細胞工程習習題(答案)(1)

1、細胞培養(yǎng)技術(shù)習題（含答案）第一章 動物細胞培養(yǎng)概述一、名詞解釋細胞培養(yǎng)：是指將動物活體體內(nèi)取出的組織用機械或消化的方法分散成單細胞懸浮液，然后放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境中，進行孵育培養(yǎng)，使其生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)與功能的方法。組織培養(yǎng)：從生物體內(nèi)取出活的組織在體外進行培養(yǎng)的方法。器官培養(yǎng)：將活體內(nèi)的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基取出，在體外培養(yǎng)的方法。 二、填空題1. 體外培養(yǎng)（或組織培養(yǎng)）主要包括_細胞培養(yǎng)_，_組織培養(yǎng)_，和_器官培養(yǎng)_ 三種類型。2. _Harrison_的實驗開創(chuàng)了動物組織和細胞培養(yǎng)的先河，他建立了_蓋玻片懸滴_培養(yǎng)法3. 在卡氏瓶原理的啟發(fā)下，出現(xiàn)了用試管

2、培養(yǎng)，繼而又出現(xiàn)了多種類型的_培養(yǎng)瓶、_培養(yǎng)皿和_多孔培養(yǎng)板_的培養(yǎng)。從20世紀40年代開始，大多數(shù)培養(yǎng)工作都過渡到用_瓶子_培養(yǎng)4. 在動物細胞培養(yǎng)方法的發(fā)展過程中，具有歷史意義的培養(yǎng)方法有蓋玻片懸滴培養(yǎng)法，_旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的方法_，_灌注小室培養(yǎng)法_，和目前普遍應(yīng)用的單層細胞培養(yǎng)法5. 早期細胞培養(yǎng)采用_天然_培養(yǎng)基，現(xiàn)在廣泛采用添加_血清_的_人工合成培養(yǎng)基，近二十年來，動物細胞培養(yǎng)朝著無血清_培養(yǎng)基的方向發(fā)展。三 問答題1、動物細胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用到那些領(lǐng)域請舉例說明。 動物細胞培養(yǎng)技術(shù)幾乎已應(yīng)用到生物、醫(yī)學研究的各個領(lǐng)域。這門技術(shù)自創(chuàng)立至今，已在多個學科領(lǐng)域乃至生產(chǎn)實踐中均發(fā)揮了巨大的作

3、用。 一、在生物學領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用 離體培養(yǎng)的動物細胞具有培養(yǎng)條件可人為控制且便于觀察檢測的特點，因而可廣泛應(yīng)用于生物學領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究中。 1在細胞生物學上的應(yīng)用 2在遺傳學上的應(yīng)用 除了可用培養(yǎng)的動物細胞進行染色體分析外，還可結(jié)合細胞融合技術(shù)建立細胞遺傳學，進行遺傳分析和雜交育種。 3在胚胎學上的應(yīng)用 通過體外培養(yǎng)卵母細胞，并進行體外受精、技術(shù)而應(yīng)用于家畜的繁殖生產(chǎn)中。 4在病毒學上的應(yīng)用胚胎分割和移植己發(fā)展成了一種較成熟的在制備減毒活疫苗和診斷用抗原時，離不開細胞這一病毒增殖的場所。另外，在病毒學研究中，用培養(yǎng)的動物細胞代替試驗動物做斑點分析5.在藥理學領(lǐng)域的應(yīng)用二、在臨床醫(yī)學上的應(yīng)

4、用1用于遺傳疾病和先天畸型的產(chǎn)前診斷目前，人們已經(jīng)能夠用羊膜穿刺技術(shù)獲得脫落于羊水中的胎兒細胞，經(jīng)培養(yǎng)后進行染色體分析或甲胎蛋白檢測即可診斷出胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型。2用于癌癥的早期診斷和預(yù)防我國的科學工作者通過培養(yǎng)淋巴細胞，病人，以便進行及早的預(yù)防和治療。3用于臨床治療并對其染色體進行對比分析檢測出易患癌癥的4用于藥物效應(yīng)的檢測檢測治療肝病的藥物可選用肝細胞、檢測抗癌藥物可選用癌細胞。三、在動物育種上的應(yīng)用四、在生物制品生產(chǎn)上的應(yīng)用2、動物細胞培養(yǎng)有哪些要求和那些方法動物細胞培養(yǎng)工作的基本要求： 1.培養(yǎng)前準備 2操作間消毒 3洗手和著裝 4火焰消毒5實驗中的操作要求動物細胞培養(yǎng)工

5、作的工作方法：細胞培養(yǎng)是一種操作程序比較復雜、需求條件多而嚴格的實驗性工作，工作時必須注意一定的方法，主要有以下幾點予以重視。 將所有操作程序如洗刷、配液、消毒等，制定出統(tǒng)一的規(guī)范和要求，并在一定時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定和要求人人遵守。各種用液(培養(yǎng)液、胰蛋白酶、Hanks液、NaHCO2、抗生素液)均應(yīng)由專人負責配制，并保證做到制備濃度精確、滅菌可靠。所有制備好的溶液和試劑瓶上都要有標簽，注上名稱、濃度、消毒與否和制備日期。一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放地點，其中尤為重要的是，培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴格分開，已消毒與末消毒品應(yīng)嚴格分開存放。 以上一切措施都是為了避免各種雜質(zhì)混入細胞生存環(huán)境、防止微生

6、物感染和細胞“污染”。所謂細胞污染，是指不同細胞之間因操作不當造成的相互混雜，使細胞群體不純的現(xiàn)象。近年來世界上不少實驗室都出現(xiàn)過這種事故，應(yīng)引起注意。第二章 動物細胞培養(yǎng)的基本知識一、名詞解釋貼壁依賴性細胞：細胞必須貼附于支持物表面才能生長，因此又稱為貼壁型細胞。非貼壁依賴性細胞：細胞在體外生長時不需要貼附于支持物表面，可以懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中生長，這種細胞又稱為懸浮型細胞。接觸抑制：是指體外培養(yǎng)的細胞在貼附底物上連接成片、相互接觸后失去運動的現(xiàn)象，這是某些貼附生長型細胞的特征之一。無限細胞系：由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，即細胞獲得持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱為連續(xù)細胞系。脫

