CRISPR系統(tǒng)在植物研究中的應(yīng)用

1、修豆北農(nóng)林年裝大學(xué)植物保物研究方法論文題目：現(xiàn)代技術(shù)在植物病理學(xué)中的應(yīng)用學(xué)院（系）：植物保護(hù)學(xué)院專業(yè)年級(jí)：植物病理學(xué)學(xué)生姓名：杜友偉學(xué)號(hào)：2016050129CRISPR/cas基因編輯系統(tǒng)在植物病理學(xué)中的應(yīng)用摘要：基因組定點(diǎn)編輯是利用人工核酸酶，對(duì)復(fù)雜生物基因組特定位點(diǎn)快速而精確地進(jìn)行遺傳改造的一項(xiàng)新技術(shù)。尤其是最近從細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性免疫防御反應(yīng)中改造而來(lái)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，因其簡(jiǎn)單、廉價(jià)、高效以及通用的特性，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于植物、動(dòng)物、微生物等各種生物體和細(xì)胞的基因功能和應(yīng)用研究中。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的原理在于其攜帶的Cas9核酸酶RNA導(dǎo)向的dsDNA結(jié)合蛋白，

2、能夠在靶位點(diǎn)對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，隨后引發(fā)的非同源末端連接或者同源重組修復(fù)，導(dǎo)致了靶位點(diǎn)DNA的缺失、插入、替換甚至染色體大片段重排。關(guān)鍵詞：基因，CRISPR,植物病理Abstract:Theclustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPRassociatedproteins(Cas9)systemisarecentlydevelopedgroundbreakingtechnologywhichenablestheproductionofhighlyspecificgenomemodificatio

3、nwithhighefficiencyandspecificity.TheCRISPR/Cas9systemisderivedfromtheadaptiveimmunitysysteminbacteriaandarchaeas,itusesCas9,aRNA-guidednuclease,tocreatedouble-strandbreaksinthegenomiclociofinterest.Therepairofbreaksthrougheithernon-homologousendjoiningorhomonlogousrecombinationleadstoinsertions,del

4、etions,replacementsorlargerchromosomalrearrangementsatthedesiredsitesofgenome.TheCRISPR/Cas9systemisfacile,highlyefficientandwidelyusedindiversecellsandorganisms,includingthespeciesthathavetraditionallybeenachallengeintheirgeneticmanipulations.Keywords:Gene,CRISPR,Plantdisease1 .CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)1.1

5、CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)，即一種由RNA介導(dǎo)的切割特異DNA片段的基因編輯系統(tǒng)引起了科學(xué)家們的注意。它依靠RNA引導(dǎo)序列與靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)識(shí)別目標(biāo)位點(diǎn)，僅需變化約20個(gè)核甘酸的序列就能靶向不同基因1-3。CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)源自于對(duì)細(xì)菌的免疫系統(tǒng)的研究，最早是日本科學(xué)家Nakata等4在研究大腸桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種特定的重復(fù)序列，但當(dāng)時(shí)他們還不清楚其具體功能。后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，隨后科學(xué)家正式將其定義為CRISPRo2005年，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列與噬菌體或質(zhì)粒等外源DNA序列高

6、度同源5-7。2007年，Barrangou等8發(fā)現(xiàn)改變CRISPR中的重復(fù)序列能調(diào)節(jié)嗜熱鏈球菌(StreptococcusThermophilus)對(duì)噬菌體的抗性，證實(shí)CRISPR/Cas系統(tǒng)使細(xì)菌通過(guò)獲取噬菌體DNA片段形成“記憶”，從而使細(xì)菌獲得再次遭到同一噬菌體入侵時(shí)對(duì)其免疫的能力。1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)特征CRISPR/Cas系統(tǒng)主要由CRISPR序列元件與CAS基因家族蛋白組成。CRISPR序列元件是一類獨(dú)特的DNA重復(fù)序列家族，由一些高度保守的重復(fù)序列和間隔序列相間排列組成。而CAS基因家族蛋白是CRISPR序列附近一些高度保守的相關(guān)基因編碼的蛋白酶，具有核酸酶

7、和切口酶活性，能對(duì)DNA序列進(jìn)行特異剪切和修復(fù)9。隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展，CRISPR基本結(jié)構(gòu)也逐漸為人知曉。人們發(fā)現(xiàn)已測(cè)序的細(xì)菌基因組中約有40%包含CRISPR位點(diǎn)10。不同物種間CRISPR位點(diǎn)數(shù)目與重復(fù)序列白數(shù)目也有所不同11,但均包括4種序列(重復(fù)序列、間隔序列、Cas基因編碼序列、前導(dǎo)序列)。CRISPR中的重復(fù)序列是一組長(zhǎng)度約2550個(gè)堿基對(duì)組成的短小回文序列，能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，重復(fù)次數(shù)最高可達(dá)數(shù)百次。間隔序列約為2672個(gè)堿基對(duì)，它的位置在2個(gè)重復(fù)序列之間12。CRISPR位點(diǎn)一般在細(xì)胞染色體上，也有的在質(zhì)粒中10。在CRISPR位點(diǎn)附近還存在一系列CRISPR相關(guān)基因，Cas基

