測序技術(shù)研究進(jìn)展

1、基因測序技術(shù)原理及進(jìn)展 基因測序 滿足高通量、高效率、高覆蓋度 (序列組成) 基因檢測 精準(zhǔn)、明確的目標(biāo)片段、個體差異（功能解釋）測序與檢測1975/19771985/19871990/2003測序技術(shù)發(fā)展時間軸 第1 代測序技術(shù)熒光標(biāo)記Sanger 法 第2 代測序技術(shù)循環(huán)陣列合成測序法 第3 代測序技術(shù)單分子測序法代次第一代 第二代第三代版本 3.2Sanger法 ABI ABI/GenoMe MSCompleteGenomicsSBS合成法測序IlluminaSBL連接法測序ABI/Polonator G.007SBP焦磷酸測序RocheSM-SBSF

2、DHelicosFEPacificBioscience/VisiGen納 米OxfordNanopore測序技術(shù)發(fā)展路線 化學(xué)裂解法 雙脫氧鏈終止法 熒光自動測序法 雜交測序法熒光標(biāo)記Sanger 法G1.1 化學(xué)裂解法對待測DNA 5末端進(jìn)行放射性標(biāo)記利用化學(xué)試劑在原DNA鏈某一種或某一類堿基處進(jìn)行專一性切割。設(shè)計4組相互獨立的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解產(chǎn)物。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，放射自顯影檢測獲取核苷酸序列。G1.2雙脫氧鏈終止法放射性標(biāo)記的4種dNTP混合底物中的一種每次將一種23-雙脫氧核苷酸(ddNTP)摻入到底物混合反應(yīng)液中參與DNA鏈的合成設(shè)計4組相互獨立的聚合反應(yīng)分別得

3、到不同末端終止的合成片段產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，放射自顯影檢測獲取核苷酸序列。 讀出模板讀出模板互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列dNTP 凝膠電泳凝膠電泳 較大片段較大片段 較小片段較小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物Klenow酶酶 未知序列的單鏈未知序列的單鏈DNA 讀出待測讀出待測序列序列CTGACTTCGACAAACAA5 3 A C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 在1985年, Smith等采用激光激發(fā)標(biāo)記的熒光,并用CCD檢測 20世紀(jì)80年代初Jorgenson和Lukacs提出了

4、毛細(xì)管電泳技術(shù) 1992年美國的Mathies實驗室首先提出陣列毛細(xì)管電泳(capillary array electrophoresis )新方法,并采用激光聚焦熒光掃描檢測裝置, 25只毛細(xì)管并列電泳,每只毛細(xì)管在1.5 h內(nèi)可讀出350 bp,DNA序列分析效率可達(dá)6 000 bp/h。G1.3 G1.3 熒光自動測序技術(shù)熒光自動測序技術(shù) 目前,應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(applied biosystems,ABI)3730系列自動測序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA測序儀,用CCD檢測系統(tǒng)識別,并直接翻譯DNA序列。310型全自動遺傳分析儀型全自動遺傳分析儀其他其他DNA

5、DNA全自動分析儀：全自動分析儀：ABI Prism 3100遺傳分析儀遺傳分析儀 3700型全自動遺傳分析儀型全自動遺傳分析儀ABI 3500 測序儀測序儀G1.4雜交測序技術(shù) 20世紀(jì)80年代末出現(xiàn), 利用DNA雜交原理,將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上,把待測的DNA樣品片段變性后與其雜交,根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。 優(yōu)點：檢測速度快, 檢測成本低,具有部分第二代測序技術(shù)的特點。 缺點：誤差較大,且不能重復(fù)測定。 第一代總結(jié) 通過幾十年的逐步改進(jìn),第1代測序儀的讀長可以超過1000 bp,原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%,測定每千堿基序列的成本是0.5美元,每

6、天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600,000堿基. 由于其對電泳分離技術(shù)的依賴,使其難以進(jìn)一步提升分析的速度和提高并行化程度,并且難以通過微型化降低測序成本.因此,需要開發(fā)全新的技術(shù)來突破這些局限.循環(huán)陣列合成測序法 第二代測序技術(shù)都采用了大規(guī)模矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)陣列上的DNA樣本可以被同時并行分析.此外,測序是利用DNA聚合酶或連接酶以及引物對模板進(jìn)行一系列的延伸,通過顯微設(shè)備觀察并記錄連續(xù)測序循環(huán)中的光學(xué)信號實現(xiàn)的.第2代測序技術(shù)工作流程測序儀品牌技術(shù)原理開發(fā)商Roche 454焦磷酸測序RocheIllumina Solexa邊合成邊測序IlluminaABI SOLiD基于磁珠的大規(guī)模并行

