測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展

1、基因測(cè)序技術(shù)原理及進(jìn)展 基因測(cè)序 滿足高通量、高效率、高覆蓋度 (序列組成) 基因檢測(cè) 精準(zhǔn)、明確的目標(biāo)片段、個(gè)體差異（功能解釋）測(cè)序與檢測(cè)1975/19771985/19871990/2003測(cè)序技術(shù)發(fā)展時(shí)間軸 第1 代測(cè)序技術(shù)熒光標(biāo)記Sanger 法 第2 代測(cè)序技術(shù)循環(huán)陣列合成測(cè)序法 第3 代測(cè)序技術(shù)單分子測(cè)序法代次第一代 第二代第三代版本 3.2Sanger法 ABI ABI/GenoMe MSCompleteGenomicsSBS合成法測(cè)序IlluminaSBL連接法測(cè)序ABI/Polonator G.007SBP焦磷酸測(cè)序RocheSM-SBSF

2、DHelicosFEPacificBioscience/VisiGen納 米OxfordNanopore測(cè)序技術(shù)發(fā)展路線 化學(xué)裂解法 雙脫氧鏈終止法 熒光自動(dòng)測(cè)序法 雜交測(cè)序法熒光標(biāo)記Sanger 法G1.1 化學(xué)裂解法對(duì)待測(cè)DNA 5末端進(jìn)行放射性標(biāo)記利用化學(xué)試劑在原DNA鏈某一種或某一類堿基處進(jìn)行專一性切割。設(shè)計(jì)4組相互獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解產(chǎn)物。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，放射自顯影檢測(cè)獲取核苷酸序列。G1.2雙脫氧鏈終止法放射性標(biāo)記的4種dNTP混合底物中的一種每次將一種23-雙脫氧核苷酸(ddNTP)摻入到底物混合反應(yīng)液中參與DNA鏈的合成設(shè)計(jì)4組相互獨(dú)立的聚合反應(yīng)分別得

3、到不同末端終止的合成片段產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，放射自顯影檢測(cè)獲取核苷酸序列。 讀出模板讀出模板互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列dNTP 凝膠電泳凝膠電泳 較大片段較大片段 較小片段較小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反應(yīng)混合物反應(yīng)混合物Klenow酶酶 未知序列的單鏈未知序列的單鏈DNA 讀出待測(cè)讀出待測(cè)序列序列CTGACTTCGACAAACAA5 3 A C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 在1985年, Smith等采用激光激發(fā)標(biāo)記的熒光,并用CCD檢測(cè) 20世紀(jì)80年代初Jorgenson和Lukacs提出了

4、毛細(xì)管電泳技術(shù) 1992年美國的Mathies實(shí)驗(yàn)室首先提出陣列毛細(xì)管電泳(capillary array electrophoresis )新方法,并采用激光聚焦熒光掃描檢測(cè)裝置, 25只毛細(xì)管并列電泳,每只毛細(xì)管在1.5 h內(nèi)可讀出350 bp,DNA序列分析效率可達(dá)6 000 bp/h。G1.3 G1.3 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù) 目前,應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(applied biosystems,ABI)3730系列自動(dòng)測(cè)序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA測(cè)序儀,用CCD檢測(cè)系統(tǒng)識(shí)別,并直接翻譯DNA序列。310型全自動(dòng)遺傳分析儀型全自動(dòng)遺傳分析儀其他其他DNA

5、DNA全自動(dòng)分析儀：全自動(dòng)分析儀：ABI Prism 3100遺傳分析儀遺傳分析儀 3700型全自動(dòng)遺傳分析儀型全自動(dòng)遺傳分析儀ABI 3500 測(cè)序儀測(cè)序儀G1.4雜交測(cè)序技術(shù) 20世紀(jì)80年代末出現(xiàn), 利用DNA雜交原理,將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上,把待測(cè)的DNA樣品片段變性后與其雜交,根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。 優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)速度快, 檢測(cè)成本低,具有部分第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。 缺點(diǎn)：誤差較大,且不能重復(fù)測(cè)定。 第一代總結(jié) 通過幾十年的逐步改進(jìn),第1代測(cè)序儀的讀長可以超過1000 bp,原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%,測(cè)定每千堿基序列的成本是0.5美元,每

