免疫磁珠技術(shù)

1、資料搜集：武菁菁、張端莉、譚玉榮、周夢柔資料搜集：武菁菁、張端莉、譚玉榮、周夢柔PPT制作：孫文靜、魏煒制作：孫文靜、魏煒報(bào)告人報(bào)告人 ：孫文靜：孫文靜目錄目錄1 1 免疫磁珠技術(shù)簡介免疫磁珠技術(shù)簡介1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.2 免疫磁珠技術(shù)2 2 免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用2.1 IMB技術(shù)在食品有害微生物檢測中的應(yīng)用2.2 免疫磁珠與其它檢測手段的聯(lián)用2.3 免疫磁珠技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用2.4 免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展方向1.1.免疫磁珠技術(shù)簡介免疫磁珠技術(shù)簡介1.1 1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.1.1 1.1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)免疫磁珠的結(jié)構(gòu) 免

2、疫磁珠（免疫磁珠（IMBIMB），）， 也稱免疫磁性微球，也稱免疫磁性微球， 是一是一種均勻、具有超順磁性及保護(hù)性殼的球形小粒子，種均勻、具有超順磁性及保護(hù)性殼的球形小粒子，基本上由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。其核心為基本上由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。其核心為順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子料，順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子料， 最外層最外層是免疫配基。是免疫配基。 載體微球載體微球 載體微球載體微球功能基功能基高分子層高分子層磁性物質(zhì)磁性物質(zhì)金屬小顆粒（金屬小顆粒（Fe2O3、Fe3O4）如聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙如聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸、酶類、多糖（淀粉

3、、烯脂、聚丙烯酸、酶類、多糖（淀粉、纖維素、葡聚糖、果膠等）、球蛋白纖維素、葡聚糖、果膠等）、球蛋白和牛血清白蛋白等，和牛血清白蛋白等，如氨基如氨基(-NH2)、羧基、羧基(-COOH)、羥基羥基(-OH)，使其表現(xiàn)具有疏水，使其表現(xiàn)具有疏水-親水、非極性親水、非極性-極性、帶正電荷極性、帶正電荷-帶帶負(fù)電荷等不同的物理性質(zhì)。負(fù)電荷等不同的物理性質(zhì)。 免疫配基免疫配基 免疫配基通過生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到免疫配基通過生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其表現(xiàn)出的物理性球制備材料和方法不同，其表現(xiàn)出的物理性

4、質(zhì)也不同，質(zhì)也不同， 從而可結(jié)合不同的免疫配基，從而可結(jié)合不同的免疫配基， 如抗原、抗體、凝集素、如抗原、抗體、凝集素、DNA 和和RNA 等。等。配基必須具有生物專一性的特點(diǎn)，配基必須具有生物專一性的特點(diǎn)， 而且載體而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或改變配基原有的微球與配基結(jié)合要不影響或改變配基原有的生物學(xué)特性，生物學(xué)特性， 保證磁珠的特殊識(shí)別功能。保證磁珠的特殊識(shí)別功能。1.1.2 1.1.2 免疫磁珠的性質(zhì)免疫磁珠的性質(zhì)由于免疫磁珠的大小和形狀具有均一性，由于免疫磁珠的大小和形狀具有均一性， 從而可使從而可使靶物質(zhì)迅速和有效地結(jié)合到磁珠上，也可使生成的靶物質(zhì)迅速和有效地結(jié)合到磁珠上，也可使

5、生成的新復(fù)合物在磁場中具有相同的磁響應(yīng)性，且行為一新復(fù)合物在磁場中具有相同的磁響應(yīng)性，且行為一致致磁珠的球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子有關(guān)的非磁珠的球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子有關(guān)的非特異性結(jié)合特異性結(jié)合順磁性可使磁珠置于磁場時(shí)顯示其磁性，并做定向順磁性可使磁珠置于磁場時(shí)顯示其磁性，并做定向移動(dòng)，移動(dòng)， 從磁場移出時(shí)磁性消除，從磁場移出時(shí)磁性消除， 磁珠分散，磁珠分散， 由此可由此可方便地進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向方便地進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕；保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕； 免疫配基可特異性地結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的抗原、免疫配基可特異性地結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的