7、分化：指的是細胞在體外不可逆地失去它們原有的特性。二、填空1. 體外培養(yǎng)的動物細胞其生長方式主要 貼壁生長 和 懸浮生長 兩種，分別稱為 貼壁型 細胞和懸浮型細胞。體外培養(yǎng)的動物細胞其生長方式以 貼附生長 為主。2. 貼壁生長的體外培養(yǎng)動物細胞，按形態(tài)來分，大體分為 成纖維細胞型 、 上皮細胞型、 游走細胞型、多形細胞型四種類型，最常見的為前兩種。3. 細胞在體外生長時具有一些特點，其中主要是 貼附生長 、 接觸抑制 和密度依賴性。4. 培養(yǎng)細胞生命期可分為 原代培養(yǎng)期 、 傳代培養(yǎng)期 、 衰退期 三個階段。三、問答題1. 什么是培養(yǎng)細胞的一代生存期培養(yǎng)細胞的一代生存期可分為哪幾個階段各有何特

8、點答：a，細胞的一代生存期指從細胞接種到下一次再傳代接種的一段時間。b，培養(yǎng)細胞的一代生存期分為潛伏期、指數(shù)生長期、停滯期三個階段。C，潛伏期：又分為懸浮期，細胞質(zhì)回縮，胞體呈球形；貼壁期，細胞開始附著或貼附于底物表面上，并逐漸伸展；潛伏期，細胞可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。 指數(shù)生長期：是細胞一代中活動最好的時期，培養(yǎng)物中的細胞數(shù)量呈指數(shù)生長，在接種適宜的情況下，指數(shù)生長期持續(xù)一段時間后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間漸趨減少，最后細胞相互接觸匯合成片。 停滯期：細胞數(shù)量達到飽和密度，細胞停止增殖，但仍有細胞代謝活動，接著培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累，PH降低。2. 培養(yǎng)細胞需要

9、哪些營養(yǎng)它需要在什么樣的環(huán)境下生長這些環(huán)境如何獲得答：A.營養(yǎng)需要：氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素、促生長因子及一些生長必須的鉀、鈉、鐵等元素。 B.生存環(huán)境：培養(yǎng)用水充足，培養(yǎng)溫度及PH適宜，氣體條件及滲透壓適宜，還有無毒無菌無污染的培養(yǎng)環(huán)境。 C.環(huán)境的獲得：3. 培養(yǎng)細胞需要哪些主要儀器在使用時需要注意什么第三章 動物細胞培養(yǎng)的準備工作一、填空題1、玻璃器皿的清洗程序主要包括浸泡 、刷洗、浸酸 、和沖洗。2、目前大多數(shù)實驗室采用的浸酸酸液的主要成分是濃硫酸和重鉻酸鉀。3、細胞培養(yǎng)用品的包裝主要包括局部包裝和全包裝兩種類型，如前者適宜的器皿有燒杯、容量瓶等，后者適宜的器皿有注射器、膠塞

10、等。細胞培養(yǎng)中塑料制品中主要采用射線消毒方法進行滅菌，人工合成培養(yǎng)基和酶液采用過濾消毒方式進行滅菌。細胞培養(yǎng)實驗前實驗者的皮膚主要用75%的酒精或新潔爾滅 來消毒滅菌，實驗室地面采用來蘇兒定期拖洗消毒，培養(yǎng)室空氣可以用 紫外線或乳酸蒸汽 消毒。BSS中文名稱為平衡鹽溶液，具有維持滲透壓、穩(wěn)定PH等作用，常用作洗滌組織和細胞以及配置各種培養(yǎng)用液的基礎(chǔ)溶液。動物細胞培養(yǎng)基中常用的消化液有胰蛋白酶消化液、膠原酶消化液 和EDTA2Na 三種，常在貼附型細胞原代培養(yǎng)或傳代 培養(yǎng)中用來離散細胞。要想取得好的細胞培養(yǎng)效果，在合成培養(yǎng)基中添加天然培養(yǎng)基 構(gòu)成完全培養(yǎng)基是非常必要的，通常它的滅活處理方法是熱滅

11、活。二、簡答題1、塑料制品的清洗步驟是什么答：塑料器皿耐腐蝕能力強，但質(zhì)地軟，大多不耐熱。塑料器皿的清洗意識要防止劃痕，二是用后要立刻浸入清水中，嚴防附著物干結(jié)。如果殘留有附著物，可先用脫脂棉輕輕擦掉，再用流水沖洗干凈，接著用2%的NaOH液浸泡過夜，取出后用自來水沖洗8-10次，然后用3% -5%鹽酸溶液浸泡15-30分鐘，取出后用自來水沖洗多次，在在雙蒸水漂洗5-6次，倒凈器皿內(nèi)的雙蒸水，置37度恒溫箱內(nèi)晾干即可。2、 用高壓蒸汽滅菌鍋進行濕熱滅菌時應(yīng)注意什么答；濕熱滅菌時，消毒品不能裝得過滿，以保證消毒器內(nèi)氣體的流通，在加熱升壓之前先要打開排氣閥門，排除殘留在容器內(nèi)的冷空氣，導氣管一定要

12、沿著滅菌鍋內(nèi)膽上的升制的通氣孔道到達灌的底部并且不能堵塞。冷空氣排盡后，關(guān)閉排氣閥門；繼而開始升壓，當達到所需要的壓力時，通過調(diào)節(jié)高壓蒸氣鍋的電源開關(guān)，是壓力穩(wěn)定在所需數(shù)值后并開始計算時間。在消毒過程中，消毒者不能離開，要經(jīng)常檢查壓力是否恒定，如有偏離，應(yīng)及時調(diào)整。3、谷氨酸胺在培養(yǎng)基中的主要作用是什么配液時應(yīng)該注意哪些問題答：1）谷氨酰胺的作用：在細胞的代謝工程中發(fā)揮重要作用，是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)的必需的氨基酸；缺少谷氨酰胺時，細胞會因為生長不良而死亡。培養(yǎng)液在4C冰箱中儲存2周以上時，還應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。一般來說 ，谷氨酰胺溶液都是單獨配制的，以便在需要時加入培養(yǎng)液內(nèi)。常把其配

13、制成100倍的濃縮母液，濃度為200mmol/L（L）。使用時，在每100ml培養(yǎng)液中加入2ml谷氨酰胺母液，使其終濃度為14mg/L即可。4、人工培養(yǎng)基常用的有哪些（列舉12種）采用人工培養(yǎng)基有什么優(yōu)點答：1）人工培養(yǎng)基常用培養(yǎng)基：主要有有MEM培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)液，HamF12培養(yǎng)液等等。2）采用人工培養(yǎng)基優(yōu)點：因為合成培養(yǎng)基是根據(jù)動物體內(nèi)細胞生長所需成分人工模擬合成的、配方恒定的一種較理想的培養(yǎng)基，其主要成分是氨基酸，維生素，碳水化合物，鹽離子和一些其他輔助物質(zhì)，培養(yǎng)基成分固定，有利于控制實驗條件的標準化，合成培養(yǎng)基的應(yīng)用促進了培養(yǎng)細胞的發(fā)展，合成培養(yǎng)基可以用于