6、天的數(shù)據(jù)通量可以達(dá)到600,000堿基. 由于其對(duì)電泳分離技術(shù)的依賴,使其難以進(jìn)一步提升分析的速度和提高并行化程度,并且難以通過微型化降低測(cè)序成本.因此,需要開發(fā)全新的技術(shù)來突破這些局限.循環(huán)陣列合成測(cè)序法 第二代測(cè)序技術(shù)都采用了大規(guī)模矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)陣列上的DNA樣本可以被同時(shí)并行分析.此外,測(cè)序是利用DNA聚合酶或連接酶以及引物對(duì)模板進(jìn)行一系列的延伸,通過顯微設(shè)備觀察并記錄連續(xù)測(cè)序循環(huán)中的光學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)的.第2代測(cè)序技術(shù)工作流程測(cè)序儀品牌技術(shù)原理開發(fā)商Roche 454焦磷酸測(cè)序RocheIllumina Solexa邊合成邊測(cè)序IlluminaABI SOLiD基于磁珠的大規(guī)模并行

7、連接測(cè)序ABI第二代測(cè)序技術(shù)的關(guān)鍵特點(diǎn)：第二代測(cè)序技術(shù)的關(guān)鍵特點(diǎn)：第一,通過有序或者無序的陣列配置實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的并行化,以提供高程度的信息密度;第二,不采用電泳設(shè)備易于微型化.相對(duì)于第1代測(cè)序技術(shù),樣本和試劑的消耗量得以降低.G2.1 焦磷酸測(cè)序核心技術(shù)：“微乳粒PCR”油包水結(jié)構(gòu)乳粒 酶化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 原理：原理：利用微乳滴PCR(emulsion PCR, emPCR)來生成擴(kuò)增產(chǎn)物.利用水溶液與油混合形成油包水結(jié)構(gòu)乳滴進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)的微型化學(xué)反應(yīng).堿基測(cè)定采用邊合成邊測(cè)序,利用焦磷酸法產(chǎn)生的光學(xué)信號(hào)來進(jìn)行檢測(cè). 在三磷酸核苷結(jié)合到DNA鏈上的時(shí)候釋放焦磷酸,通過ATP硫?；负蜔晒馑孛府a(chǎn)

8、生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致生物化學(xué)發(fā)光放出光信號(hào). 優(yōu)點(diǎn)：焦磷酸測(cè)序的主要優(yōu)勢(shì)是它的速度和讀長（將近500 堿基）。除了DNA 聚合酶反應(yīng)所需化合物, 焦磷酸測(cè)序法并不需要額外的化合物用于DNA 鏈的延長, 降低了化學(xué)反應(yīng)出現(xiàn)意外的幾率。 缺點(diǎn):這一技術(shù)平臺(tái)主要的錯(cuò)誤類型來自于同聚物，即相同堿基的延伸, 另一個(gè)缺點(diǎn)是由于它依賴于包含一系列酶的焦磷酸檢測(cè), 與其他二代測(cè)序技術(shù)相比, 其試劑價(jià)格相對(duì)較高。ATGATTTTTGATTTTTTG焦磷酸測(cè)序Base Calling Jonathan Rothberg博士是454的創(chuàng)始人。 2005年底，454公司推出Genome Sequencer 20 S

9、ystem (GS 20) ，開創(chuàng)了邊合成邊測(cè)序的先河。 2008又推出了性能更優(yōu)Genome Sequencer FLX System (GS FLX)，使讀長、準(zhǔn)確性進(jìn)一步提升。核心技術(shù)：“DNA簇”橋式PCR“可逆性末端終止子” 合成法測(cè)序 原理原理：使用熒光標(biāo)記的核苷酸以及可逆的終止子。在每一輪測(cè)序循環(huán)中, 標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的4 種核苷酸以及DNA聚合酶同時(shí)加入流通池通道中, 按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則進(jìn)行DNA 鏈的延伸。每個(gè)核苷酸的3羥基是被封閉起來, 以防止額外的延伸。采集熒光圖像, 堿基特異的熒光標(biāo)記揭示了這一輪中新加入核苷酸是什么, 也就獲得模板中這一位置的DNA 序列。然后,打

10、開3端, 繼續(xù)進(jìn)行下一輪反應(yīng)。這一過程重復(fù)多次,到50 個(gè)循環(huán), 產(chǎn)生50 個(gè)堿基的DNA 序列。1000 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square40 million clusters per experimentPrepare DNA fragmentsLigate adaptersAttach single molecules to surfaceAmplify to form clusters20 micronsSequence5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTAFirst bas