6、抗原、抗體、核酸等生物活性物質(zhì)?？贵w、核酸等生物活性物質(zhì)。1.2 1.2 免疫磁珠技術(shù)免疫磁珠技術(shù)免疫磁珠免疫磁珠( ( immunomagneticimmunomagnetic bead, IMB) bead, IMB)技術(shù)：技術(shù)：是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測和分離技術(shù)。它是以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的目的。基本原理：基本原理：磁性微球經(jīng)過一定處理后,可將抗體結(jié)合到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗體與特異性抗原結(jié)合形成抗原微球復(fù)合物,該復(fù)合物在磁場中具有與其

7、它組分不同的磁響應(yīng)性,在磁力作用下,該復(fù)合物發(fā)生力學(xué)移動(dòng),從而達(dá)到分離抗原的目的。2.1 2.1 食品食品有害微生物檢測中的應(yīng)用有害微生物檢測中的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有顯著的免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，它能從樣品中優(yōu)點(diǎn)，它能從樣品中迅速、有選擇性地分離出迅速、有選擇性地分離出目的微生物，有效地減少了背景的干擾，提高目的微生物，有效地減少了背景的干擾，提高了精準(zhǔn)性。了精準(zhǔn)性。還能還能捕獲受損傷的靶細(xì)菌捕獲受損傷的靶細(xì)菌，而目前所用的幾種而目前所用的幾種常規(guī)方法則不具備這樣的能力。目前，免疫磁常規(guī)方法則不具備這樣的能力。目前，免疫磁珠技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品樣品中致

8、病微生物珠技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品樣品中致病微生物的檢測。的檢測。2 .2 .免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用2.1.1 2.1.1 大腸桿菌大腸桿菌O157O157的檢測的檢測 傳統(tǒng)分離傳統(tǒng)分離E.coli O157 H7所采用的直接分離所采用的直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時(shí)長、法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時(shí)長、工作量大等缺點(diǎn)。工作量大等缺點(diǎn)。采用免疫磁珠技術(shù)，能夠快速地從各種食品樣采用免疫磁珠技術(shù)，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集品中分離富集E.coli O157 H7，滿足流行病學(xué)，滿足流行病學(xué)的研究要求和提高控制力度。的研究要求和提高控制力度。 現(xiàn)在這種免疫

9、磁珠現(xiàn)在這種免疫磁珠的方法已經(jīng)被英國公共健的方法已經(jīng)被英國公共健康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法，我國也康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法，我國也已將免疫磁珠法已將免疫磁珠法對(duì)大腸桿菌對(duì)大腸桿菌O157的檢測納入的檢測納入國家標(biāo)準(zhǔn)國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 4789.36-2008）和和出入境檢出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 1059.5-2006)。 檢樣檢樣25g(mL)+225mL改良改良EC肉湯（肉湯（mEC+n），均質(zhì)），均質(zhì)225mL 免疫磁珠捕獲免疫磁珠捕獲涂布涂布CT-SMAC平板和改良平板和改良CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板弧菌顯色瓊脂平板挑取可疑菌落挑取

10、可疑菌落5個(gè)個(gè)10個(gè)，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種個(gè)，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種TSI MUG-LST 陽性陽性GB/T 4789.36-2008 GB/T 4789.36-2008 免疫磁珠捕獲法檢測程序免疫磁珠捕獲法檢測程序 陰性陰性 血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn) 非非O157細(xì)菌細(xì)菌 生化試驗(yàn)生化試驗(yàn) 報(bào)告報(bào)告36 1oC18h24h36 1oC36 1oC18h24h18h24h增菌增菌免疫磁珠捕獲與分離免疫磁珠捕獲與分離 1. 1.將將EppendorffEppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品使用個(gè)樣品使用1 1支支EppendorffE

11、ppendorff管，然后插人到磁板架上管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩。在漩渦混合器上輕輕振蕩E. coli O157E. coli O157免疫磁珠溶免疫磁珠溶液后，用開蓋器打開每支液后，用開蓋器打開每支EppendorffEppendorff管的蓋子，每管的蓋子，每管加人管加人20 20 L L E. coli 0157 E. coli 0157免疫磁珠懸液。免疫磁珠懸液。 2. 2.取取mEC+nmEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物肉湯增菌培養(yǎng)物1 1 mLmL，加人到，加人到EppendorffEppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩10 s10