7、連接測序ABI第二代測序技術(shù)的關(guān)鍵特點：第二代測序技術(shù)的關(guān)鍵特點：第一,通過有序或者無序的陣列配置實現(xiàn)大規(guī)模的并行化,以提供高程度的信息密度;第二,不采用電泳設(shè)備易于微型化.相對于第1代測序技術(shù),樣本和試劑的消耗量得以降低.G2.1 焦磷酸測序核心技術(shù)：“微乳粒PCR”油包水結(jié)構(gòu)乳粒 酶化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 原理：原理：利用微乳滴PCR(emulsion PCR, emPCR)來生成擴(kuò)增產(chǎn)物.利用水溶液與油混合形成油包水結(jié)構(gòu)乳滴進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)的微型化學(xué)反應(yīng).堿基測定采用邊合成邊測序,利用焦磷酸法產(chǎn)生的光學(xué)信號來進(jìn)行檢測. 在三磷酸核苷結(jié)合到DNA鏈上的時候釋放焦磷酸,通過ATP硫酰化酶和熒光素酶產(chǎn)

8、生一系列級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致生物化學(xué)發(fā)光放出光信號. 優(yōu)點：焦磷酸測序的主要優(yōu)勢是它的速度和讀長（將近500 堿基）。除了DNA 聚合酶反應(yīng)所需化合物, 焦磷酸測序法并不需要額外的化合物用于DNA 鏈的延長, 降低了化學(xué)反應(yīng)出現(xiàn)意外的幾率。 缺點:這一技術(shù)平臺主要的錯誤類型來自于同聚物，即相同堿基的延伸, 另一個缺點是由于它依賴于包含一系列酶的焦磷酸檢測, 與其他二代測序技術(shù)相比, 其試劑價格相對較高。ATGATTTTTGATTTTTTG焦磷酸測序Base Calling Jonathan Rothberg博士是454的創(chuàng)始人。 2005年底，454公司推出Genome Sequencer 20 S

9、ystem (GS 20) ，開創(chuàng)了邊合成邊測序的先河。 2008又推出了性能更優(yōu)Genome Sequencer FLX System (GS FLX)，使讀長、準(zhǔn)確性進(jìn)一步提升。核心技術(shù)：“DNA簇”橋式PCR“可逆性末端終止子” 合成法測序 原理原理：使用熒光標(biāo)記的核苷酸以及可逆的終止子。在每一輪測序循環(huán)中, 標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的4 種核苷酸以及DNA聚合酶同時加入流通池通道中, 按照堿基互補(bǔ)配對的原則進(jìn)行DNA 鏈的延伸。每個核苷酸的3羥基是被封閉起來, 以防止額外的延伸。采集熒光圖像, 堿基特異的熒光標(biāo)記揭示了這一輪中新加入核苷酸是什么, 也就獲得模板中這一位置的DNA 序列。然后,打

10、開3端, 繼續(xù)進(jìn)行下一輪反應(yīng)。這一過程重復(fù)多次,到50 個循環(huán), 產(chǎn)生50 個堿基的DNA 序列。1000 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square40 million clusters per experimentPrepare DNA fragmentsLigate adaptersAttach single molecules to surfaceAmplify to form clusters20 micronsSequence5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTAFirst bas

11、e incorporatedCycle 1: Add sequencing reagentsRemove unincorporated basesDetect signalCycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat1、每輪測序反應(yīng)加入四種帶有熒光標(biāo)記的dNTP，末端帶有可以被去除的阻斷基團(tuán)2、每輪反應(yīng)只能整合一個核苷酸，儀器讀取相應(yīng)的熒光信號3、信號讀取結(jié)束，用化學(xué)方法去除阻斷基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測序反應(yīng)123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T The identity of each base of

12、a cluster is read off from sequential images根據(jù)每個點每輪反應(yīng)讀取的熒光信號序列，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA序列Base calling from the raw dataBase calling from the raw data 優(yōu)點：可擴(kuò)展的超高通量 ，需要樣品量少（低至100ng），運行成本較低，性價比高。成本低廉：每測量100萬個堿基對所需成本3美元；可精確讀取1 8個的連續(xù)重復(fù)堿基如AAAAAAAAAAAAAAAAAA，TTTTTTT。 缺點：其主要的缺點是由于光信號衰減和移相的原因使得序列讀長較短（熒光標(biāo)記、封閉基團(tuán)）。 Illumina公司于

