HPV分子生物學(xué)與宮頸病變病理診斷實(shí)用教案

1、 一，HPV簡(jiǎn)介 二，HPV與宮頸癌的關(guān)系(gun x) 三，HPV相關(guān)細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變及判讀要點(diǎn) 四，HPV檢測(cè)方法及宮頸病變的病理診斷 五，HPV疫苗的研究進(jìn)展第1頁(yè)/共58頁(yè)第一頁(yè)，共59頁(yè)。（一）（一）HPV簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介(jin ji)第2頁(yè)/共58頁(yè)第二頁(yè)，共59頁(yè)。1.完整的病毒顆粒為一個(gè)感染單位，外形呈20面體對(duì)稱型，外殼有72個(gè)衣殼體?；蚪M為環(huán)狀雙鏈DNA，含有近8000個(gè)堿基對(duì)。分為早期(zoq)區(qū)，晚期區(qū)和長(zhǎng)控區(qū)。Human papillomavirus（HPV）第3頁(yè)/共58頁(yè)第三頁(yè)，共59頁(yè)。早期轉(zhuǎn)錄區(qū)：參與病毒DNA的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，翻譯，調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化。晚期(wnq)轉(zhuǎn)錄區(qū)

2、：編碼病毒的衣殼蛋白。上游調(diào)控區(qū)：又稱長(zhǎng)控區(qū)，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)早期區(qū)基因的轉(zhuǎn)錄，參與病毒復(fù)制，轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。第4頁(yè)/共58頁(yè)第四頁(yè)，共59頁(yè)。HPVHPV基因組基因組早期轉(zhuǎn)錄區(qū)E1涉及病毒DNA復(fù)制，在病毒起始復(fù)制中起關(guān)鍵作用E2抑制病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制，E2失活直接導(dǎo)致E6，E7過(guò)度表達(dá)E4與病毒成熟胞漿蛋白有關(guān)，破壞胞漿中間細(xì)絲（纖維）， 促進(jìn)病毒顆粒釋放E5位于E2下游，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體激活上調(diào)控E6促進(jìn)P53過(guò)早降解而抑制P53功能，并能阻止和干擾細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞無(wú)限增生并向惡性轉(zhuǎn)化E7通過(guò)抑制pRB而消除細(xì)胞周期阻滯，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)L1主要衣殼蛋白，L

3、I:L2大約30:1L2次要衣殼蛋白長(zhǎng)控區(qū)URR或LCR調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄第5頁(yè)/共58頁(yè)第五頁(yè)，共59頁(yè)。第6頁(yè)/共58頁(yè)第六頁(yè)，共59頁(yè)。（二）（二）HPV與宮頸癌的關(guān)系與宮頸癌的關(guān)系(gun x)第7頁(yè)/共58頁(yè)第七頁(yè)，共59頁(yè)。 宮頸癌是第一個(gè)被確定有單一明確病因的癌癥，即高危型HPV感染。 HPV感染普遍存在，但是引起的宮頸癌卻相對(duì)(xingdu)少見。 高危型HPV總感染率大概在10%，15歲到25歲感染率最高。 HPV感染平均為6-9個(gè)月，70%的HPV感染在一年內(nèi)清楚，兩年內(nèi)的清除率可達(dá)90%第8頁(yè)/共58頁(yè)第八頁(yè)，共59頁(yè)。 HPV感染引起的低度病變（CIN1）不是癌前病變，大多會(huì)

4、自然轉(zhuǎn)愈，對(duì)于任何致癌性HPV，診斷CIN1并不意味著發(fā)展成CIN3的風(fēng)險(xiǎn)比活檢陰性者高。 HPV病毒量的多少跟宮頸癌的發(fā)生有一定的相關(guān)性，但是不成正比，不能預(yù)測(cè)疾病的進(jìn)展。 有效預(yù)防HPV感染，就能減少甚至(shnzh)不得宮頸癌。第9頁(yè)/共58頁(yè)第九頁(yè)，共59頁(yè)。 通過(guò)微小破損感染(gnrn)上皮組織。 通過(guò)胞吞作用使整個(gè)病毒顆粒侵入上皮基底層細(xì)胞，繼而通過(guò)不明的機(jī)制被傳送到細(xì)胞核。 正常情況下，病毒基因中的E1，E2，E4，E5低表達(dá)，有利于病毒基因組的維持和細(xì)胞增生。表達(dá)水平增高促進(jìn)病毒基因組復(fù)制。 隨著宿主角質(zhì)細(xì)胞開始分裂并逐漸分化為上皮表層，L1和L2蛋白表達(dá)促使病毒組裝形成感染(