14、特殊研究的細胞培養(yǎng)工作，雜交瘤技術(shù)細胞培養(yǎng)，腫瘤細胞培養(yǎng)，單細胞培養(yǎng)等等方面。2）配液時應(yīng)該注意的問題：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20C冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液中。因為谷氨酰胺在4C下放置7d就會分解50%，所以已含谷氨酰胺的5、胎牛血清在細胞培養(yǎng)中起什么作用如何從外觀大致判斷血清質(zhì)量的好壞胎牛血清在細胞培養(yǎng)中對許多細胞系均有促生長作用，主要用于細胞株的保藏以及特殊嬌貴細胞株的體外培養(yǎng)。 質(zhì)量好的血清應(yīng)該是透明清亮的土黃色或棕黃色，無沉淀或是極少量沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含有許多沉淀物，說明血清污染或是血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太

15、高，取材時有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中滲入的生理鹽水太多。6、完全培養(yǎng)基中各成分在細胞培養(yǎng)過程中的作用分別是什么答：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清、抗生素等物質(zhì)后成為完全培養(yǎng)基，也叫（血清）細胞培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基根據(jù)添加血清量的多少，可分為細胞生長培養(yǎng)基和細胞維持培養(yǎng)基兩種。完全培養(yǎng)基中的成分包括氨基酸，碳水化合物，維生素，無機鹽類，促生長因子，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素等等，除此之外，還需加入牛血清。各成分作用列舉如下：1）氨基酸：細胞合成蛋白質(zhì)的原料，保證細胞正常的生理代謝過程；2）碳水化合物：細胞生長主要的能量來源，有些糖類是合成氨基酸，脂肪，核酸的原料；3）維生素：細胞生長

16、必不可少的有機化合物，幫助細胞維持滲透壓平衡和調(diào)節(jié)細胞膜功能，有些無機鹽是維生素，激素，酶形成中的原料；4）促生長因子：對于維持細胞功能，保持細胞的狀態(tài)具有十分重要的作用；促進細胞增殖；5）牛血清：血清含有各種氨基酸，維生素，無機物，脂類物質(zhì)，核酸衍生物都是細胞生長所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)；也提供激素，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中少有的營養(yǎng)成分，低分子營養(yǎng)物等；提供結(jié)合蛋白，識別維生素，脂類，金屬離子，調(diào)變物質(zhì)能力；與有毒金屬和熱源物質(zhì)結(jié)合，起解毒作用；是細胞貼壁，鋪展所需因子的來源，第四章 動物細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法一、名詞解釋原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體進行細胞分離之后至第一次傳代之前的細胞培養(yǎng)階段

17、。組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)是將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法是常用的，簡便易行的以及成功率較高的原代培養(yǎng)方法。消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法是采用組織消化分散法將細胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等妨礙細胞生長的物質(zhì)去除，使細胞分散，形成懸液，從而易于外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產(chǎn)物.細胞生長曲線細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞濃度為縱軸作圖，即得生長曲線。傳代細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代。二、填空1、組織塊的分離方法有 機械分散法 、 剪切分離法 、 消化分離法 。2、目前，

18、較常用的消化試劑有 胰蛋白酶 、 膠原酶 、 EDTA消化液 。3、接種培養(yǎng)瓶的細胞數(shù)量一般為 5105-1106/ml 。4、培養(yǎng)細胞的污染一般包括 微生物污染 、 細胞交叉污染 、化學物質(zhì)的污染。5、細胞凍存時DMSO常用的濃度為 10%的濃度 。三、判斷（正確畫“”，錯誤畫“X“）1、一般來說，成熟個體較胚胎容易培養(yǎng)，正常組織較腫脹凈組織容易培養(yǎng)。（X）2、分離液體性原代細胞懸液時，可采用長時間高速離心。 （X）3、消化過程中使用的液體應(yīng)不含Ca2+和Mg2+。 （）4、培養(yǎng)液變黃、常溫，一般是由細菌污染引起。（）5、消化傳代法一般用于懸浮細胞的傳代。 （X）6、細胞凍存和復蘇的方式應(yīng)采

19、用快凍慢融法。 （X）四、問答題1、原代取材培養(yǎng)時有哪些基本要求P59 答：（1）無菌取材（2）取材器械要鋒利（3）及時培養(yǎng)（4）剔除與培養(yǎng)細胞無關(guān)的成分（5）營養(yǎng)要豐富（6）采用易培養(yǎng)的組織進行培養(yǎng)（7）注意保存原代培養(yǎng)組織的相關(guān)材料及信息。2、如何分離原代組織材料P61答：1.細胞懸液的分離方法：對于細胞懸液，可采用低速離心法分離。一般用5001000r/min離心510min。2.組織塊的分離方法：（1）機械分散法 在對一些纖維成分很少的組織，如腦組織部分胚胎組織以及一些腫瘤組織等進行培養(yǎng)時，可以直接用機械方法進行分散?，F(xiàn)在較為常用的是用注射器針芯擠壓組織塊通過不銹鋼篩網(wǎng)的方法。（2）剪

20、切分離法： 在進行組織塊移植培養(yǎng)時，可以采用剪切法，即將組織剪或切成1mm3左右的小塊后分離培養(yǎng)。（3）消化分離法： 消化法是結(jié)合生化和化學手段把已剪切成糊狀的組織進一步的方法。常用的消化方法有：胰蛋白酶消化法和膠原酶消化法。3、細胞的常規(guī)檢查包括哪些內(nèi)容P65答：細胞的常規(guī)檢查包括：（1）培養(yǎng)液 重點觀察培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。（2）細胞生長情況： 用倒置顯微鏡觀察。（3）細胞形態(tài)變化： 對生長狀態(tài)不良的細胞首先要查明原因，采取相應(yīng)措施進行處理，如換液、排除污染、廢棄等。（4）微生物污染： 主要包括細菌、霉菌、酵母菌、支原體等的污染。4、你如何認定培養(yǎng)細胞被微生物污染了怎樣排除微生物對培