12、 s。每個(gè)樣品更換每個(gè)樣品更換1 1支加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分支加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行，避免交叉污染開進(jìn)行，避免交叉污染。 具體操作步驟具體操作步驟 3. 3.結(jié)合結(jié)合: :在在18183030環(huán)境中，將上述環(huán)境中，將上述EppendorffEppendorff管管連同磁板架放在連同磁板架放在DynalDynal MXlMXl樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)手輕微轉(zhuǎn)10 min10 min，使，使E. coli O157E. coli O157與免疫磁珠充分接與免疫磁珠充分接觸。觸。 4. 4.捕獲捕獲: :將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在將磁板插人到磁板架

13、中濃縮磁珠。在3 min3 min內(nèi)內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁不斷地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時(shí)，在珠全部被收集起來，此時(shí)，在EppendorffEppendorff管壁中間管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。 5. 5.吸取上清液吸取上清液: :取取1 1支無菌加長吸管，從免疫磁珠聚集支無菌加長吸管，從免疫磁珠聚集物對(duì)側(cè)深人液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通物對(duì)側(cè)深人液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過免疫磁珠聚集物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁過免疫磁珠聚集物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取

14、的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到其放回到Eppendorff管中，并重復(fù)管中，并重復(fù)4步驟。每個(gè)樣品步驟。每個(gè)樣品換用換用1 1支無菌加長吸管。支無菌加長吸管。 6. 6.洗滌洗滌: :洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟 4 6 4 6 。 7. 7.重復(fù)上述步驟重復(fù)上述步驟4 5 4 5 。 8. 8.免疫磁珠懸浮免疫磁珠懸浮: :將免疫磁珠重新懸浮在將免疫磁珠重新懸浮在100 100 L L PBS-PBS-TweenTween 20 20洗液中。洗液中。 9. 9.涂布平板涂布平板: :用漩渦混合器將免疫磁珠混勻

15、，用加樣用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取器各取50 50 L L免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMACCT-SMAC平平板和改良板和改良CHROMagarCHROMagar O157 O157弧菌顯色瓊脂平板一側(cè)弧菌顯色瓊脂平板一側(cè)，然后用無菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，然后用無菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于3636士士1 01 0培養(yǎng)培養(yǎng)18 h-18 h-24 h -24 h 。菌落識(shí)別菌落識(shí)別 在在CT-SMACC

16、T-SMAC平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色; ;發(fā)酵山梨醇的菌發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色落為紅色; ;在改在改CHROMagarCHROMagarO157O157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色一紫紅色，邊緣無色或淺灰色。、較小的菌落，中心呈淡紫色一紫紅色，邊緣無色或淺灰色。初步生化試驗(yàn)初步生化試驗(yàn): : 在在CT-SMACCT-SMAC和改良和改良CHROMagarCHROMagarO157O157弧菌顯色瓊脂平板弧菌顯色瓊脂

17、平板上挑取上挑取5 5個(gè)個(gè)1010個(gè)典型或可疑菌落，分別接種個(gè)典型或可疑菌落，分別接種TSITSI瓊脂，同時(shí)接瓊脂，同時(shí)接種種MUG-LSTMUG-LST肉湯，于肉湯，于3636士士1 1培養(yǎng)培養(yǎng)18h24h18h24h。必要時(shí)進(jìn)行。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在TSITSI瓊脂中，典型菌株為斜面與瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫底層均呈陽性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫(H2S)(H2S)。置。置MUG-LSTMUG-LST肉湯管于長波紫外燈下觀察，無熒光產(chǎn)肉湯管于長波紫外燈下觀察，無熒光產(chǎn)生者為陽性結(jié)果，有熒