11、e incorporatedCycle 1: Add sequencing reagentsRemove unincorporated basesDetect signalCycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat1、每輪測(cè)序反應(yīng)加入四種帶有熒光標(biāo)記的dNTP，末端帶有可以被去除的阻斷基團(tuán)2、每輪反應(yīng)只能整合一個(gè)核苷酸，儀器讀取相應(yīng)的熒光信號(hào)3、信號(hào)讀取結(jié)束，用化學(xué)方法去除阻斷基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測(cè)序反應(yīng)123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T The identity of each base of

12、a cluster is read off from sequential images根據(jù)每個(gè)點(diǎn)每輪反應(yīng)讀取的熒光信號(hào)序列，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的DNA序列Base calling from the raw dataBase calling from the raw data 優(yōu)點(diǎn)：可擴(kuò)展的超高通量 ，需要樣品量少（低至100ng），運(yùn)行成本較低，性價(jià)比高。成本低廉：每測(cè)量100萬個(gè)堿基對(duì)所需成本3美元；可精確讀取1 8個(gè)的連續(xù)重復(fù)堿基如AAAAAAAAAAAAAAAAAA，TTTTTTT。 缺點(diǎn)：其主要的缺點(diǎn)是由于光信號(hào)衰減和移相的原因使得序列讀長較短（熒光標(biāo)記、封閉基團(tuán)）。 Illumina公司于

13、2007年促成Genome Analyzer的商品化。 荷蘭科學(xué)家利用它首次繪出女性的基因組圖譜。此外第一個(gè)亞洲人圖譜，第一個(gè)癌癥病人圖譜和第一個(gè)非洲人圖譜全是依賴Genome Analyzer完成的。 Illumina估計(jì)占有60%左右的測(cè)序市場(chǎng) 連接法測(cè)序 核心技術(shù)： 熒光標(biāo)記的8核苷酸探針 雙堿基編碼策略原理：原理： 與454情況相同也采用了微乳滴PCR 與微球相結(jié)合的策略來擴(kuò)增DNA 模板。連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。SOLiD 利用探針的連接反應(yīng)讀取模板的利用探針的連接反應(yīng)讀取模板的DNA序列序列下圖的雙堿基編碼矩陣規(guī)定了該編碼區(qū)

14、16種堿基對(duì)和4種探針顏色的對(duì)應(yīng)關(guān)系主要步驟： 231文庫準(zhǔn)備 SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測(cè)序模板:片段文庫( fragment library)或配對(duì)末端文庫(mate-paired library)。片段文庫就是將基因組DNA打斷,兩頭加上接頭,制成文庫。該文庫適用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RNA定量、miRNA研究、重測(cè)序、甲基化分析及ChIP測(cè)序等。配對(duì)末端文庫是將基因組DNA打斷后,與中間接頭連接,環(huán)化,然后用EcoP15酶切,使中間接頭兩端各有27 bp的堿基,最后加上兩端的接頭,形成文庫。該文庫適用于全基因組測(cè)序、SNP分析、結(jié)構(gòu)重排及拷貝數(shù)分析等。 232擴(kuò)增 SOLiD用的是與454技術(shù)類

15、似的乳液PCR對(duì)要測(cè)序的片段進(jìn)行擴(kuò)增。在微反應(yīng)器中加入測(cè)序模板、PCR反應(yīng)元件、微珠和引物,進(jìn)行乳液PCR(emulsion PCR)。PCR反應(yīng)結(jié)束后,磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大的同一DNA模板的擴(kuò)增產(chǎn)物。 233微珠與玻片連接 乳液PCR完成之后,變性模板,富集帶有延伸模板的微珠,微珠上的模板經(jīng)過3修飾,可以與玻片共價(jià)結(jié)合。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納更高密度的微珠,在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。含有DNA模板的磁珠共價(jià)結(jié)合在SOLiD玻片表面, SOLiD測(cè)序反應(yīng)就在SOLiD玻片表面進(jìn)行。每個(gè)磁珠經(jīng)SOLiD測(cè)序后得到一條序列。http:/綠宇生物科技 專業(yè)建庫 測(cè)序