5、gnrn)性病毒顆粒，而E4高表達(dá)則使細(xì)胞胞漿破壞，凹陷，促進(jìn)病毒釋放。HPV自然生活史（游離(yul)狀態(tài)）第10頁(yè)/共58頁(yè)第十頁(yè)，共59頁(yè)。 高危型HPV病毒持續(xù)性感染。 病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA發(fā)生整合，病毒與之整合的部 位位于E2編碼區(qū)。 HPV整合導(dǎo)致(dozh)E2片段缺失，失去了對(duì)E6，E7的正常調(diào)控，導(dǎo)致(dozh)其過(guò)度表達(dá)。 E6與P53結(jié)合并使之降解，并能阻止和干擾細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞無(wú)限增生并向惡性轉(zhuǎn)化。 E7與pRB結(jié)合，使E2F得以釋放，從而使細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化。 E6，E7編碼的原癌蛋白表達(dá)，導(dǎo)致(dozh)人類染色體端粒體酶逆

6、轉(zhuǎn)錄酶基因（hTERC）擴(kuò)增，維持端粒長(zhǎng)度，細(xì)胞永生，免于凋亡，發(fā)生癌變。HPV致癌機(jī)制(jzh)（整合狀態(tài)）第11頁(yè)/共58頁(yè)第十一頁(yè)，共59頁(yè)。 宮頸癌發(fā)生(fshng)過(guò)程：一過(guò)性HPV感染持續(xù)性HPV感染HPV病毒正常宮頸初次感染清除HPV感染的宮頸進(jìn)展逆轉(zhuǎn)癌前病變宮頸癌浸潤(rùn)中度細(xì)胞學(xué)異常第12頁(yè)/共58頁(yè)第十二頁(yè)，共59頁(yè)。 （三）HPV相關(guān)細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變(gibin)及判讀要點(diǎn)第13頁(yè)/共58頁(yè)第十三頁(yè)，共59頁(yè)。 多數(shù)HPV感染并沒(méi)有細(xì)胞學(xué)異常，大約只有30%的HPV感染會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞病理學(xué)變化。 HPV引起的細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變不僅僅表現(xiàn)挖空細(xì)胞特征，還包括ASC和HSIL的病變特

7、點(diǎn)。 挖空細(xì)胞只說(shuō)明有HPV感染，但無(wú)法分清楚是低危型還是高危型。 HPV分子生物學(xué)行為對(duì)應(yīng)(duyng)TBS報(bào)告術(shù)語(yǔ)。第14頁(yè)/共58頁(yè)第十四頁(yè)，共59頁(yè)。 典型的挖空細(xì)胞判讀為L(zhǎng)SIL，不典型的挖空細(xì)胞判讀為ASC-US或ASC-H. 理解LSIL的定義，其實(shí)(qsh)就是要弄清楚以下這個(gè)問(wèn)題： 組織學(xué)的CIN1指的是下1/3的細(xì)胞異型，而與之對(duì)應(yīng)的LSIL則是表層細(xì)胞形態(tài)的異常，如何解釋？第15頁(yè)/共58頁(yè)第十五頁(yè)，共59頁(yè)。LSIL第16頁(yè)/共58頁(yè)第十六頁(yè)，共59頁(yè)。LSIL第17頁(yè)/共58頁(yè)第十七頁(yè)，共59頁(yè)。糖原糖原(tn yun)溶解細(xì)胞溶解細(xì)胞VS挖挖空細(xì)胞空細(xì)胞第18頁(yè)/

8、共58頁(yè)第十八頁(yè)，共59頁(yè)。 LSIL（HPV病毒游離狀態(tài)，一過(guò)性感染） 細(xì)胞(xbo)學(xué)診斷的要點(diǎn)： 1.細(xì)胞(xbo)成熟，為表層細(xì)胞(xbo)來(lái)源。 2.核周空暈透亮，為胞漿塌陷或被破壞造成。第19頁(yè)/共58頁(yè)第十九頁(yè)，共59頁(yè)。LSIL ASC-US第20頁(yè)/共58頁(yè)第二十頁(yè)，共59頁(yè)。ASC-US第21頁(yè)/共58頁(yè)第二十一頁(yè)，共59頁(yè)。 ASC-US（可疑HPV一過(guò)性感染，無(wú)典型挖空表現(xiàn)） 細(xì)胞學(xué)診斷要點(diǎn)： 1.核有一定異型，有挖空趨勢(shì)，但核周空暈不透亮。 2.成片聚集的表層細(xì)胞，核輕度增大或雙核，可伴有角化(jio hu)不全現(xiàn)象。第22頁(yè)/共58頁(yè)第二十二頁(yè)，共59頁(yè)。HSIL第

