)(chu n)，進(jìn)行放射自顯影，進(jìn)行放射自顯影，從膠片上可讀出從膠片上可讀出DNADNA序列。序列。 第44頁/共118頁第四十四頁，共119頁。圖圖 化學(xué)法測定化學(xué)法測定DN

34、ADNA序列時的序列時的G G反應(yīng)反應(yīng)(fnyng)(fnyng)（A A）和化學(xué)法測定）和化學(xué)法測定DNADNA序列圖解（序列圖解（B B） 第45頁/共118頁第四十五頁，共119頁。第46頁/共118頁第四十六頁，共119頁。2 2，酶法測序，酶法測序Sanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencingSanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing Frederick Sanger and Alan CoulsonFrederick Sanger and Alan CoulsonKlenow f

35、ragment, Klenow fragment, single-stranded DNA, single-stranded DNA, a primera primerddNTPs-dideoxynucleoside triphosphatesddNTPs-dideoxynucleoside triphosphatesdNTPs,-dNTPs,-3535SATPSATP第47頁/共118頁第四十七頁，共119頁。用用M13M13噬菌體載體噬菌體載體(zit)(zit)制備單鏈制備單鏈DNADNA。DNA molecule was cloned into a vector such as the

36、 DNA molecule was cloned into a vector such as the bacteriophage M13 bacteriophage M13 toto produce single-stranded DNA. produce single-stranded DNA. 第48頁/共118頁第四十八頁，共119頁。測序膠測序膠-6-20% polyacrylamide6-20% polyacrylamide7M urea7M urea which acts as a which acts as a denaturantdenaturant to to reduce

37、the effects of DNA reduce the effects of DNA secondary secondary structure.structure.第49頁/共118頁第四十九頁，共119頁。英國生物化學(xué)家英國生物化學(xué)家F. SangerF. Sanger（19181918）第一個完成）第一個完成(wn chng)(wn chng)了了胰島素的氨基酸序列測定。胰島素的氨基酸序列測定。1919世紀(jì)前葉人們就知道蛋白質(zhì)，并了解其水解產(chǎn)物中有一些氨基世紀(jì)前葉人們就知道蛋白質(zhì)，并了解其水解產(chǎn)物中有一些氨基酸。酸。到了到了2020世紀(jì)初，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是氨基酸通過肽鍵連接而成的世

38、紀(jì)初，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是氨基酸通過肽鍵連接而成的長鏈，長鏈，19401940時基本弄清了組成蛋白質(zhì)的時基本弄清了組成蛋白質(zhì)的2020種不同氨基酸，但對于種不同氨基酸，但對于這些氨基酸在蛋白質(zhì)中如何排列一無所知。這些氨基酸在蛋白質(zhì)中如何排列一無所知。SangerSanger從從19451945年起，選擇當(dāng)時已知的最小蛋白質(zhì)胰島素作為研究年起，選擇當(dāng)時已知的最小蛋白質(zhì)胰島素作為研究對象，經(jīng)過十年的艱苦奮斗，終于測出了牛胰島素所含的對象，經(jīng)過十年的艱苦奮斗，終于測出了牛胰島素所含的5151個氨個氨基酸的排列順序，于基酸的排列順序，于19581958年獲得第一個諾貝爾獎。年獲得第一個諾貝爾獎。第50頁

39、/共118頁第五十頁，共119頁。雙脫氧法（雙脫氧法（dideoxy methoddideoxy method），也稱酶法（），也稱酶法（enzyme enzyme methodmethod）或鏈終止法（）或鏈終止法（the chain termination the chain termination methodmethod），由），由SangerSanger于于19771977年建立。年建立。以以35P35P、35S35S替代替代32P32P作為標(biāo)記物。作為標(biāo)記物。該方法的原理是利用該方法的原理是利用(lyng)2,3-(lyng)2,3-雙脫氧核苷三雙脫氧核苷三磷酸（磷酸（2,3-dd

40、NTP2,3-ddNTP，dideoxynucleotide dideoxynucleotide ）來終）來終止止DNADNA的復(fù)制反應(yīng)。的復(fù)制反應(yīng)。第51頁/共118頁第五十一頁，共119頁。DNADNA聚合酶（如聚合酶（如KlenowKlenow片段）在片段）在DNADNA復(fù)制過程中催化多核苷復(fù)制過程中催化多核苷酸鏈的延伸，單核苷酸被連接在延伸鏈的酸鏈的延伸，單核苷酸被連接在延伸鏈的3-OH3-OH上；上；如果摻入一個如果摻入一個(y )2,3-ddNTP(y )2,3-ddNTP，延伸反應(yīng)就會停止，延伸反應(yīng)就會停止。第52頁/共118頁第五十二頁，共119頁。根據(jù)這一原理設(shè)計四組反應(yīng)，每