21、養(yǎng)細胞的污染微生物污染主要包括細菌、霉菌、酵母菌、支原體等的污染。細菌、霉菌、酵母菌污染最典型的表現(xiàn)為培養(yǎng)液渾濁，液體內(nèi)漂浮菌絲或細菌。支原體污染時則不同，對于傳代穩(wěn)定、生長規(guī)律的細胞系，往往表現(xiàn)為培養(yǎng)條件沒有改變而細胞生長卻明顯變緩、胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多、有中毒表現(xiàn)，但培養(yǎng)液多不發(fā)生渾濁，即可考慮為支原體污染。細菌和霉菌的污染多發(fā)生在傳代、換液和加藥等操作之后，霉菌和細菌繁殖迅速，能在很短時間內(nèi)抑制細胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)導致細胞死亡。真菌污染及排除: 污染培養(yǎng)細胞的真菌種類很多，常見的有煙曲霉、黑曲霉等，霉菌污染一般肉眼可見，交易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不渾濁，在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。瓶外

22、的污染物需及時用酒精棉球擦洗清涂，以防其通過瓶口傳入瓶內(nèi)；如被污染可考慮采用制霉菌素25ug/ml或酮康唑10ug/ml對細胞進行處理。細菌污染及排除：常見的污染菌有大腸桿菌、白色葡萄球菌等?？股貙︻A(yù)防和殺滅細菌有一定效果?？股芈?lián)合使用比單獨使用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用效果好。如已發(fā)生細菌污染，在使用抗生素，常難以根除。有價值的細胞被污染后，可使用510倍常用抗生素劑量的沖擊方法，加藥作用2428h，在換入常規(guī)培養(yǎng)液中，有時可排除污染。支原體污染的排除：a抗生素處理，如使用四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、泰樂菌素及一些氟喹諾酮等；b高熱處理，將受污染的細胞置41作用510h，最長達18h，可以

23、破壞支原體。;c巨噬細胞和抗生素聯(lián)合處理；d鼠的傳代處理；e血清處理。5、如何進行培養(yǎng)細胞的運輸P74應(yīng)根據(jù)運輸時間長短或距離遠近來進行不同的細胞裝運。1.長距離運輸（幾天）選擇生長良好的單層細胞，去掉陳舊培養(yǎng)液，補充新培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋。這樣可避免由于液體晃動導致的細胞損傷。瓶口用膠帶纏緊密封，并用棉花包裹（做防震防壓處理）。到達目的地后，吸出多余的培養(yǎng)液（此液可繼續(xù)使用），保留細胞生長所需液量，常規(guī)培養(yǎng)數(shù)小時或過夜，次日傳代。2.短距離運輸（幾小時）去掉大部分生長液，僅留少量液體覆蓋單層細胞，防止細胞干燥，細胞面朝上。3.細胞懸液空運將濃度為6105 個/ml的細胞懸液

24、于04放置24h.將細胞懸液混勻后，200r/min離心30min，棄去含酶的上清液，加4新鮮培養(yǎng)液，是細胞終濃度為106個/ml。 將細胞裝于4的冰盒內(nèi)空運，到達目的地后以200r/min離心30min，棄去上清液，加新鮮培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細胞數(shù)為6105個/ml，然后接種于培養(yǎng)瓶。4.液氮咚存運輸利用1L液氮罐或大號暖瓶裝液氮，將凍存細胞管移入液氮中，這樣可將細胞轉(zhuǎn)送到其他場所。第五章 動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)一、 名詞解釋動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：是指在人式條件（除滿足培養(yǎng)過程必需的營養(yǎng)要求外，還要進行pH和溶解氧的最佳控制）下，在細胞生物工程反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。微

25、載體：是指直徑在60250m，能適用于巾壁細胞生長的微珠，一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。微載體細胞培養(yǎng)：是在培養(yǎng)液內(nèi)加入培養(yǎng)液及對細胞無害的顆粒微載體，作為載體，使細胞在微載體表面附著并呈單層生長繁殖，通過持續(xù)攪動（為避免剪切力對細胞質(zhì)的影響，攪拌速度一定要慢）使微載體始終保持懸浮狀態(tài)的培養(yǎng)方法。微囊化細胞培養(yǎng)方法：是指在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細胞、生物活性物質(zhì)以及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行培養(yǎng)的方法。中空纖維細胞培養(yǎng)：是模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細血管”即中空纖維來為培養(yǎng)的細胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的事種大規(guī)模培養(yǎng)方法

26、。二、 填空題1、 根據(jù)動物細胞的培養(yǎng)特性不同，可采用懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進行動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)。2、 在動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)中，能為細胞提供貼附表面的培養(yǎng)目前主要有旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、細胞工廠和微載體等。3、 制備固定化細胞的方法很多，在動物細胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附法、包埋法和微囊化法。4、 無論培養(yǎng)何種細胞，就操作方式而言，深層培養(yǎng)可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種發(fā)酵工藝。5、 針對動物細胞培養(yǎng)特性開發(fā)的攪拌式生物反應(yīng)器，主要有籠式通氣攪拌反應(yīng)器、雙層籠式通氣攪拌反應(yīng)器等。6、 用氣流代替不銹鋼葉片進行攪拌，因而產(chǎn)生的剪切力相對溫

27、和，對細胞損傷較小的生物反應(yīng)器是氣升式生物反應(yīng)器。三、 問答題1、 目前由動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)物包括哪幾類請分別列舉出23個產(chǎn)物。答：目前由動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)物包括：1.疫苗類：狂犬病疫苗、乙肝疫苗、巨細胞病毒疫苗等；2.多肽和蛋白質(zhì)類藥物：生長激素、白細胞介素-2和神經(jīng)因子等；3.免疫調(diào)節(jié)劑及單克隆抗體：干擾素、免疫球蛋白等。P942、 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程主要包括哪些步驟答：將組織切成碎片、用溶解蛋白質(zhì)的酶處理而得到單個細胞、離心收集細胞、將細胞植入培養(yǎng)基中培養(yǎng)、酶解培養(yǎng)瓶中的細胞層、再接種到若干培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)3、 什么是懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)有何缺點答：懸浮培養(yǎng)是指讓細胞在

28、生物反應(yīng)器中自由懸浮生物增殖的培養(yǎng)方法。缺點：不能采用灌流培養(yǎng)，導致細胞密度較低，另外只有少數(shù)細胞適合懸浮培養(yǎng)。4、 微載體的選擇有何要求答：微載體：是指直徑在60250m，能適用于巾壁細胞生長的微珠，一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。具體要求如下：1.微載體表面性質(zhì)要適于細胞附著、伸展和增殖；2.微載體材料沒有毒性，且不會與培養(yǎng)基成分發(fā)生化學反應(yīng)，也不會吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分；3.微載體的密度一般為ml，以便換液和收獲；4.微載體直徑要盡可能小最好控制在60250m之間，要盡可能均一；5.要具有良好的光學透明性，以便觀察；6.能承受120高溫；7.制作原料充分，價格便宜，制作簡便，