18、光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果生者為陽性結(jié)果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果; ;對(duì)分解乳糖且無熒對(duì)分解乳糖且無熒光的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于光的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于3636士士1 1培養(yǎng)培養(yǎng)18h24h18h24h，并進(jìn)行鑒定。，并進(jìn)行鑒定。大腸桿菌大腸桿菌O O157157的檢測的檢測FratamicoFratamico等將兔抗等將兔抗E.coli O157 H7多克隆抗體多克隆抗體連接到羊抗兔連接到羊抗兔IgGIgG包被的磁珠上，從食物增菌培包被的磁珠上，從食物增菌培養(yǎng)液中分離養(yǎng)液中分離O157H7O157H7菌株，再將帶菌的磁珠接種菌株，再將帶菌的磁珠接種到培養(yǎng)基上，加入熒光素標(biāo)記的到培養(yǎng)

19、基上，加入熒光素標(biāo)記的O157H7O157H7抗血清，抗血清，在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為10cfu/mL10cfu/mL增增菌培養(yǎng)液。菌培養(yǎng)液。DecoryDecory等建立了免疫磁珠等建立了免疫磁珠- -免疫脂質(zhì)體（免疫脂質(zhì)體（IMB/ILIMB/IL）熒光試驗(yàn)方法，可在熒光試驗(yàn)方法，可在8h8h內(nèi)快速檢測出多種液態(tài)樣內(nèi)快速檢測出多種液態(tài)樣品（水樣、蘋果汁、蘋果酒）中低至品（水樣、蘋果汁、蘋果酒）中低至1cfu/mL1cfu/mL的的E. coli O157 H7，而傳統(tǒng)微生物學(xué)方法不能從陰性而傳統(tǒng)微生物學(xué)方法不能從陰性樣本中區(qū)分出樣本中區(qū)分出E. co

20、li O157 H7感染樣本。感染樣本。 2.1.2 2.1.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測 傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測方法檢測周期長，傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測方法檢測周期長，約約5 514d14d，步驟繁瑣且靈敏度低，而，步驟繁瑣且靈敏度低，而IMBIMB技術(shù)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度時(shí)也可以通過的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度時(shí)也可以通過免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測，縮短了檢測免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測，縮短了檢測時(shí)間并進(jìn)一步降低了單增李斯特菌的檢測限。時(shí)間并進(jìn)一步降低了單增李斯特菌的檢測限。 2008年，我國將免疫磁珠檢測單核細(xì)胞增年，我國將免疫磁珠檢測單核細(xì)胞增生李斯特

21、菌的方法納入了出入境檢驗(yàn)檢疫行生李斯特菌的方法納入了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中(SN/T 0184.3-2008)。 檢樣檢樣25g(mL)對(duì)對(duì)225mLFB1増菌液（増菌液（3030 士士1 ，24h24h士士1h1h） 1mL轉(zhuǎn)種轉(zhuǎn)種10mL FB2増菌液増菌液（ 3535 ，24h24h士士1h1h）通過免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌通過免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌用用0.1mL的滅菌緩沖液重新制成懸液的滅菌緩沖液重新制成懸液吸取吸取50uL免疫磁珠懸液劃線于免疫磁珠懸液劃線于CHROMagar 顯色培養(yǎng)基，顯色培養(yǎng)基，OXA/PALCAM瓊脂平板（瓊

22、脂平板（35 +1 ,24h28h) 各各挑選挑選5個(gè)典型菌落個(gè)典型菌落接種于接種于TSA-YE瓊脂平板，純培養(yǎng)瓊脂平板，純培養(yǎng) 鑒定鑒定和確認(rèn)試驗(yàn)和確認(rèn)試驗(yàn) 單增李斯特菌的檢測方法單增李斯特菌的檢測方法 1 1樣品制備樣品制備22增菌增菌 3 3免疫磁珠分離免疫磁珠分離(IMS(IMS） 1) 1)免疫捕獲免疫捕獲混增菌培養(yǎng)液混增菌培養(yǎng)液. .沉淀所有的粗糙食物殘?jiān)恋硭械拇植谑澄餁堅(jiān)? .從增菌培從增菌培養(yǎng)液中移取養(yǎng)液中移取1mL1mL上層液體上層液體( (要盡可能避免移取到食物要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪顆粒顆粒和脂肪顆粒) )加人加人EppendorfEppendorf管中管中.