13、2007年促成Genome Analyzer的商品化。 荷蘭科學(xué)家利用它首次繪出女性的基因組圖譜。此外第一個亞洲人圖譜，第一個癌癥病人圖譜和第一個非洲人圖譜全是依賴Genome Analyzer完成的。 Illumina估計占有60%左右的測序市場 連接法測序 核心技術(shù)： 熒光標(biāo)記的8核苷酸探針 雙堿基編碼策略原理：原理： 與454情況相同也采用了微乳滴PCR 與微球相結(jié)合的策略來擴(kuò)增DNA 模板。連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。SOLiD 利用探針的連接反應(yīng)讀取模板的利用探針的連接反應(yīng)讀取模板的DNA序列序列下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)

14、16種堿基對和4種探針顏色的對應(yīng)關(guān)系主要步驟： 231文庫準(zhǔn)備 SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測序模板:片段文庫( fragment library)或配對末端文庫(mate-paired library)。片段文庫就是將基因組DNA打斷,兩頭加上接頭,制成文庫。該文庫適用于轉(zhuǎn)錄組測序、RNA定量、miRNA研究、重測序、甲基化分析及ChIP測序等。配對末端文庫是將基因組DNA打斷后,與中間接頭連接,環(huán)化,然后用EcoP15酶切,使中間接頭兩端各有27 bp的堿基,最后加上兩端的接頭,形成文庫。該文庫適用于全基因組測序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排及拷貝數(shù)分析等。 232擴(kuò)增 SOLiD用的是與454技術(shù)類

15、似的乳液PCR對要測序的片段進(jìn)行擴(kuò)增。在微反應(yīng)器中加入測序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物,進(jìn)行乳液PCR(emulsion PCR)。PCR反應(yīng)結(jié)束后,磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同一DNA模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。 233微珠與玻片連接 乳液PCR完成之后,變性模板,富集帶有延伸模板的微珠,微珠上的模板經(jīng)過3修飾,可以與玻片共價結(jié)合。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納更高密度的微珠,在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量。含有DNA模板的磁珠共價結(jié)合在SOLiD玻片表面, SOLiD測序反應(yīng)就在SOLiD玻片表面進(jìn)行。每個磁珠經(jīng)SOLiD測序后得到一條序列。http:/綠宇生物科技 專業(yè)建庫 測序

16、 QQ:110199525每個探針進(jìn)行檢測的兩個堿基后面有三個匹配堿基，因此一條測序引物讀取的序列是不完整的每個探針進(jìn)行檢測的兩個堿基后面有三個匹配堿基，因此一條測序引物讀取的序列是不完整的測序引物與測序引物與adapteradapter退火退火探針連接，檢測熒光探針連接，檢測熒光切除熒光基團(tuán)切除熒光基團(tuán)第二輪探針連接，檢測熒光第二輪探針連接，檢測熒光切除熒光基團(tuán)切除熒光基團(tuán)測序引物沿著測序引物沿著Adapter移動移動5次，確保每個位點都被檢測次，確保每個位點都被檢測(二）（三）0位置是位置是Adapter的最后一個堿基，因此只檢測一次，的最后一個堿基，因此只檢測一次，該堿基是進(jìn)行解碼所必須

17、的。該堿基是進(jìn)行解碼所必須的。http:/綠宇生物科技 專業(yè)建庫 測序 QQ:110199525 優(yōu)點： SOLiD系統(tǒng)原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。就通量而言，SOLiD 3系統(tǒng)是革命性的，超高通量是該系統(tǒng)最突出的特點，目前SOLiD 3單次運行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍的人類基因組覆蓋度。 缺點：該技術(shù)主要的缺點是序列讀長相對較短（30-35bp）. 這也是由于同一簇擴(kuò)增產(chǎn)物中存在移相造成的。 2005年，在454推出了GS20焦磷酸測序平臺，ABI迅速收購了一家測序公司，并在2007年底推出了SOLiD 新一代測序平臺 。 以四

18、色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。 三種第二代測序技術(shù)對比三種第二代測序技術(shù)對比454 sequencing讀取長度大，400bp可以對未知基因組進(jìn)行從頭測序de novo sequencing當(dāng)遇到polymer時，如AAAAAA等，熒光強(qiáng)度和堿基個數(shù)不成線性關(guān)系，判定重復(fù)堿基個數(shù)有困難Solexa sequencing高度自動化的系統(tǒng)讀取片段多，適合進(jìn)行大量小片段的測序，如microRNA profiling基于可逆反應(yīng)，隨反應(yīng)輪數(shù)增加，效率降低，信號衰減，讀取序列較短，給de novo sequencing 拼接帶來困難SOLiD sequencing每

