項目二超氧化物歧化酶(SOD)的生產(chǎn)-預習方案

1、項目二 超氧化物歧化酶（SOD）的生產(chǎn) 預習方案目錄 超氧化物歧化酶（SOD）的概述 超氧化物歧化酶（SOD）作用 超氧化物歧化酶（SOD）生產(chǎn)工藝 SOD酶的檢驗 酶活性的測定概述 超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，別名肝蛋白、簡稱：SOD。它是一種新型酶制劑，被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內(nèi)的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敵，是機體內(nèi)氧自由基的頭號殺手，是生命健康之本。 它生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動物，植物，微生物等，其來源有很多途徑，可以根據(jù)當?shù)氐脑蟻碓础⒊杀拘枨?、技術要求來選取不同的提取途徑

2、：植物提取、動物提取、微生物的生產(chǎn)發(fā)酵、人工合成等。作用 抗氧化 抗衰老 預防慢性疾病及其并發(fā)癥 抗疲勞 化療副作用的消除劑 避免手術的二次傷害（手術會引起大量的自由基，所以手術前后口服抗氧化劑來迅速恢復體力，加速傷口復原）生產(chǎn)工藝 流程圖 實驗目的 掌握有機溶劑沉淀法的原理和基本操作 掌握SOD酶提取分離的一般步驟 了解超氧化物歧化酶的活力的測定方法破碎組織細胞去除雜蛋白SOD的沉淀分離測定鄰苯三酚自氧化速率測定SOD樣液酶活性實驗原理 超氧化物歧化酶（SOD）是廣泛存在于生物體內(nèi)各種組織的一種金屬酶，是機體細胞抵御氧化損傷最重要的酶之一 SOD的主要功能是：清除體內(nèi)多余的自由基，延緩由于自

3、由基侵害而出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象，提高人體抵抗自由基誘發(fā)疾病的能力 大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)液的大蒜細胞中含有較豐富的SOD，組織或細胞破碎后，可用pH7.8的磷酸緩沖液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出實驗原理 有機溶劑的沉淀原理是有機溶劑能夠降低水溶液的介電常數(shù)，使得蛋白質(zhì)分子之間的靜電引力增大 同時，有機溶劑的親水性比溶質(zhì)分子的親水性強，它會搶奪本來與親水溶質(zhì)結(jié)合的自由水，破壞其表面的水化膜，導致溶質(zhì)之間的相互作用增大而發(fā)生聚集，從而沉淀析出離心技術 離心:借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同分子大小、密度的物質(zhì)分離的技術；要根據(jù)欲分離物質(zhì)及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機

4、、離心方法和離心條件。（臺式低速離心機）大蒜SOD的提取分離及純化方法 磷酸緩沖液提取法：大蒜SOD極性較大，易溶于水，根據(jù)“相似相溶”的原理，可用水來浸取大蒜SOD。但磷酸緩沖液可提高浸取效能，增加制品的穩(wěn)定性，減少雜質(zhì)，因此實際操作中常采用pH7.8的磷酸緩沖液代替水來浸取SOD，得到粗提取液。但該種方法缺點是浸出范圍廣，選擇性相對較差，容易浸出大量的無效成分。 超聲波破碎法：這是一種輔助浸取技術，超聲波的“空化作用”產(chǎn)生極大的壓力造成被粉碎物細胞壁或整個細胞的破碎，而且整個破碎過程在瞬間完成。 熱變性法：熱變性法是依據(jù)SOD的穩(wěn)定性原理設計的。SOD的熱穩(wěn)定性高，當溫度低于60時，短時將