41、組反應(yīng)中都含有根據(jù)這一原理設(shè)計四組反應(yīng)，每組反應(yīng)中都含有(hn yu):(hn yu):正常的四種脫氧核苷酸正常的四種脫氧核苷酸dNTPdNTP（其中一種帶有（其中一種帶有32P32P標(biāo)記）標(biāo)記）單鏈單鏈DNADNA模板（即待測模板（即待測DNADNA，一般通過，一般通過M13M13絲狀噬菌體制備）絲狀噬菌體制備）DNADNA聚合酶聚合酶I I引物（可以根據(jù)載體序列人工合成）引物（可以根據(jù)載體序列人工合成）另外每一組反應(yīng)還加入一種另外每一組反應(yīng)還加入一種2,3-ddNTP2,3-ddNTP。也可以標(biāo)記引物或也可以標(biāo)記引物或ddNTP.ddNTP.第53頁/共118頁第五十三頁，共119頁。以以

42、A A管為例，凡聚合反應(yīng)進(jìn)行到模板的管為例，凡聚合反應(yīng)進(jìn)行到模板的T T堿基時，堿基時，2-dATP2-dATP和和2,3-ddATP2,3-ddATP都有可能摻入都有可能摻入. .如果如果(rgu)(rgu)摻入摻入2-dATP2-dATP，聚合反應(yīng)可以繼續(xù)進(jìn)行。，聚合反應(yīng)可以繼續(xù)進(jìn)行。如果如果(rgu)(rgu)摻入摻入2,3-ddATP2,3-ddATP，鏈延伸反應(yīng)即告終止，這樣，鏈延伸反應(yīng)即告終止，這樣在反應(yīng)產(chǎn)物中就會產(chǎn)生末端為在反應(yīng)產(chǎn)物中就會產(chǎn)生末端為A A的單鏈的單鏈DNADNA片段群體。片段群體。第54頁/共118頁第五十四頁，共119頁。將四組反應(yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳進(jìn)行分析，在整體

43、上四個泳道中自將四組反應(yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳進(jìn)行分析，在整體上四個泳道中自顯影產(chǎn)生的相鄰條帶只有一個堿基的差異，由此可讀出顯影產(chǎn)生的相鄰條帶只有一個堿基的差異，由此可讀出DNADNA的序的序列。列。應(yīng)用應(yīng)用35S35S標(biāo)記的標(biāo)記的dNTPdNTP替代替代32P32P標(biāo)記的標(biāo)記的dNTPdNTP，電泳圖譜更加，電泳圖譜更加(gnji)(gnji)清晰，分辨力更高，每次實驗可以讀出更多的堿基序清晰，分辨力更高，每次實驗可以讀出更多的堿基序列。列。第55頁/共118頁第五十五頁，共119頁。目前雙脫氧測序反應(yīng)一般利用雙鏈目前雙脫氧測序反應(yīng)一般利用雙鏈DNADNA模板通過聚合酶鏈?zhǔn)椒茨０逋ㄟ^聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)

44、行，并采用四種不同顏色的熒光素分別標(biāo)記四種雙脫氧應(yīng)進(jìn)行，并采用四種不同顏色的熒光素分別標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸。核苷酸。這使得四組測序反應(yīng)可以在一個這使得四組測序反應(yīng)可以在一個EppendorfEppendorf管進(jìn)行，分析管進(jìn)行，分析(fnx)(fnx)時通過毛細(xì)管電泳在時通過毛細(xì)管電泳在DNADNA自動測序儀即可讀出相應(yīng)的自動測序儀即可讀出相應(yīng)的DNADNA序列。序列。 第56頁/共118頁第五十六頁，共119頁。第57頁/共118頁第五十七頁，共119頁。基本的原理為基本的原理為DNADNA聚合酶不能區(qū)分聚合酶不能區(qū)分dNTPdNTP和和ddNTPddNTP，一旦，一旦ddNTPddNTP被

45、作為底物連接至被作為底物連接至新生新生(xnshng)(xnshng)鏈，鏈，DNADNA的延伸合成會終止，從而產(chǎn)生單鏈的的延伸合成會終止，從而產(chǎn)生單鏈的DNADNA片段；片段；由于存在很多模板分子，以及由于存在很多模板分子，以及dNTPdNTP和和ddNTPddNTP連接的隨機(jī)性，連接的隨機(jī)性，DNADNA合成反應(yīng)可以合成反應(yīng)可以在任一堿基位置終止。在任一堿基位置終止。經(jīng)過一段時間后可得到一個不同長度的單鏈經(jīng)過一段時間后可得到一個不同長度的單鏈DNADNA群體，電泳時它們可以按大小群體，電泳時它們可以按大小分開，并且相鄰條帶之間僅差一個堿基。分開，并且相鄰條帶之間僅差一個堿基。從膠的下面開始