8、因編碼一類高度保守的核酸相關(guān)的蛋白13。此外，在Cas基因和CRISPR位點(diǎn)第一個(gè)重復(fù)片段之間存在著CRISP所導(dǎo)序列，該序列負(fù)責(zé)啟動(dòng)CRISPR轉(zhuǎn)錄。traerRNALeadersequence圖1CRISPR基本結(jié)構(gòu)Fig.1ThebasicstructureofCRISPR1.3CRISPR/Cas系統(tǒng)工作機(jī)理CRISPR系統(tǒng)是細(xì)菌為了對(duì)抗噬菌體和其他病毒的侵染而進(jìn)化出的一套免疫系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)作用大致如下：噬菌體或其他病毒入侵后，宿主CRISPR系統(tǒng)識(shí)別外源DNA中特定的前間隔序列和前間隔序列鄰近基序。宿主將重復(fù)片段和這一段新的間隔序列整合進(jìn)入CRISPR系統(tǒng)，插入在前導(dǎo)序列和原

9、先第一個(gè)重復(fù)序列之間8,14,形成“記憶”。加工前間隔序列的具體機(jī)制尚不明確。當(dāng)同一噬菌體或病毒再次侵染時(shí)，CRISPR序列在前導(dǎo)序列引導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出前crRNA,前crRNA接著被加工成小crRNA。這些crRNA與反式激活crRNA形成一種嵌合分子，被稱為sgRNA(SingleguideRNA)。最后，在sgRNA的作用下，Cas蛋白復(fù)合體干擾入侵噬菌體DNA序列，從而使得宿主免受同一噬菌體的侵害8。CRISPR位點(diǎn)的間隔序列與細(xì)菌對(duì)特定噬菌體的抗性相關(guān)。圖2CRISPR系統(tǒng)作用機(jī)制Fig.2ThemechanismofCRISPRSystem2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用Jiang等1

10、52014年構(gòu)建了一個(gè)靶向人工合成的無(wú)功能的GFP基因的Cas9/sgRNA載體，無(wú)功能的GFP基因經(jīng)修飾后成為有功能的GFP基因，從而轉(zhuǎn)化成功的T1代植物中能觀察到葉片組織中的綠色熒光信號(hào)。對(duì)6個(gè)T1代單株后分離的42個(gè)T2代植株的分析表明，50%的T2代為單拷貝插入。這項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯是在遺傳發(fā)育早期時(shí)完成的，并且完成修飾的位點(diǎn)能穩(wěn)定遺傳至T2和T3代中。Brooks等16首次利用CRISPR/Cas系統(tǒng)建構(gòu)2個(gè)sgRNAs來(lái)敲除番茄SlAGO7基因，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌法侵染番茄子葉獲得轉(zhuǎn)基因突變植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因后代分析CRISPR/Cas在番茄中誘導(dǎo)的突變能夠穩(wěn)定遺

11、傳給后代，但不排除存在脫靶效應(yīng)。Jiang等17利用水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化Cas9/sgRNA建構(gòu)靶向細(xì)菌性疫病的易感基因，OsSWEET14和OsSWEET11的啟動(dòng)子區(qū)域，測(cè)序結(jié)果顯示靶標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生突變。有學(xué)者研究了2種水稻白葉枯病菌株(Xanthomonasoryzae)的CRISPR盒序列，發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)菌系的CRISPR盒中雖然包含1段匹配Xop411基因組的間隔片段，但依舊對(duì)Xop411噬菌體敏感。深入研究發(fā)現(xiàn)Xop411中與X.oryzaeCRISPR間隔區(qū)段匹配的原初間隔區(qū)段發(fā)生突變，這與之前在嗜熱鏈球菌及其噬菌體中觀察到的結(jié)果相似18。3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的展望CRISPR/C

12、as9等新型基因編輯技術(shù)開(kāi)啟了合成生物學(xué)時(shí)代19,20。包才CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)在內(nèi)的新型生物技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景。雖然這些技術(shù)本身不是問(wèn)題，但如何用好這些新技術(shù)將是社會(huì)各界需要清醒認(rèn)識(shí)的重要問(wèn)題。在植物育種方面最大的問(wèn)題在于通過(guò)這些技術(shù)產(chǎn)生的植物和相關(guān)產(chǎn)物是否受轉(zhuǎn)基因相關(guān)法律約束。從科學(xué)角度來(lái)講，新型植物育種方法產(chǎn)生的植物同經(jīng)典方法產(chǎn)生的植物可能是不可分辨的，且不會(huì)帶來(lái)更高的健康與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，這為監(jiān)管工作帶來(lái)更大的挑戰(zhàn)21。此外，這些新型基因組編輯技術(shù)也引發(fā)了對(duì)專利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和社會(huì)倫理、法律等更多領(lǐng)域問(wèn)題的思考22。參考文獻(xiàn)1 MahfouzMM,PiatekA,Stewar

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