16、 QQ:110199525每個(gè)探針進(jìn)行檢測(cè)的兩個(gè)堿基后面有三個(gè)匹配堿基，因此一條測(cè)序引物讀取的序列是不完整的每個(gè)探針進(jìn)行檢測(cè)的兩個(gè)堿基后面有三個(gè)匹配堿基，因此一條測(cè)序引物讀取的序列是不完整的測(cè)序引物與測(cè)序引物與adapteradapter退火退火探針連接，檢測(cè)熒光探針連接，檢測(cè)熒光切除熒光基團(tuán)切除熒光基團(tuán)第二輪探針連接，檢測(cè)熒光第二輪探針連接，檢測(cè)熒光切除熒光基團(tuán)切除熒光基團(tuán)測(cè)序引物沿著測(cè)序引物沿著Adapter移動(dòng)移動(dòng)5次，確保每個(gè)位點(diǎn)都被檢測(cè)次，確保每個(gè)位點(diǎn)都被檢測(cè)(二）（三）0位置是位置是Adapter的最后一個(gè)堿基，因此只檢測(cè)一次，的最后一個(gè)堿基，因此只檢測(cè)一次，該堿基是進(jìn)行解碼所必須

17、的。該堿基是進(jìn)行解碼所必須的。http:/綠宇生物科技 專業(yè)建庫 測(cè)序 QQ:110199525 優(yōu)點(diǎn)： SOLiD系統(tǒng)原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，是目前新一代基因分析技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。就通量而言，SOLiD 3系統(tǒng)是革命性的，超高通量是該系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLiD 3單次運(yùn)行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍的人類基因組覆蓋度。 缺點(diǎn)：該技術(shù)主要的缺點(diǎn)是序列讀長相對(duì)較短（30-35bp）. 這也是由于同一簇?cái)U(kuò)增產(chǎn)物中存在移相造成的。 2005年，在454推出了GS20焦磷酸測(cè)序平臺(tái)，ABI迅速收購了一家測(cè)序公司，并在2007年底推出了SOLiD 新一代測(cè)序平臺(tái) 。 以四

18、色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。 三種第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)比三種第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)比454 sequencing讀取長度大，400bp可以對(duì)未知基因組進(jìn)行從頭測(cè)序de novo sequencing當(dāng)遇到polymer時(shí)，如AAAAAA等，熒光強(qiáng)度和堿基個(gè)數(shù)不成線性關(guān)系，判定重復(fù)堿基個(gè)數(shù)有困難Solexa sequencing高度自動(dòng)化的系統(tǒng)讀取片段多，適合進(jìn)行大量小片段的測(cè)序，如microRNA profiling基于可逆反應(yīng)，隨反應(yīng)輪數(shù)增加，效率降低，信號(hào)衰減，讀取序列較短，給de novo sequencing 拼接帶來困難SOLiD sequencing每

19、個(gè)堿基讀取兩次非常高的準(zhǔn)確性，特別是對(duì)于SNP的檢測(cè)靈活的系統(tǒng)，完善的磁珠編碼系統(tǒng)，可以進(jìn)行樣品的pooling，分割測(cè)序區(qū)域讀取長度受連接反應(yīng)的輪數(shù)限制，給de novo sequencing 拼接帶來困難http:/綠宇生物科技 專業(yè)建庫 測(cè)序 QQ:110199525G3 單分子測(cè)序(SMS) 第二代測(cè)序技術(shù)在制備測(cè)序文庫時(shí)都需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，而這一PCR過程可能引入突變或者改變樣品中核酸分子的比例關(guān)系。另外二代測(cè)序的讀長普遍偏短，在進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接時(shí)會(huì)遇到麻煩。為了克服這樣的缺點(diǎn)，業(yè)界發(fā)展出了以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序和納米孔為標(biāo)志的第三代測(cè)序技術(shù)。一些已經(jīng)或正在開發(fā)的平臺(tái) Helicos Hel

20、iScope Pacific Biosciences Oxford Nanopore HeliScope近來市場(chǎng)上最早出現(xiàn)的單分子測(cè)序儀器.基于單個(gè)分子水平上邊合成邊測(cè)序的技術(shù).定位：待測(cè)DNA被隨機(jī)打斷成小片段，在每個(gè)小片段（200 bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上隨機(jī)固定多個(gè)poly-dT引物，其末端皆帶有熒光標(biāo)記，以利于精確定位。測(cè)序：逐一加入熒光標(biāo)記的可逆性末端終止子。通過摻入、檢測(cè)和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實(shí)時(shí)讀取大量序列。 成果：利用HeliScope測(cè)序儀，QuakeQuake博士本人的基因組報(bào)告發(fā)表在Nature Biotechnology上。他是繼James Wat