9、23頁(yè)/共58頁(yè)第二十三頁(yè)，共59頁(yè)。 HSIL（HPV病毒整合狀態(tài)，持續(xù)性感染） 細(xì)胞學(xué)診斷要點(diǎn)(yodin)： 1.高核漿比。 2.核的異型性，主要體現(xiàn)在核膜的不規(guī)則以及核染色質(zhì)增粗。第24頁(yè)/共58頁(yè)第二十四頁(yè)，共59頁(yè)。CIN3第25頁(yè)/共58頁(yè)第二十五頁(yè)，共59頁(yè)。CIN3第26頁(yè)/共58頁(yè)第二十六頁(yè)，共59頁(yè)。 CIN3（ HPV病毒整合狀態(tài)，持續(xù)感染，向?qū)m頸癌進(jìn)展） 組織(zzh)學(xué)診斷要點(diǎn)： 1.核異型明顯（腫瘤異倍體細(xì)胞的表現(xiàn)）。 2.中表層細(xì)胞出現(xiàn)病理性核分裂像。 3.全層細(xì)胞密度增加，極性紊亂，喪失正常的組織(zzh)結(jié)構(gòu)。 4.表層細(xì)胞不出現(xiàn)典型的挖空細(xì)胞形態(tài)。第27頁(yè)

10、/共58頁(yè)第二十七頁(yè)，共59頁(yè)。（四）（四）HPV檢測(cè)檢測(cè)(jin c)方法及宮頸病變的病理診斷方法及宮頸病變的病理診斷第28頁(yè)/共58頁(yè)第二十八頁(yè)，共59頁(yè)。 HPV檢測(cè)： 1.病毒DNA檢測(cè) 2.病毒mRNA檢測(cè) 3.病毒相關(guān)(xinggun)蛋白檢測(cè) 4.病毒靶向檢測(cè)第29頁(yè)/共58頁(yè)第二十九頁(yè)，共59頁(yè)。 低危型HPV主要見于生殖器疣，常見的型別為6型和11型。 高危型HPV與癌前病變和宮頸癌相關(guān)，常見的型別為16型和18型。 檢測(cè)(jin c)方法有分型檢測(cè)(jin c)與不分型檢測(cè)(jin c)。HPV-DNA檢測(cè)(jin c)第30頁(yè)/共58頁(yè)第三十頁(yè)，共59頁(yè)。HC2（不分型）

11、第31頁(yè)/共58頁(yè)第三十一頁(yè)，共59頁(yè)。 操作步驟： 裂解雜交捕獲抗原抗體(kngt)反應(yīng)信號(hào)放大結(jié)果判讀第32頁(yè)/共58頁(yè)第三十二頁(yè)，共59頁(yè)。 HC2結(jié)果判讀：為陽(yáng)性，相當(dāng)于5000拷貝(kobi)。 如何正確理解HC2的檢測(cè)結(jié)果？第33頁(yè)/共58頁(yè)第三十三頁(yè)，共59頁(yè)。PCR-RDB（分型檢測(cè)（分型檢測(cè)(jin c)）DA8000全自動(dòng)核酸分子(fnz)雜交儀第34頁(yè)/共58頁(yè)第三十四頁(yè)，共59頁(yè)。 HPV-DNA分型檢測(cè)的臨床意義？ 能區(qū)分持續(xù)或反復(fù)感染。 不同型別有不同的患病風(fēng)險(xiǎn)。 不同型別有不同的處理方案(fng n)。 ASCCP2009版指南指出：30歲女性 細(xì)胞學(xué)陰性，而HP