23、 .加加2020 L L準(zhǔn)備好準(zhǔn)備好的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液。 2 2）分離）分離將將EppendorfEppendorf管固定在磁架的管孔中。管固定在磁架的管孔中。1801800 0輕緩擺動(dòng)輕緩擺動(dòng)磁架磁架5 5次次- -6 6次次, ,使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開磁架使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開磁架上的上的EppendorfEppendorf管管蓋管管蓋, ,從磁極對(duì)面一側(cè)慢慢吸出液體，從磁極對(duì)面一側(cè)慢慢吸出液體，注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個(gè)樣品換一次槍頭注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個(gè)樣品換一次槍頭; ;加加11mImI滅菌的滅

24、菌的PBSPBS，并重新蓋好蓋子，并重新蓋好蓋子. .將磁極從支架上將磁極從支架上移走，移走，1801800 0輕緩擺動(dòng)磁架輕緩擺動(dòng)磁架5 5次一次一6 6次次, ,使管內(nèi)各成分混合使管內(nèi)各成分混合, ,后重新將磁極放回到支架上。重復(fù)該清洗步驟幾次。將后重新將磁極放回到支架上。重復(fù)該清洗步驟幾次。將離心管從磁性分離器上移開離心管從磁性分離器上移開. .并加并加100100 L L滅菌的滅菌的PBSPBS到到管中，重懸磁珠。如果實(shí)驗(yàn)室沒有磁性分離器管中，重懸磁珠。如果實(shí)驗(yàn)室沒有磁性分離器. .，可以，可以用手搖代替用手搖代替. . 4. 4.分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 1 1）分離培養(yǎng)）分離培養(yǎng) 吸取吸取

25、5050 L L免疫磁珠懸液免疫磁珠懸液. .加到顯色培養(yǎng)基及任一選加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇性培養(yǎng)基擇性培養(yǎng)基OXAOXA、PALCAMPALCAM瓊脂平板上瓊脂平板上. .用無菌接種用無菌接種環(huán)劃線環(huán)劃線.35.35士士1 1培養(yǎng)培養(yǎng)22h-48h22h-48h。22）篩選）篩選李斯特氏菌在李斯特氏菌在CHROMagarCHROMagar顯色培養(yǎng)基上菌落為顯色培養(yǎng)基上菌落為藍(lán)色藍(lán)色. .且在其周圍形成一個(gè)暈環(huán)。李斯特氏菌在且在其周圍形成一個(gè)暈環(huán)。李斯特氏菌在OXAOXA瓊脂平板上生長瓊脂平板上生長22h22h后菌落呈現(xiàn)黑色后菌落呈現(xiàn)黑色. .直徑為直徑為1mm.1mm.在在其周圍形成一個(gè)黑色

26、環(huán)。培養(yǎng)其周圍形成一個(gè)黑色環(huán)。培養(yǎng)48h48h，菌落仍呈黑色，菌落仍呈黑色. .直徑直徑2mm-3mm.2mm-3mm.除在菌落周圍有一環(huán)外除在菌落周圍有一環(huán)外. .在菌落中在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特氏菌在心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特氏菌在PALCAMPALCAM瓊脂平板上與在瓊脂平板上與在()XA()XA瓊脂平板上菌落相似。在瓊脂平板上菌落相似。在CHROMagarCHROMagar顯色培養(yǎng)基及顯色培養(yǎng)基及OXAOXA或或PALCAMPALCAM瓊脂平瓊脂平板上挑取板上挑取5 5個(gè)或更多可疑菌落個(gè)或更多可疑菌落. .接種于接種于TSA-YETSA-YE瓊脂平瓊脂平板上板上. .