19、個堿基讀取兩次非常高的準(zhǔn)確性，特別是對于SNP的檢測靈活的系統(tǒng)，完善的磁珠編碼系統(tǒng)，可以進(jìn)行樣品的pooling，分割測序區(qū)域讀取長度受連接反應(yīng)的輪數(shù)限制，給de novo sequencing 拼接帶來困難http:/綠宇生物科技 專業(yè)建庫 測序 QQ:110199525G3 單分子測序(SMS) 第二代測序技術(shù)在制備測序文庫時都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外二代測序的讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時會遇到麻煩。為了克服這樣的缺點，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實時測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)。一些已經(jīng)或正在開發(fā)的平臺 Helicos Hel

20、iScope Pacific Biosciences Oxford Nanopore HeliScope近來市場上最早出現(xiàn)的單分子測序儀器.基于單個分子水平上邊合成邊測序的技術(shù).定位：待測DNA被隨機(jī)打斷成小片段，在每個小片段（200 bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上隨機(jī)固定多個poly-dT引物，其末端皆帶有熒光標(biāo)記，以利于精確定位。測序：逐一加入熒光標(biāo)記的可逆性末端終止子。通過摻入、檢測和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實時讀取大量序列。 成果：利用HeliScope測序儀，QuakeQuake博士本人的基因組報告發(fā)表在Nature Biotechnology上。他是繼James Wat

21、son和Craig Venter之后第三位基因組測序的非匿名個體。經(jīng)過4輪運行，他們產(chǎn)生了數(shù)十億個序列讀取，測序的覆蓋度達(dá)2828倍,覆蓋了90%90%的人類參考基因組。序列讀長24-70 bp,平均讀長為32 bp,并鑒定出280萬個SNP位點和752個拷貝數(shù)變異。這次測序花了4 4個星期的時間，試劑花費為4800048000美元。 Pacific Biosciences Pacific Biosciences公司致力于開發(fā)一種新的測序技術(shù)單分子實時技術(shù)(single molecule real time,SMRT)。 這一單分子合成測序技術(shù)依賴于被稱為零級波導(dǎo)(zero mode wave

22、guide,ZMW)的納米結(jié)構(gòu)來實時觀察DNA的聚合。 該結(jié)構(gòu)在一片薄金屬膜上刻出數(shù)以千計直徑數(shù)十納米的亞波長小孔.并將金屬膜附著在透明的支持基質(zhì)上.由于每個小孔的尺寸低于光的波長,所以當(dāng)光線從透明一側(cè)照射時無法透射.并且在每個小孔的底部形成指數(shù)衰減的消逝波,這樣創(chuàng)造了一個很小體積的檢測空間.每個小孔底部固定一個聚合酶分子. 激光在進(jìn)入ZMW后迅速衰減，因此，只有底部30 nm被照亮，隨后核苷酸涌入ZMW中，并在陣列表面擴(kuò)散。當(dāng)聚合酶檢測到正確的核苷酸時，便將其摻入新生鏈中，這個過程需要幾毫秒，而單純的擴(kuò)散只需要幾微秒。這種時間差使摻入的核苷酸產(chǎn)生了很高的信號強(qiáng)度，類似于脈沖信號。因此，ZMW

23、有能力在熒光標(biāo)記核苷酸的背景下檢測單個摻入事件。主要技術(shù)及現(xiàn)存問題： PacificBio的技術(shù)在高速測序、長序列產(chǎn)出和低成本方面有著巨大的潛力.但是,與其他單分子測序平臺一樣,實時檢測單個分子對于提高原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率是一個挑戰(zhàn),并可能成為一個障礙.如前所述,可以通過對同一樣品進(jìn)行重置后進(jìn)行多次測序來減少誤讀. Oxford Nanopore 設(shè)計一種基因工程蛋白質(zhì)納米孔.通過遺傳工程改造, 構(gòu)建一種將氨基化環(huán)糊精(Am-inocyclodextrin)配體共價連接到位于脂雙層膜中的-溶血蛋白內(nèi)的生物納米孔.納米孔中連接有一個核酸外切酶。當(dāng)從納米孔中連接有一個核酸外切酶。當(dāng)從DNA模板鏈上被陸續(xù)模板鏈上被陸續(xù)切割下來的核苷酸依次進(jìn)入納米孔時，就會與環(huán)糊精分子發(fā)切割下來的核苷酸依次進(jìn)入納米孔時，就會與環(huán)糊精分子發(fā)生暫時的結(jié)合，從而干擾通過納米孔的電流，每一個堿基都生暫時的結(jié)合，從而干擾通過納米孔的電流，每一個堿基都會有其特有的干擾電流產(chǎn)生。會有其特有的干擾電流產(chǎn)生。 優(yōu)點：儀器構(gòu)造簡單，使用成本低廉，不需要對核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，也不需要復(fù)雜的光學(xué)探測系統(tǒng)。同時因為它