46、向上可以讀出從膠的下面開始向上可以讀出DNADNA分子的核苷酸序列。越靠近引物端的位置產(chǎn)分子的核苷酸序列。越靠近引物端的位置產(chǎn)生的片段越小。生的片段越小。第58頁/共118頁第五十八頁，共119頁。鏈終止法中用于測序的鏈終止法中用于測序的DNADNA聚合酶必須滿足聚合酶必須滿足3 3個條件：個條件：高酶活性，即與模板結(jié)合能力高酶活性，即與模板結(jié)合能力(nngl)(nngl)強(qiáng)，可合成足夠長的強(qiáng)，可合成足夠長的DNADNA單鏈；單鏈；無無5 5 33 外切核酸酶活性，外切核酸酶活性，5 5 33 核酸酶活性可將新合成的核酸酶活性可將新合成的DNADNA鏈的鏈的5 5 端除去，改變合成產(chǎn)物的長度，

47、給順序的閱讀造端除去，改變合成產(chǎn)物的長度，給順序的閱讀造成誤差；成誤差；第59頁/共118頁第五十九頁，共119頁。無無3 3 55 外切酶活性，原因與相同。外切酶活性，原因與相同。所以用于測序的所以用于測序的DNADNA聚合酶都經(jīng)過了人工的修飾。聚合酶都經(jīng)過了人工的修飾。第一個用于測序的第一個用于測序的DNADNA聚合酶為聚合酶為KlenowKlenow片段，不具有片段，不具有5 5 33 外切酶活性，外切酶活性，但僅能合成長約但僅能合成長約250250個核苷酸的個核苷酸的DNADNA分子，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，會分子，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，會形成一些陰影形成一些陰影(ynyng)(yn

48、yng)條帶，說明有許多終止反應(yīng)由酶活性造成。條帶，說明有許多終止反應(yīng)由酶活性造成?，F(xiàn)在廣泛采用的現(xiàn)在廣泛采用的DNADNA聚合酶由聚合酶由T7T7噬菌體編碼，又稱噬菌體編碼，又稱sequenasesequenase，即測序酶。，即測序酶。SequenaseSequenase工作效率高，無外切酶活性。工作效率高，無外切酶活性。第60頁/共118頁第六十頁，共119頁。第61頁/共118頁第六十一頁，共119頁。第62頁/共118頁第六十二頁，共119頁。鏈終止法測序時可通過以下幾種方法制備模板：鏈終止法測序時可通過以下幾種方法制備模板：插入質(zhì)粒載體的雙鏈插入質(zhì)粒載體的雙鏈DNADNA，可以采用

49、堿變性，可以采用堿變性(binxng)(binxng)或熱變性或熱變性(binxng)(binxng)使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNADNA變?yōu)閱捂?，能夠進(jìn)行雙向測序；變?yōu)閱捂湥軌蜻M(jìn)行雙向測序；用用M13M13載體制備單鏈載體制備單鏈DNAM13DNAM13載體是根據(jù)復(fù)制型載體是根據(jù)復(fù)制型M13M13基因組改進(jìn)的基因組改進(jìn)的雙鏈雙鏈DNADNA，可以和質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，用它感染宿主菌可產(chǎn)生單鏈，可以和質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，用它感染宿主菌可產(chǎn)生單鏈模板，但只能制備小片段模板，但只能制備小片段DNADNA；第63頁/共118頁第六十三頁，共119頁。用噬菌粒（用噬菌粒（phagemidphagemid）制備單鏈）

50、制備單鏈DNADNA噬菌粒含有兩個復(fù)制起噬菌粒含有兩個復(fù)制起始位點，一個為大腸桿菌質(zhì)粒起始位點，一個是來自始位點，一個為大腸桿菌質(zhì)粒起始位點，一個是來自M13M13、fdfd等等單鏈單鏈DNADNA噬菌體基因組的復(fù)制起始點。當(dāng)大腸桿菌中同時含有噬噬菌體基因組的復(fù)制起始點。當(dāng)大腸桿菌中同時含有噬菌粒和輔助菌粒和輔助(fzh)(fzh)噬菌體時，因后者攜帶編碼噬菌體復(fù)制酶及噬菌體時，因后者攜帶編碼噬菌體復(fù)制酶及外殼蛋白的基因，因此可激活噬菌粒外殼蛋白的基因，因此可激活噬菌粒DNADNA復(fù)制，產(chǎn)生單鏈模板。復(fù)制，產(chǎn)生單鏈模板。PCRPCR產(chǎn)生單鏈模板產(chǎn)生單鏈模板兩個引物中一個連接有很小的磁珠，可用兩