21、son和Craig Venter之后第三位基因組測(cè)序的非匿名個(gè)體。經(jīng)過4輪運(yùn)行，他們產(chǎn)生了數(shù)十億個(gè)序列讀取，測(cè)序的覆蓋度達(dá)2828倍,覆蓋了90%90%的人類參考基因組。序列讀長24-70 bp,平均讀長為32 bp,并鑒定出280萬個(gè)SNP位點(diǎn)和752個(gè)拷貝數(shù)變異。這次測(cè)序花了4 4個(gè)星期的時(shí)間，試劑花費(fèi)為4800048000美元。 Pacific Biosciences Pacific Biosciences公司致力于開發(fā)一種新的測(cè)序技術(shù)單分子實(shí)時(shí)技術(shù)(single molecule real time,SMRT)。 這一單分子合成測(cè)序技術(shù)依賴于被稱為零級(jí)波導(dǎo)(zero mode wave

22、guide,ZMW)的納米結(jié)構(gòu)來實(shí)時(shí)觀察DNA的聚合。 該結(jié)構(gòu)在一片薄金屬膜上刻出數(shù)以千計(jì)直徑數(shù)十納米的亞波長小孔.并將金屬膜附著在透明的支持基質(zhì)上.由于每個(gè)小孔的尺寸低于光的波長,所以當(dāng)光線從透明一側(cè)照射時(shí)無法透射.并且在每個(gè)小孔的底部形成指數(shù)衰減的消逝波,這樣創(chuàng)造了一個(gè)很小體積的檢測(cè)空間.每個(gè)小孔底部固定一個(gè)聚合酶分子. 激光在進(jìn)入ZMW后迅速衰減，因此，只有底部30 nm被照亮，隨后核苷酸涌入ZMW中，并在陣列表面擴(kuò)散。當(dāng)聚合酶檢測(cè)到正確的核苷酸時(shí)，便將其摻入新生鏈中，這個(gè)過程需要幾毫秒，而單純的擴(kuò)散只需要幾微秒。這種時(shí)間差使摻入的核苷酸產(chǎn)生了很高的信號(hào)強(qiáng)度，類似于脈沖信號(hào)。因此，ZMW

23、有能力在熒光標(biāo)記核苷酸的背景下檢測(cè)單個(gè)摻入事件。主要技術(shù)及現(xiàn)存問題： PacificBio的技術(shù)在高速測(cè)序、長序列產(chǎn)出和低成本方面有著巨大的潛力.但是,與其他單分子測(cè)序平臺(tái)一樣,實(shí)時(shí)檢測(cè)單個(gè)分子對(duì)于提高原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率是一個(gè)挑戰(zhàn),并可能成為一個(gè)障礙.如前所述,可以通過對(duì)同一樣品進(jìn)行重置后進(jìn)行多次測(cè)序來減少誤讀. Oxford Nanopore 設(shè)計(jì)一種基因工程蛋白質(zhì)納米孔.通過遺傳工程改造, 構(gòu)建一種將氨基化環(huán)糊精(Am-inocyclodextrin)配體共價(jià)連接到位于脂雙層膜中的-溶血蛋白內(nèi)的生物納米孔.納米孔中連接有一個(gè)核酸外切酶。當(dāng)從納米孔中連接有一個(gè)核酸外切酶。當(dāng)從DNA模板鏈上被陸續(xù)模板鏈上被陸續(xù)切割下來的核苷酸依次進(jìn)入納米孔時(shí)，就會(huì)與環(huán)糊精分子發(fā)切割下來的核苷酸依次進(jìn)入納米孔時(shí)，就會(huì)與環(huán)糊精分子發(fā)生暫時(shí)的結(jié)合，從而干擾通過納米孔的電流，每一個(gè)堿基都生暫時(shí)的結(jié)合，從而干擾通過納米孔的電流，每一個(gè)堿基都會(huì)有其特有的干擾電流產(chǎn)生。會(huì)有其特有的干擾電流產(chǎn)生。 優(yōu)點(diǎn)：儀器構(gòu)造簡單，使用成本低廉，不需要對(duì)核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，也不需要復(fù)雜的光學(xué)探測(cè)系統(tǒng)。同時(shí)因?yàn)樗?/p>