29、且經(jīng)適當處理后能反復使用。5、 微載體培養(yǎng)的操作包括哪些步驟答：微載體培養(yǎng)的操作包括五個階段：培養(yǎng)初期階段、黏附貼壁階段、維持培養(yǎng)階段、微載體培養(yǎng)的放大階段。6、 微囊化培養(yǎng)中微囊的制備應(yīng)注意哪些問題答：微囊化培養(yǎng)中微囊的制備應(yīng)注意：溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；所用試劑和膜材料對細胞無毒害；膜的孔徑可控制，必須使營養(yǎng)物和代謝物自由通過；膜應(yīng)有足夠的機械強度可抵抗培養(yǎng)中的攪拌。7、 理想的動物細胞生物反應(yīng)器應(yīng)滿足基本要求試比較教材所介紹的幾種生物反應(yīng)器各自的優(yōu)缺點。答：理想的動物細胞生物反應(yīng)器應(yīng)滿足：1.在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細胞生物及細胞進行

30、產(chǎn)物的合成；2.生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)要有比較好的傳質(zhì)、混合民及密閉的性能，既能保證培養(yǎng)細胞的正常生長和產(chǎn)物的合成，又能避免一切外來污染；3.制造反應(yīng)器所用的各種材料要對細胞無毒性；4.培養(yǎng)環(huán)境的各種物理化學參數(shù)能自動檢測和調(diào)節(jié)控制，并且精度要高，以利于培養(yǎng)過程的檢測和調(diào)節(jié)；5.反應(yīng)器應(yīng)便于操作和維修。8、 幾種生物反應(yīng)器各自的優(yōu)缺點的比較：第六章 特殊細胞培養(yǎng)概要一、 填空1. 為了促進上皮細胞的生長，需要從表皮分離、培養(yǎng)液和基質(zhì)選擇、增減適當?shù)纳L因子等方面抑制 微生物 生長。2. 上皮細胞培養(yǎng)器皿的表面需包被生長基質(zhì)如 膠原 等。3. 在上皮細胞的實際培養(yǎng)中，常將 DMEM 和 HamF12

31、培養(yǎng)基按一定比例混合使用。4. 用于內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的標本多為 鼠腦皮質(zhì)毛細血管 、 牛主動脈 、牛腎上脂皮質(zhì)毛細血管、人臍靜脈以及人皮膚和脂肪的毛細血管。5. 神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)底物需要經(jīng)過 膠原 或 聚L-賴氨酸 的特殊處理。6. 神經(jīng)生長因子、有絲分裂抑制劑（如阿糖胞苷、5-氟脫氧尿嘧啶） 可以防止非神經(jīng)元細胞的生長，用于神經(jīng)元細胞的純化。7. 腫瘤細胞培養(yǎng)過程中常用的促細胞生長因子有 胰島素 、 氫化可的松 、 雌激素 。8. 神經(jīng)膠質(zhì)細胞主要取材部位為 中樞神經(jīng)系統(tǒng)的皮質(zhì)組織。9. 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng)主要包括 神經(jīng)元 和 神經(jīng)膠質(zhì)細胞 的培養(yǎng)。10. 永生性 也稱不死性，即在體外培養(yǎng)中細胞

32、表現(xiàn)為可無限傳代而不凋亡。11. 侵襲性 是腫瘤細胞的擴張性增殖行為，體外培養(yǎng)的癌細胞仍持有這種性狀。二、判斷1、上皮細胞培養(yǎng)中使用的各種液體包括細胞凍存液、分離液以及培養(yǎng)液都需要添加比其他組織培養(yǎng)濃度更高的抗生素。（ O ）2、 神經(jīng)元細胞培養(yǎng)需要極高的營養(yǎng)條件，一般以RPMI-1640與Ham F12混合培養(yǎng)基（1：1，體積比）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。（ X ）3、 人腫瘤細胞主要來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。（O ）4、 制備腫瘤細胞時應(yīng)盡量選用退變組織。（ X ）5、 干細胞才是支持腫瘤生長的成分。( X )6、 飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法是目前表皮細胞體外培養(yǎng)的較為成熟的技術(shù)。（X ）三、簡答題1、體外培

33、養(yǎng)腫瘤細胞的生物學特性有哪些永生性 形態(tài)和性狀 侵襲性 生長增長 細胞遺傳 異質(zhì)性2、應(yīng)用體外培養(yǎng)技術(shù)進行腫瘤研究具有的優(yōu)點。可以免受機體內(nèi)部因素的影響，從而便于研究理化和生物因素對腫瘤細胞生命活動的影響便于眼睛腫瘤細胞的結(jié)構(gòu)和功能腫瘤細胞可長期保存以便于觀察其遺傳行為的改變用于抗癌藥物的快速篩選3、常用的排除成纖維細胞的方法有哪些簡述其操作過程。機械刮除法、反復貼臂法、消除排除法機械刮除法：a.制備無菌刮頭 b.標記 c.刮除 d.用Hanks液沖洗一兩次，沖洗被刮掉的細胞 e.注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止反復貼臂法：a.細胞生長達一定數(shù)量后，倒出原

34、瓶內(nèi)培養(yǎng)液，用以蛋白酶消化后，Hanks液沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，反復吹打制成細胞懸液b.取三個培養(yǎng)瓶，分別編號為A 、 B、C 先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中，然后置溫箱中靜止培養(yǎng)520min ，取出并輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中在培養(yǎng)瓶的一個角后，慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再轉(zhuǎn)接到B培養(yǎng)液中；向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 培養(yǎng)瓶中細胞培養(yǎng)520 min后，按A 瓶的處理方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中置溫箱中培養(yǎng)；再向B瓶中補加完全培養(yǎng)機制溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第七章 與動物細胞培養(yǎng)相關(guān)的部分實驗技術(shù)一、填空1. 制備單克隆抗體的融合是指將免疫小鼠的（ 脾細胞 ）和（小鼠骨髓瘤細胞 ）融合