51、個引物中一個連接有很小的磁珠，可用吸磁的辦法從擴(kuò)增產(chǎn)物中得到單鏈模板。不對稱吸磁的辦法從擴(kuò)增產(chǎn)物中得到單鏈模板。不對稱PCRPCR。第64頁/共118頁第六十四頁，共119頁。DNADNA聚合酶在延伸多聚核苷酸時只有聚合酶在延伸多聚核苷酸時只有(zhyu)3(zhyu)3 核苷酸核苷酸配對正確才能進(jìn)行，這可能是為何完全單鏈模板在無引配對正確才能進(jìn)行，這可能是為何完全單鏈模板在無引物時不能起始復(fù)制的原因。物時不能起始復(fù)制的原因。因為在缺少引物的情況下，聚合酶不能確定因為在缺少引物的情況下，聚合酶不能確定3 3 核苷酸核苷酸配對正確與否，無法確定下一步反應(yīng)。配對正確與否，無法確定下一步反應(yīng)。大腸桿

52、菌基因組復(fù)制時，每個岡崎片段長大腸桿菌基因組復(fù)制時，每個岡崎片段長1000-20001000-2000核核苷酸，約需苷酸，約需40004000個引物。個引物。第65頁/共118頁第六十五頁，共119頁。3 3，光點測序（，光點測序（pyrosequencingpyrosequencing）焦磷酸測序涉及焦磷酸測序涉及(shj)(shj)四種酶：四種酶：DNADNA聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）硫酸化酶硫酸化酶(ATP sulfurylase)(ATP sulfurylase)熒光素酶熒光素酶(luciferase)(luciferase)雙磷酸酶雙磷

53、酸酶(apyrase). (apyrase). 第66頁/共118頁第六十六頁，共119頁。反應(yīng)反應(yīng)(fnyng)體系體系:DNA單鏈單鏈測序引物。測序引物。dNTP反應(yīng)反應(yīng)(fnyng)底物底物:APS (adenosine 5 phosphosulfate)熒光素?zé)晒馑?luciferin)第67頁/共118頁第六十七頁，共119頁。在每一輪測序反應(yīng)中，只能加入在每一輪測序反應(yīng)中，只能加入(jir)四種四種dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一）之一;如該如該dNTP與模板配對，聚合酶就可以催化該與模板配對，聚合酶就可以催化該dNTP摻入到引摻入到引物鏈中并釋放焦磷酸基

54、團(tuán)（物鏈中并釋放焦磷酸基團(tuán)（PPi）。）。第68頁/共118頁第六十八頁，共119頁。摻入的摻入的dNTP和釋放和釋放(shfng)的焦磷酸是等摩爾數(shù)目的的焦磷酸是等摩爾數(shù)目的. dATP S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate) 是是dATP的替代物的替代物;因為因為DNA聚合酶對聚合酶對dATP S的催化效率比對的催化效率比對dATP的催化的催化效率高，且效率高，且dATP S不是熒光素酶的底物。不是熒光素酶的底物。第69頁/共118頁第六十九頁，共119頁。硫酸化酶硫酸化酶 催化催化APS和和PPi形成形成ATP，ATP和焦磷酸的摩爾和焦磷酸的摩

55、爾數(shù)目是一致的。數(shù)目是一致的。ATP驅(qū)動熒光驅(qū)動熒光(ynggung)素酶介導(dǎo)的熒光素酶介導(dǎo)的熒光(ynggung)素素向氧化熒光向氧化熒光(ynggung)素素(oxyluciferin) 的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化;氧化熒光氧化熒光(ynggung)素發(fā)出與素發(fā)出與ATP量成正比的可見光信量成正比的可見光信號。號。 第70頁/共118頁第七十頁，共119頁。光信號由光信號由CCD攝像機(jī)檢測攝像機(jī)檢測(jin c)。每個峰的高度每個峰的高度(光信號光信號)與反應(yīng)中摻入的與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。核苷酸數(shù)目成正比。 第71頁/共118頁第七十一頁，共119頁。ATP和未摻入的和未摻入的dNTP由雙磷酸