12、V16或18型陽(yáng)性者，建議陰道鏡檢測(cè)。 細(xì)胞學(xué)陰性，其它HR-HPV型陽(yáng)性者，一年后復(fù)查HPV-DN 和細(xì)胞學(xué)。第35頁(yè)/共58頁(yè)第三十五頁(yè)，共59頁(yè)。 HPV E6，E7 mRNA檢測(cè)( jin c)HPV 的E6、E7是病毒癌基因，它們的翻譯產(chǎn)物介導(dǎo)抑癌基因p53和Rb的降解，從而干擾細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。如若癌基因沒(méi)有表達(dá)，則細(xì)胞本身不會(huì)發(fā)生癌變。 E6蛋白能與細(xì)胞內(nèi) E6相關(guān)蛋白 ( E6 AP)形成復(fù)合物 ,特異性地結(jié)合 p53,并通過(guò)依賴蛋白酶系統(tǒng)將其水解 ,使其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)調(diào)節(jié)功能喪失 ,從而引起細(xì)胞無(wú)限增生并向惡性轉(zhuǎn)化。 E7蛋白是 HPV的主要轉(zhuǎn)化蛋白 ,與控制細(xì)胞周期有關(guān)的腫瘤抑制

13、(yzh)蛋白視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白 (Rb)親和力極高 . E7與 Rb結(jié)合使 Rb E2F復(fù)合物解離 , E2F被游離 ,從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用 ,導(dǎo)致細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化。 HPV E6/E7mRNA 在宮頸組織中表達(dá)，說(shuō)明HPV 病毒表達(dá)出癌基因活性。 第36頁(yè)/共58頁(yè)第三十六頁(yè)，共59頁(yè)。bDNA技術(shù)技術(shù)(jsh)原理原理第37頁(yè)/共58頁(yè)第三十七頁(yè)，共59頁(yè)。 HPV 相關(guān)蛋白(dnbi)檢測(cè)人體的細(xì)胞周期包括G1，S,G2，M四個(gè)時(shí)相，且存在多個(gè)檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)各時(shí)相點(diǎn)的轉(zhuǎn)換及細(xì)胞周期進(jìn)程。其中以G1S期最為重要，因?yàn)?yn wi)細(xì)胞一旦從G1期進(jìn)入S期，則不再依賴外界信息刺激而

14、很快自動(dòng)完成分裂過(guò)程，因此G1卡點(diǎn)可以決定細(xì)胞繼續(xù)增值或進(jìn)入G0期或離開細(xì)胞周期進(jìn)入終末分化或死亡。細(xì)胞周期卡點(diǎn)的轉(zhuǎn)換受控于“細(xì)胞周期蛋白（cyclins）-細(xì)胞周期依賴性激酶（cdks）-細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子（clks）”這組分子網(wǎng)絡(luò)。研究最為廣泛的一組是：Cyclin D1/cdk4/P16。P16在細(xì)胞周期G1卡點(diǎn)中與CyclinD1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合cdk4并特異性抑制其活性，組織細(xì)胞尤其是帶有損傷DNA的細(xì)胞進(jìn)入S期，從而控制細(xì)胞分裂。第38頁(yè)/共58頁(yè)第三十八頁(yè)，共59頁(yè)。 P16： 1.在LSIL的敏感性和特異性為74%，在HSIL中則達(dá)到97%以上。 2.在LSIL中的表達(dá)(bio

15、d)為點(diǎn)狀，散在分布；在HSIL中的表達(dá)(biod)為灶狀，片狀連續(xù)分布。第39頁(yè)/共58頁(yè)第三十九頁(yè)，共59頁(yè)。P16第40頁(yè)/共58頁(yè)第四十頁(yè)，共59頁(yè)。P16第41頁(yè)/共58頁(yè)第四十一頁(yè)，共59頁(yè)。 Cyclin D1： 1.在正常宮頸組織中低表達(dá)，在CIN和宮頸鱗癌中表達(dá)增加并逐漸加強(qiáng)。 2.促進(jìn)細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞異常增殖。CyclinD1過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞G1期縮短(sudun)，細(xì)胞過(guò)度增殖失控而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。第42頁(yè)/共58頁(yè)第四十二頁(yè)，共59頁(yè)。 Ki-67: 1.在細(xì)胞周期的G1后期，S,G2，M期呈高表達(dá)，而在靜止的G0期細(xì)胞呈低表達(dá)。 半衰期短，脫離細(xì)胞周期后迅速降解