35、。2. 融合過程中使用的促溶劑主要是（ 聚乙二醇 ）。3. 第一個單克隆抗體是（ 1975 ）年制備成功的。4. 常用的細胞轉(zhuǎn)染方法有（ 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 ）、（ 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）和（ DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染 ）。5. 單克隆抗體的大量制備普遍采用的方法是（ 雜交瘤技術(shù) ）。其他參考答案：小鼠腹腔接種法6. 雜交瘤細胞克隆化的方法很多，常用的包括（ 有限稀釋法 ）和（ 軟瓊脂平板法 ）。7. 在細胞融合過程中瘤細胞株應(yīng)用最多的是（ 雜交瘤 ）細胞株。8. 細胞融合培養(yǎng)時加入在（ HAT ）選擇系統(tǒng)，目的是保證只有雜交瘤細胞生長。二、名詞解釋單克隆抗體：是由一種B細胞克隆所產(chǎn)生的只針對某一特定抗原決定簇的抗

36、體分子。細胞的基因轉(zhuǎn)染：將外源性基因采用化學或物理的方法人工地導入細胞的技術(shù)，就叫做細胞的基因轉(zhuǎn)染，又叫基因轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)導。三、判斷題1.脂質(zhì)體法比磷酸鈣法轉(zhuǎn)染的效率高。（ ）2.促溶劑PEG的最適使用濃度為60%80%。（ ）3.融合過程中PEG作用細胞的時間通常以12min為宜。（ ）4.在單抗制備過程中可以采用任何品系的動物進行免疫。（ ）四、簡答題培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞的機理是什么答：HAT培養(yǎng)基是含次黃嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）及氨基蝶呤（A）的一種選擇培養(yǎng)基，這三種成分均與細胞DNA合成有關(guān)。A可阻斷細胞利用正常途徑合成DNA，細胞在含有氨甲喋呤的培養(yǎng)基中不能通過正常途徑合成DN

37、A。這時正常細胞可以通過“補救途徑”，由TK和HGPRT酶利用T和H合成核酸而繁殖。瘤細胞是HGPRT酶陰性細胞，自身不能通過補救合成途徑合成DNA而繁殖。B細胞雖含有HGPRT，但在體外培養(yǎng)只存活57d。融合細胞（雜交瘤細胞）含有B細胞和瘤細胞，其中瘤細胞能利用B細胞的HGPRT酶通過補救途徑合成DNA而繁殖。因此在HAT培養(yǎng)基中，HGPRT 或TK瘤細胞死亡，淋巴細胞亦逐漸死亡，只有融合成功的雜交瘤存活。2.骨髓瘤細胞和脾細胞融合過程中應(yīng)特別注意的幾個問題是什么答：（1）細胞比例。骨髓瘤細胞與脾細胞的比例可從1：2到1:10不等，常用1:5到1:10之間的比例。（2）反應(yīng)時間。各個步驟都需

38、在規(guī)定的時間下嚴格操作。（3）反應(yīng)溫度。整個融合過程都要在370C的水浴中進行，所需試劑要在370C預(yù)熱。（4）PEG的選擇。相對分子質(zhì)量為10006000的PEG均可用，分子量越大，毒性越強，單分子量過小，又影響融合效果。3.單克隆抗體和多克隆抗體有何區(qū)別答：如果用經(jīng)免疫過的動物的脾細胞獲得雜交瘤細胞，則得到單克隆抗體，如果用動物的血清，則得到多克隆抗體。單抗是有單個細胞起源的細胞克隆分泌的，所以只針對蛋白抗原的單一抗原決定簇，而多抗是有多個不同克隆的B細胞產(chǎn)生的，是多種細胞的混合物，但其中的每一種抗體也只是針對一種決定簇。多克隆抗體純度較低、特異性較差、易引起交叉反應(yīng)和過敏反應(yīng)，且產(chǎn)量有限

39、。單克隆抗體性質(zhì)純、效價高、特異性強，可以避免交叉反應(yīng)，提高了抗原抗體反應(yīng)的敏感性和特異性。第八章 植物細胞培養(yǎng)概論一、名詞解釋外植體：在植物組織培養(yǎng)中由活體植物上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細胞、組織、器官等，稱為外植體。愈傷組織：指在人工培養(yǎng)基上，由外植體的表面形成的一團不定形的排列疏松的薄壁細胞。脫分化：指在植物組織細胞培養(yǎng)中，一個成熟細胞或已分化細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槲捶只癄顟B(tài)的過程。細胞全能性：每個細胞都攜帶著一套完整的基因組，因此具有發(fā)育成完整植株或個體的潛在能力。二、判斷題1.愈傷組織是脫分化的植物組織細胞。（F）2.在植物組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)中都包含愈傷組織培養(yǎng)。（T）3.植物細胞培養(yǎng)的

40、主要目的是獲得所需的細胞和各種所需的產(chǎn)物。（T）三、填空1、外植體經(jīng)自來水沖洗后應(yīng)進行（浸潤滅菌、滅菌劑處理、無菌水刷洗）三步，完成滅菌過程。2、植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細胞的全能性3、1943年，（White）正式提出植物細胞全能性理論，認為每個植物細胞具有母株植物的全套遺傳信息，具有發(fā)育成完整植株的能力。4、植物生長點附近的病毒濃度很低甚至無病毒，利用（莖尖分生）組織培養(yǎng)可脫去病毒，獲得脫毒植株。5、用于外植體表面滅菌的滅菌劑主要有（次氯酸鈣）、（過氧化氫）、（氧化汞）等。四、問答題1、植物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的不同體現(xiàn)在哪些方面答： 培養(yǎng)對象不同：一般來說，以各種植物的器官和組織，

41、如根、莖、葉、花、未熟的果實、種子、愈傷組織等為培養(yǎng)對象的培養(yǎng)技術(shù)屬于植物組織培養(yǎng)；而以各種形式的植物細胞，如脫分化的薄壁細胞（愈傷組織）、單細胞、單倍體細胞、原生質(zhì)體、小細胞團、固定化細胞等為培養(yǎng)對象的培養(yǎng)技術(shù)屬于植物細胞培養(yǎng)。愈傷組織培養(yǎng)既屬于組織培養(yǎng)又屬于細胞培養(yǎng)。 培養(yǎng)目的不同： 植物組織培養(yǎng)的主要目的是獲得所需的植物組織和再生植株，還可以生產(chǎn)某些次級代謝物，在名貴花、木、瓜、果種苗（試管苗）的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、種苗的脫毒、植物的大規(guī)?？焖俜敝车确矫婢哂兄匾囊饬x和應(yīng)用價值；而植物細胞培養(yǎng)的主要目的是獲得所需的細胞和各種所需的產(chǎn)物，也可以利用植物細胞培養(yǎng)進行生物轉(zhuǎn)化，將外源底物轉(zhuǎn)化為所需的產(chǎn)