27、純培養(yǎng)后進(jìn)鑒定。純培養(yǎng)后進(jìn)鑒定。5.5.鑒定和確認(rèn)鑒定和確認(rèn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測 Skjerve Skjerve等通過包被單克隆抗體的磁珠從等通過包被單克隆抗體的磁珠從不同食物樣品中分離李斯特菌，采用將磁不同食物樣品中分離李斯特菌，采用將磁珠接種到瓊脂平板培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌株鑒珠接種到瓊脂平板培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌株鑒定，此法的敏感性為定，此法的敏感性為10102 210104 4cfu/mLcfu/mL樣品。樣品。HudsonHudson等研究表明，將免疫磁珠技術(shù)與等研究表明，將免疫磁珠技術(shù)與PCRPCR結(jié)合，結(jié)合，24h24h內(nèi)即可檢出火腿中的單增李斯特內(nèi)即可檢

28、出火腿中的單增李斯特菌。菌。2.1.3 2.1.3 沙門氏菌的檢測沙門氏菌的檢測例例1：Notzon等用等用IMB-熒光熒光PCR檢測肉類中的檢測肉類中的沙門氏菌，實(shí)驗(yàn)包括非選擇性增菌、免疫磁珠沙門氏菌，實(shí)驗(yàn)包括非選擇性增菌、免疫磁珠分離、分離、DNA提取及提取及PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增，1213h即可完即可完成檢測過程，成檢測過程，IMB-熒光熒光PCR在檢測自然感染肉在檢測自然感染肉類和人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異類和人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。性。例例2：Blackburn 等將用生物素標(biāo)記的抗沙門等將用生物素標(biāo)記的抗沙門菌多價(jià)多克隆抗體連接到鏈霉親和素包被的磁菌多價(jià)多克隆抗

29、體連接到鏈霉親和素包被的磁珠上，以此試劑檢測從不同食物中提取的活沙珠上，以此試劑檢測從不同食物中提取的活沙門菌。此法的敏感性可達(dá)門菌。此法的敏感性可達(dá)105cfu/g 食物，總的食物，總的檢測時(shí)間從檢測時(shí)間從5d減少至減少至12d。IMBIMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)IMB技術(shù)適用于各類食品基質(zhì)中的沙門氏菌的快技術(shù)適用于各類食品基質(zhì)中的沙門氏菌的快速檢測，能速檢測，能快速有效富集快速有效富集食品基質(zhì)中的食品基質(zhì)中的目標(biāo)病原目標(biāo)病原菌菌，且有良好的，且有良好的靈敏度和特異性靈敏度和特異性，檢測限可達(dá)到，檢測限可達(dá)到110cfu/25g;在檢測時(shí)間方面可將常規(guī)檢測方在檢測時(shí)間方面可將常規(guī)檢測方法中的法

30、中的72小時(shí)檢測周期縮短至小時(shí)檢測周期縮短至40小時(shí)，而且能小時(shí)，而且能有效減輕過程交叉污染有效減輕過程交叉污染;篩選結(jié)果既可以與常規(guī)篩選結(jié)果既可以與常規(guī)的細(xì)菌生化和血清學(xué)聯(lián)用，也可以和顯色培養(yǎng)基、的細(xì)菌生化和血清學(xué)聯(lián)用，也可以和顯色培養(yǎng)基、熒光熒光PCR以及微生物全自動(dòng)鑒定儀器等方法聯(lián)以及微生物全自動(dòng)鑒定儀器等方法聯(lián)用，為食源性致病菌的檢測和鑒定提供了有效的用，為食源性致病菌的檢測和鑒定提供了有效的快速篩選技術(shù)快速篩選技術(shù)。2.1.4 2.1.4 金黃色葡萄球菌的檢測金黃色葡萄球菌的檢測例例1 1：陳伶俐等將人陳伶俐等將人IgG結(jié)合到磁珠上，用該磁結(jié)合到磁珠上，用該磁珠對(duì)樣品中的金黃葡萄球菌

31、進(jìn)行了快速分離檢驗(yàn)。珠對(duì)樣品中的金黃葡萄球菌進(jìn)行了快速分離檢驗(yàn)。取適量免疫磁珠，加入金黃葡萄球菌菌液中，磁取適量免疫磁珠，加入金黃葡萄球菌菌液中，磁場下分離磁珠，將分離前后的菌液及磁珠涂平板，場下分離磁珠，將分離前后的菌液及磁珠涂平板，并用大腸桿菌、白葡萄球菌等作對(duì)照。結(jié)果用此并用大腸桿菌、白葡萄球菌等作對(duì)照。結(jié)果用此磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的降低。對(duì)磁珠所涂平板的菌落進(jìn)行鑒定，證明為降低。對(duì)磁珠所涂平板的菌落進(jìn)行鑒定，證明為金黃葡萄球菌。應(yīng)用此法分離檢驗(yàn)此菌，富集速金黃葡萄球菌。應(yīng)用此法分離檢驗(yàn)此菌，富集速度快，靈敏度高，效果好。度快