16、，檢測(cè)結(jié)果的可靠性明顯優(yōu)于半衰期長(zhǎng)的增殖細(xì)胞核抗原，是最能反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的蛋白標(biāo)志物之一。 用于CIN的鑒別( jinbi)診斷，主要用于萎縮性病例，而對(duì)反應(yīng)性改變，化生性改變，修復(fù)性改變意義不大（細(xì)胞增殖指數(shù)也很高）。第43頁(yè)/共58頁(yè)第四十三頁(yè)，共59頁(yè)。Ki-67第44頁(yè)/共58頁(yè)第四十四頁(yè)，共59頁(yè)。 HPV分子(fnz)靶向檢測(cè)hTERC:宮頸細(xì)胞由非典型性發(fā)育異常向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)變的過(guò)程中幾乎都伴有3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增。其中，涉及到的最重要(zhngyo)的基因可能是人類染色體末端酶（hTERC）基因。該基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，因而可導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生?，F(xiàn)已得知，3號(hào)染色體長(zhǎng)臂擴(kuò)增能準(zhǔn)確區(qū)分

17、宮頸細(xì)胞高度癌前病變與低度癌前發(fā)育異常，鑒別診斷的敏感性及特異性均在90%以上 第45頁(yè)/共58頁(yè)第四十五頁(yè)，共59頁(yè)。人類人類(rnli)染色體末端酶基因染色體末端酶基因-hTERC基因基因 hTERC基因定位在基因定位在hTERC基因的作用基因的作用(zuyng)：編碼人類染色體端粒酶的重要基因，編碼人類染色體端粒酶的重要基因， 影響細(xì)胞凋亡。影響細(xì)胞凋亡。 端粒酶活性端粒影響(yngxing)影響與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)hTERC基因狀態(tài)第46頁(yè)/共58頁(yè)第四十六頁(yè)，共59頁(yè)。TBSTBS分級(jí)正常/ /炎癥ASCUSASCUSASC-HASC-HLSILLSILHSILHSILTERCTERC

18、基因擴(kuò)增發(fā)生率（% %）4.64.613.513.528.628.625.225.287.787.7病理分級(jí)正常/ /炎癥CIN 1CIN 1CIN 2CIN 2CIN 3CIN 3原位癌TERCTERC基因擴(kuò)增發(fā)生率（% %）4.24.27.37.369.269.285.185.195.795.7hTERC檢測(cè)(jin c)的意義第47頁(yè)/共58頁(yè)第四十七頁(yè)，共59頁(yè)。48ASCUSCIN1CIN2/3TERC 基因(jyn)ASCCIN1LSIL與HSIL的輔助判斷(pndun)指標(biāo)第48頁(yè)/共58頁(yè)第四十八頁(yè)，共59頁(yè)。宮頸脫落細(xì)胞宮頸脫落細(xì)胞(xbo)FISH(xbo)FISH探針探針

19、CSP3TERChTERC基因(jyn)定位于 3號(hào)染色體著絲粒信號(hào)(xnho)第49頁(yè)/共58頁(yè)第四十九頁(yè)，共59頁(yè)。正常正常(zhngchng)擴(kuò)增hTERC基因(jyn)檢測(cè)（fish）第50頁(yè)/共58頁(yè)第五十頁(yè)，共59頁(yè)。（四）（四）HPV疫疫苗苗(ymio)第51頁(yè)/共58頁(yè)第五十一頁(yè)，共59頁(yè)。 目前已分離(fnl)出的HPV達(dá)100多型，其中至少14型可導(dǎo)致宮頸癌。 16型與18型是最常見的高危型，大約70%宮頸癌由這兩種型別引起。 6型和11型是最常見的低危型，與90%生殖器尖銳濕疣相關(guān)。 中國(guó)：HPV16（76.7%），HPV18（7.8%），HPV31（3.2%），HPV5

20、2（2.2%），HPV58（2.2%）。HPV流行病學(xué)(li xn bn xu)第52頁(yè)/共58頁(yè)第五十二頁(yè)，共59頁(yè)。 HPV疫苗： 四價(jià)疫苗（6,11,16,18） 2006年6月，美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)美國(guó)默克公司生成的四價(jià)預(yù)防性疫苗Gardasil的注冊(cè)。 建議針對(duì)9-26歲的女性(nxng)使用。在美國(guó)和其它部分國(guó)家，該疫苗還被批準(zhǔn)用于預(yù)防性男性生殖器疣。第53頁(yè)/共58頁(yè)第五十三頁(yè)，共59頁(yè)。 二價(jià)(r ji)疫苗（16,18）： 2007年注冊(cè)的英國(guó)葛蘭素史克生成的二價(jià)(r ji)疫苗Cervarix. 批準(zhǔn)用于10歲以上的女性。尚未申請(qǐng)?jiān)谀行灾惺褂玫倪m應(yīng)癥。第54頁(yè)/共58頁(yè)第五十四頁(yè)，共59頁(yè)。 疫苗為無(wú)菌混懸液