42、物，還可以利用植物細胞培養(yǎng)進行種質(zhì)保存、人工種子的制備和植株的大規(guī)模快速繁殖等。2、植物細胞培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)方面有哪些應(yīng)用答： 在植物育種方面的應(yīng)用：（1）單倍體育種：通過花藥（花粉）培養(yǎng)獲得單倍體植株，然后通過秋水仙素處理使其染色體加倍，可以迅速使后代基因型純和，加速育種進程。 （2）胚培養(yǎng)：采用幼胚（或胚胎、胚珠等）離體培養(yǎng)使自然條件下早熟的幼胚發(fā)育成熟，獲得雜種后代。 （3）體細胞雜交：體細胞雜交是打破物種間生殖隔離，實現(xiàn)其有益基因的交流，改良植物品種，以達到創(chuàng)造植物新類型的有效途徑。 （4）細胞突變體的誘變與篩選：在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物的細胞處于不斷分裂的狀態(tài)，易受培養(yǎng)條件和外界壓力的影響而發(fā)

43、生變異。 （5）遺傳轉(zhuǎn)化：可以獲得抗逆，高產(chǎn)及優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植株，能解決植物育種中用常規(guī)雜交方法所不能解決的問題，并能與常規(guī)育種方法相結(jié)合，建立高效育種技術(shù)體系。 在植物脫毒方面的應(yīng)用：許多植物，特別是無性繁殖植物均受到多種病毒的侵染，造成嚴重的品種退化，產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣，利用莖尖分生組織培養(yǎng)可脫去病毒，獲得脫毒植株。 在離體快繁方面的應(yīng)用：傳統(tǒng)的植物繁殖是在田間或在溫室中進行有性繁殖或無性繁殖，效率低，時間長，不利于優(yōu)良品種和新品種的大規(guī)模推廣應(yīng)用。由于植物離體繁殖快速，而且材料來源單一，遺傳背景均一，不受季節(jié)和地區(qū)等的限制，重復性好，離體快繁比常規(guī)方法快數(shù)萬倍至百萬倍。 在植物種質(zhì)資源保存

44、方面的應(yīng)用：利用植物細胞繼代培養(yǎng)或者冷凍保存的方法進行種質(zhì)保存，不僅簡單方便，而且可以使植物的遺傳特性得以長期穩(wěn)定地保存，對于稀有植物品種、優(yōu)良植物品種和新型植物品種的種質(zhì)保存具有重要的意義。同時，離體保存的材料不受各種病蟲害侵染，而且不受季節(jié)的限制，所以利于種質(zhì)資源的地區(qū)間及國際間的交換。3、外植體的清洗和滅菌如何操作答：可應(yīng)用70%酒精和一定濃度的次氯酸鈉溶液來滅菌外植體，其方法如下： 材料的選取與清洗 1）選擇無菌斑和蟲害的植株作為母株。 2）剪取所需葉片、莖段（23厘米）及根等材料，在自來水下沖洗掉泥土等雜物。 3）在加有洗潔精的水中清洗材料，并用自來水沖洗干凈，分裝如干凈的三角燒瓶中

45、，備用。 滅菌（在超凈工作臺上操作） 1） 在裝有材料的三角瓶中加入70%酒精至浸沒材料， 12分鐘（可根據(jù)材料經(jīng)試驗而定）后迅速倒掉酒精。 2）在裝有材料的瓶中加入6%20%的安替福明溶液530分鐘（濃度和時間可根據(jù)材料經(jīng)試驗而定），在此過程中不斷搖晃三角瓶并用火焰燒瓶口數(shù)次。 3）在無菌條件下，用無菌水將材料沖洗至少三次，即可。第九章 植物細胞培養(yǎng)的條件一、選擇題1. 接種工具滅菌常采用（A） A.灼燒 B.高壓 C.過濾 D.熏蒸2.具有促進愈傷組織生產(chǎn)的物質(zhì)是（B ） A.維生素PP B.維生素B1 C.維生素B6 D.甘氨酸3.微量元素母液的配制濃度（ B ） 倍 倍 ml ml4.

46、配制10倍大量元素母液，所需硝酸銨（ C ）mg .3700 C 5.配制100倍有機物母液時，所需維生素B1( B )mg A.0.4 .10 C 下列哪種不是組織培養(yǎng)常用的維生素（ A ） A.維生素B2 B.維生素B1 C.維生素B6 D.維生素C7.下列哪種激素不屬于生長素類（ C ） 8.下面哪種是MS培養(yǎng)基大量元素所用藥劑（A ） A.硫酸鎂 B.硫酸亞鐵 C.硫酸鋅 D.硫酸銅二、判斷題培養(yǎng)基是沒有激素的培養(yǎng)基。 （F ）2.鐵鹽母液可配成100倍液，配制培養(yǎng)基時移取100ml。 （F ）3.瓊脂只起固化作用，本身并不提供任何營養(yǎng)。 （T）三、填空 1.培養(yǎng)基PH一般調(diào)節(jié)為 ，常

47、用HCl和NaOH方法來進行。 2.磷是構(gòu)成 蛋白質(zhì)及核酸 的主要成分，這種物質(zhì)又是細胞膜、細胞核的重要組成部分。磷也是 ATP 的成分，這是一種常見的直接能量物質(zhì)。 3.微量元素母液可配成 100 倍，配制培養(yǎng)基時移取 10 ml。 4.高壓滅菌可以對培養(yǎng)基及 蒸餾水、 玻璃器皿 、 鑷子 等進行滅菌。 5.放冷氣時壓力表指示為 MPa，在時鍋內(nèi)溫度為 121 。四、問答題 1.植物細胞培養(yǎng)所需的基本設(shè)備有哪些答：高壓滅菌鍋，超凈工作臺、培養(yǎng)架、酸度計、天平、低溫低速臺式離心機、倒置顯微鏡、雙筒解剖鏡、生物顯微鏡、水浴鍋、旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)架和搖床、蒸餾水發(fā)生器或去離子水裝置、培養(yǎng)箱、超聲波清洗洗器

48、。2. 植物細胞培養(yǎng)基本成分有哪幾大類各類試劑在保存方法上有何要求答：植物細胞培養(yǎng)基的主要萬分包括水、無機營養(yǎng)、有機成分、抗生素等。大量元素母液的保存方法是保存于4冰箱中；微量元素母液的保存方法是保存于冰箱中；鐵鹽母液的保存方法是儲存于棕色玻璃瓶中，并保存于冰箱中；有機物母液的保存方法是保存于冰箱中；植物激素母液的保存方法是保存于冰箱。3. 細胞培養(yǎng)中，常用的植物生長調(diào)節(jié)劑有哪幾類它們的主要功能是什么答：細胞培養(yǎng)中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑主要分五大類；具體如下：生長素，主要功能是促進細胞伸長生長和細胞分裂，誘導愈傷組織產(chǎn)生，促進生根；細胞分裂素，主要功能是誘導芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長，促進細胞分裂