32、，靈敏度高，效果好。例例2 2：劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁珠來檢劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁珠來檢測食品中金黃色葡萄球菌，該法能夠在測食品中金黃色葡萄球菌，該法能夠在30min內(nèi)內(nèi)富集檢測金黃色葡萄球菌且檢測低限可達(dá)富集檢測金黃色葡萄球菌且檢測低限可達(dá)100 CFU，同時(shí)磁珠可保持活性達(dá)，同時(shí)磁珠可保持活性達(dá)3周以上。周以上。2.1.5 2.1.5 副溶血性弧菌的檢測副溶血性弧菌的檢測Hara-Kudo等利用等利用IMS和顯色培養(yǎng)基分離貝類和顯色培養(yǎng)基分離貝類中產(chǎn)中產(chǎn)TDH的副溶血性弧菌的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利等利用副溶血性弧菌用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對(duì)極鞭

33、毛制備針對(duì)極鞭毛的單克隆抗體的單克隆抗體,這將有益于快速檢測從環(huán)境來源這將有益于快速檢測從環(huán)境來源的副溶血性弧菌。張凡非等利用的副溶血性弧菌。張凡非等利用IMS分離環(huán)境分離環(huán)境及食品中產(chǎn)生及食品中產(chǎn)生TDH副溶血性弧菌，分別從副溶血性弧菌，分別從1份份海水、海水、1份海泥和份海泥和3份蛤肉中檢出了神奈川現(xiàn)象份蛤肉中檢出了神奈川現(xiàn)象陽性陽性,并產(chǎn)生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌并產(chǎn)生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌,血清血清型為型為03:K6。IMBIMB技術(shù)優(yōu)點(diǎn)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)該方法與一般的細(xì)菌培養(yǎng)分離法相比該方法與一般的細(xì)菌培養(yǎng)分離法相比,極大地極大地提高了環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌提高了環(huán)境樣品及食

34、品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。利用的檢出率。利用IMS可有效地吸附、濃縮大量可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物樣品中的少量病原微生物, IMS為難于從環(huán)境及為難于從環(huán)境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問題提供一食品中分離病原性副溶血性弧菌的問題提供一種有效手段。種有效手段。2.1.6 2.1.6 其他致病菌的檢測其他致病菌的檢測志賀氏菌志賀氏菌例：例：IslamIslam等應(yīng)用等應(yīng)用O O抗原特異性單克隆抗體包被抗原特異性單克隆抗體包被免疫磁珠，快速檢測糞便中的疾痢志賀菌和福免疫磁珠，快速檢測糞便中的疾痢志賀菌和福氏志賀菌。分離出的志賀菌株用氏志賀菌。分離出的志賀菌株用PCRPCR

35、擴(kuò)增方法進(jìn)擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定。此種免疫磁珠分離與行鑒定。此種免疫磁珠分離與PCRPCR聯(lián)合法檢測志聯(lián)合法檢測志賀菌，較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法敏感、快速賀菌，較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法敏感、快速(7 h)(7 h)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌例：例：KapperudKapperud等用抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血等用抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清抗體包被磁性微球，從食物和水樣中分離，清抗體包被磁性微球，從食物和水樣中分離，并能將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與假結(jié)核耶爾森并能將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與假結(jié)核耶爾森氏菌和非致病性耶爾森氏菌區(qū)別開來。氏菌和非致病性耶爾森氏菌區(qū)別開來。2.22.2免疫免疫磁珠與其它檢測手段的聯(lián)用磁