56、酶降解，淬滅光信號，并由雙磷酸酶降解，淬滅光信號，并再生反應(yīng)再生反應(yīng)(fnyng)體系。體系。然后就可以加入下一種然后就可以加入下一種dNTP。 第72頁/共118頁第七十二頁，共119頁。每次只加入一種每次只加入一種dNTP。當(dāng)反應(yīng)液中發(fā)出亮點時，可知。當(dāng)反應(yīng)液中發(fā)出亮點時，可知核苷酸已摻入，儀器可以記下反應(yīng)。核苷酸已摻入，儀器可以記下反應(yīng)。如無亮點出現(xiàn)，表明該核苷酸不與模板鏈配對，則不會如無亮點出現(xiàn)，表明該核苷酸不與模板鏈配對，則不會出現(xiàn)記錄。出現(xiàn)記錄。連續(xù)快速地依次加入，周而復(fù)始，隨著鏈的不斷延伸，連續(xù)快速地依次加入，周而復(fù)始，隨著鏈的不斷延伸，相應(yīng)相應(yīng)(xingyng)的順序也被閱讀。

57、的順序也被閱讀。第73頁/共118頁第七十三頁，共119頁。4 4，DNADNA芯片測序芯片測序?qū)⒏鞣N排列順序的寡聚核苷酸點播在面積很小的芯片上，每個點的將各種排列順序的寡聚核苷酸點播在面積很小的芯片上，每個點的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置。寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置。將待測的將待測的DNADNA分子與芯片溫浴，凡是能雜交的寡聚核苷酸都會在確分子與芯片溫浴，凡是能雜交的寡聚核苷酸都會在確定定(qudng)(qudng)的位置發(fā)出信號，然后根據(jù)獲取的信息將寡聚核苷酸的位置發(fā)出信號，然后根據(jù)獲取的信息將寡聚核苷酸的順序進(jìn)行對比組裝，拼接成完整的順序進(jìn)行對比組裝，拼接成完整DNAD

58、NA順序。順序。第74頁/共118頁第七十四頁，共119頁。根據(jù)統(tǒng)計，可測根據(jù)統(tǒng)計，可測DNADNA片段的長度片段的長度(chngd)(chngd)是芯片上排列的是芯片上排列的寡聚核苷酸數(shù)目的平方根。假如寡聚核苷酸的長度寡聚核苷酸數(shù)目的平方根。假如寡聚核苷酸的長度(chngd)(chngd)為為8 8個堿基，則其可能的排列順序為個堿基，則其可能的排列順序為48=6553648=65536，而可讀的片段長度而可讀的片段長度(chngd)(chngd)僅為僅為6553665536的平方根，等于的平方根，等于256bp256bp。即使一個芯片可容納即使一個芯片可容納10485761048576個不同

59、的個不同的1010堿基寡聚核苷酸，堿基寡聚核苷酸，可讀片段長也僅為可讀片段長也僅為1kb1kb。如果要完成如果要完成1Mb1Mb的測序，以的測序，以2020個寡聚核苷酸的數(shù)目計算，芯個寡聚核苷酸的數(shù)目計算，芯片需攜帶的組合數(shù)目將達(dá)片需攜帶的組合數(shù)目將達(dá)10121012，只有采用極微量的電子操，只有采用極微量的電子操作才能完成。作才能完成。 第75頁/共118頁第七十五頁，共119頁。5 5，自動化測序，自動化測序熒光標(biāo)記物：用四種不同的熒光染料熒光標(biāo)記物：用四種不同的熒光染料(rnlio)(rnlio)分別標(biāo)記分別標(biāo)記ddATPddATP、ddCTPddCTP、ddTTPddTTP和和ddGT

60、P-ddGTP-四色熒光標(biāo)記。四色熒光標(biāo)記。這這4 4種標(biāo)記的種標(biāo)記的ddNTPddNTP混合加入到一個反應(yīng)中，聚合反應(yīng)完成后，可以獲得末端分混合加入到一個反應(yīng)中，聚合反應(yīng)完成后，可以獲得末端分別帶有別帶有A A、C C、T T、G G標(biāo)記的標(biāo)記的DNADNA單鏈。電泳分離的單鏈單鏈。電泳分離的單鏈DNADNA條帶通過監(jiān)測儀時，條帶通過監(jiān)測儀時，發(fā)出不同顏色的熒光信號，由計算機(jī)讀出堿基順序。發(fā)出不同顏色的熒光信號，由計算機(jī)讀出堿基順序。自動測序的原理仍然為鏈終止法，但將自動測序的原理仍然為鏈終止法，但將4 4個反應(yīng)合并為一個，在一個泳道中進(jìn)個反應(yīng)合并為一個，在一個泳道中進(jìn)行電泳。行電泳。最早文