49、與擴大，抑制根的分化；赤霉素，能刺激在培養(yǎng)基中形成的不定胚正常發(fā)育成小植株；脫落酸，能夠促進體細胞胚胎發(fā)生的頻率，促進體細胞胚胎的成熟，減少機型胚胎發(fā)生；其他類激素，例如乙烯，它能夠促進果實成熟、脫葉、發(fā)芽以及根和苗的生長等。4. 配制植物細胞培養(yǎng)基時為什么要配制母液如何配制培養(yǎng)基的各種母液對各種母液濃縮的倍數(shù)有何要求答：為使用方便和用量準確，配制培養(yǎng)基前常要配制母液。各種母液的配制方法如下：大量母液，按照配方用量，各種化合物擴大10倍稱取后，蒸餾水溶解混合并定容至1000ml；微量元素，按配方用量100倍，蒸餾水溶解、稍加熱，按一定順序混合并定容至1000ml；鐵鹽母液，分別稱取一定量硫酸亞

50、鐵和乙二胺四乙酸二鈉配成100倍濃度螯合態(tài)鐵鹽混合冷卻定容至1000ml；有機物質(zhì)母液，按配方用量100倍分別稱取，溶解后定容至100ml；植物激素母液，一般配制濃度2mg/ml。生長素類（IAA、NAA、IBA）或酒精溶解后定容所需體積。細胞分裂素類（、BA）少量HCL加熱溶解后加水定容。5. 配制鐵鹽母液有何特殊要求為什么答：一般用硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉配成100倍濃度的螯合態(tài)鐵鹽比較穩(wěn)定，因此需要單獨配制。因為鐵鹽容易沉淀。6.常用的培養(yǎng)基滅菌方法有哪幾種如何選擇答：常用的培養(yǎng)基滅菌方法有高壓蒸汽滅菌和過濾滅菌兩種。當培養(yǎng)基的所有成分都是對熱穩(wěn)定的時，應(yīng)選擇高壓蒸汽滅菌。而當培養(yǎng)基中

51、包含熱不穩(wěn)定的成分時，應(yīng)選擇過濾滅菌。第十章 植物細胞培養(yǎng)的基本過程和方法一、名詞解釋外植體：指從植物體上取出的用于無菌培養(yǎng)或直接分離細胞的部分植物組或器官。脫分化：已經(jīng)分化的植物器官、組織或細胞，當受到創(chuàng)傷或進行離體（也受到創(chuàng)傷）培養(yǎng)時，已停止分裂的細胞，又重新恢復分裂，細胞改變原有的分化狀態(tài)，失去原有結(jié)構(gòu)和功能，成為具有未分化特性的細胞。愈傷組織：植物各種器官的外植體在離體培養(yǎng)條件下，細胞經(jīng)脫分化等一系列生理生化過程，改變原有的特性繼而轉(zhuǎn)變形成一種能夠迅速增殖的無特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細胞團，稱為愈傷組織。懸浮培養(yǎng)：指的是一種在受到不斷攪動或搖動的液體里培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細胞及小細胞團的細胞培

52、養(yǎng)系統(tǒng)。通過懸浮培養(yǎng)能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。固定化培養(yǎng)：固定化細胞是指固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞。以這種方式進行的細胞培養(yǎng)叫做細胞固定化培養(yǎng)。單細胞培養(yǎng)：是指從植物器官、愈傷組織或懸浮培養(yǎng)液中游離出單個細胞進行培養(yǎng)的一門技術(shù)。植板率：是指通過平板培養(yǎng)后形成細胞團的單細胞數(shù)與接種細胞總數(shù)的比值。原生質(zhì)體：是指除去細胞壁的細胞或是說一個被質(zhì)膜所包圍的裸露細胞。二、填空1、 請列出外植體常用的五種消毒劑：氯化汞（升汞）、次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫、酒精。2、 愈傷組織的形成分為起始期、分裂期、形成期三個時期。3、 懸浮細胞培養(yǎng)的同步

53、化方法有體積選擇法、低溫處理法、饑餓法、抑制法。4、 植物細胞固定化的方法有：吸附法、包埋法。5、 植物單細胞培養(yǎng)的方法有看護培養(yǎng)法、微室培養(yǎng)法、平板培養(yǎng)法、條件培養(yǎng)法。6、 原生質(zhì)體純化方法有沉降法、漂浮法、不連續(xù)梯度法。三、判斷1、 在選擇組織培養(yǎng)材料時，季節(jié)對外植體無明顯影響。（ ）2、 單細胞平板培養(yǎng)的效率是通過植板率來反映的。（ ）3、 植物細胞固定化培養(yǎng)可適用于各種次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。（ ）4、 原生質(zhì)體多在鹽溶液作滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（ ）5、 原生質(zhì)體分離常用的酶種類有纖維素酶類、果膠酶類、蝸牛酶和胼胝酶等。（ ）四、簡答題1、 簡述植物外植體選擇的基本原則。用于直接分離

54、植物細胞的外植體，必須選擇適當生長期的健康植株，并選擇細胞間粘連程度小的植物組織、器官。2、 植物細胞獲取的方法有哪些從外植體直接分離植物細胞通過愈傷組織誘導獲取植物細胞3、 簡述愈傷組織形態(tài)發(fā)生的途徑。a) 起始期，又稱誘導期，是指細胞準備進行分裂的時期。這個時期的細胞大小無明顯變化，細胞內(nèi)RNA含量迅速明顯增加，細胞核變大，酶活力相應(yīng)產(chǎn)生變化等。b) 分裂期，經(jīng)過誘導期之后，外植體外層細胞開始迅速分裂，進入分裂期。這一時期由于細胞分裂的速度大大超過細胞伸展的速度，細胞體積迅速變小，逐漸回復到分生狀態(tài)。在這個過程中細胞分裂進入最旺盛時期，細胞數(shù)目迅速增加，細胞體積小，細胞內(nèi)無大液泡，細胞核和核仁較大，RNA含量最高，DNA的含量基本保持不變。c) 形成期，形成期是經(jīng)過誘導期和分裂期之后形成愈傷組織的時期。這個時期的特征是細胞大小趨于穩(wěn)定，細胞分裂以從分裂期的周緣細胞分裂為主向以內(nèi)部較深的細胞分裂為主，隨著愈傷組