36、珠與其它檢測手段的聯(lián)用2.2.1 2.2.1 免疫磁珠與免疫磁珠與PCRPCR的聯(lián)用的聯(lián)用 鑒于鑒于PCR PCR 技術(shù)靈敏度較低這一缺點(diǎn)，將免疫磁珠技術(shù)靈敏度較低這一缺點(diǎn)，將免疫磁珠技術(shù)和技術(shù)和PCR PCR 技術(shù)相結(jié)合，建立了新的檢測系統(tǒng)技術(shù)相結(jié)合，建立了新的檢測系統(tǒng) 磁免疫磁免疫PCRPCR。例如：它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，。例如：它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將菌進(jìn)行富集裂解，再以對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將菌進(jìn)行富集裂解，再以iapiap 基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行引物進(jìn)行PCRPCR結(jié)果顯示該方法具結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性，而且十分靈敏。有良好的特

37、異性，而且十分靈敏。 2.2.2 2.2.2 免疫磁珠與免疫磁珠與ELISAELISA的聯(lián)用的聯(lián)用 利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgGIgG抗體致敏，抗體致敏，制備特異性捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生制備特異性捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素標(biāo)記抗體為示蹤抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)親物素標(biāo)記抗體為示蹤抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)親和素建立和素建立ELISAELISA檢測系統(tǒng)，用于甘草藥材和含甘草中檢測系統(tǒng)，用于甘草藥材和含甘草中成藥中甘草蛋白的分析。結(jié)果成藥中甘草蛋白的分析。結(jié)果 用該方法對(duì)甘草藥材用該方法對(duì)甘草藥材和中成藥中甘草蛋白抗原檢測，檢測靈

38、敏度和中成藥中甘草蛋白抗原檢測，檢測靈敏度10ng10ngmLmL。免疫磁性捕獲。免疫磁性捕獲ELISAELISA檢測技術(shù)方便、快速、準(zhǔn)檢測技術(shù)方便、快速、準(zhǔn)確，為生藥的品種鑒定及中成藥的質(zhì)量控制提供一種確，為生藥的品種鑒定及中成藥的質(zhì)量控制提供一種新方法新方法。 2.2.3 2.2.3 免疫磁珠與發(fā)光檢測手段的聯(lián)用免疫磁珠與發(fā)光檢測手段的聯(lián)用 發(fā)光手段分析包括熒光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光分析發(fā)光手段分析包括熒光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光分析等。等。 免疫磁珠熒光微球免疫磁珠熒光微球2.3 IMB2.3 IMB技術(shù)在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用技術(shù)在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用2.3.12.3.1免疫檢測免疫檢測 IMB IM

39、B技術(shù)不僅應(yīng)用于食品中有害微生物的檢測，它技術(shù)不僅應(yīng)用于食品中有害微生物的檢測，它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景，它可以檢測腫瘤在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景，它可以檢測腫瘤細(xì)胞，如骨髓中腫瘤細(xì)胞的檢測和淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)細(xì)胞，如骨髓中腫瘤細(xì)胞的檢測和淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞的檢測。另外這種技術(shù)還可以對(duì)腫瘤進(jìn)行磁導(dǎo)向胞的檢測。另外這種技術(shù)還可以對(duì)腫瘤進(jìn)行磁導(dǎo)向治療和免疫磁性凈化治療。治療和免疫磁性凈化治療。2.3.2 2.3.2 細(xì)胞分離細(xì)胞分離細(xì)胞分離是免疫磁珠目前應(yīng)用最主要的一個(gè)方面，傳細(xì)胞分離是免疫磁珠目前應(yīng)用最主要的一個(gè)方面，傳統(tǒng)細(xì)胞分離技術(shù)有的比較費(fèi)時(shí)，有的十分昂貴，由于統(tǒng)細(xì)胞分離技術(shù)有的比較費(fèi)時(shí)，有的十分昂貴，由于免疫磁珠技術(shù)分離細(xì)胞時(shí)只需要抗體和磁鐵，既簡便免疫磁珠技術(shù)分離細(xì)胞時(shí)只需要抗體和磁鐵，既簡便靈敏又經(jīng)濟(jì)快捷。靈敏又經(jīng)濟(jì)快捷。分離細(xì)胞有兩種方式，用免疫磁珠直接從細(xì)胞混合液分離細(xì)胞有兩種方式，用免疫磁珠直接從細(xì)胞混合液中分離靶細(xì)胞的方法稱為中分離靶細(xì)胞的方法稱為陽性分離陽性分離，用免疫磁珠去除用