5、的熱處理不會使酶活力有明顯的變化，而一般的雜蛋白卻在溫度高于55時就易變性沉淀，因此，對大蒜粗提液進行短時間的熱處理可以達到去除雜蛋白的目的。 有機溶劑分級沉淀法：利用向蛋白質(zhì)溶液中加入弱極性的有機溶劑，改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù)，使不同種類蛋白質(zhì)的溶解度產(chǎn)生不同程度降低的原理可進行蛋白質(zhì)的純化。在粗酶液中逐量加入丙酮，可使SOD及其它雜蛋白的溶解度發(fā)生變化，依次從溶液中沉淀出來。 生物材料的選取的總原則： 材料易得 便于操作 效果顯著 實驗所需材料：新鮮的大蒜蒜瓣 實驗所需儀器：燒杯、試管、容量瓶、研缽、冷凍離心機、電子天平、恒溫水浴箱、紫外分光光度計、容量瓶、pH計 實驗試劑：0.05mol/L的

6、磷酸緩沖液（pH為7.8）、氯仿-乙醇混合液、冷丙酮、50mmol/L的鄰苯三酚、10mmol/L的HCl操作步驟 組織細胞的破碎 稱取5g大蒜蒜瓣，置于研缽中研磨，使組織或細胞破碎；加入pH7.8的磷酸緩沖液15ml，繼續(xù)研磨20min，使SOD充分溶解到緩沖溶液中，然后6000r/min冷凍離心15min，棄沉淀，取上清液。 去除雜蛋白： 上清液中加入0.25體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15min，靜止30min(4C），6000r/min離心15min，棄去沉淀，得到的上清液即為粗酶液 SOD酶的沉淀分離： 粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min,6000r/min離心15min，得到

7、SOD酶沉淀。 將沉淀溶于pH7.8 0.05mol/L的磷酸緩沖液5ml中，然后6000r/min離心15min，棄沉淀，取上清液，用凝膠Sephacry1 S-200進行純化，然后超濾濃縮。 用紫外分光光度計測定濃縮液的蛋白含量 將濃縮液冷凍干燥后即得成品。SOD酶的檢驗 原理 鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出氧氣，生成帶色的中間產(chǎn)物。在自氧化過程的初始階段，黃色中間產(chǎn)物的積累在滯后3045s后就與時間成線性關系，一般線性時間維持在4min的范圍內(nèi)。中間產(chǎn)物在420nm處有強烈的光吸收，在有SOD存在時由于它能催化生成氧氣與過氧化氫，從而阻止了中間物的積累，通過計算就可以求出SO

8、D的酶活力。紫外分光光度計 基本結(jié)構(gòu)：光源、單色器、吸收池、檢測器、信號指示系統(tǒng) 原理：紫外分光光度計基本工作原理和紅外光譜儀相似，利用一定頻率的紫外可見光照射被分析的有機物質(zhì)，引起分子中價電子的躍遷，它將有選擇地被吸收。一組吸收隨波長而變化的光譜，反映了試樣的特征。在紫外可見光的范圍內(nèi)，對于一個特定的波長，吸收的程度正比于試樣中該成分的濃度，因此測量光譜可以進行定性分析，而且根據(jù)吸收與已知濃度的標樣的比較，還能進行定量分析。紫外分光光度計使用方法 打開電源開關 檢查吸收池成套性 選擇工作波長 選擇測量方式 潤洗比色皿，依次裝入?yún)⒈热芤汉蜏y量溶液 參比溶液于光路中，透射比模式下同時調(diào)0和100

9、% 在吸光模式下，測定測量溶液的吸光度酶活性的測定 鄰苯三酚自氧化速率的測定 在10ml試管中加入pH值為8.30的50mmol/L的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液4.50ml，在25+0.5的恒溫水浴中保溫10min，然后加入在25+0.5的恒溫水浴中事先預熱好的鄰苯三酚溶液（空白管用10mmol/L HCl代替），迅速搖勻倒入1cm比色皿中，以空白管為參比，在325nm下，每隔30s測一次吸光值，連續(xù)記錄3min，調(diào)節(jié)鄰苯三酚溶液用量，將其自氧化速率控制在0.070（+0.002）D/min。經(jīng)試驗測得鄰苯三酚溶液的用量為61樣品活性的測定 在10ml試管中加入pH為8.30的4.50

10、ml 50mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液和一定體積的樣液，在25+0.5的恒溫水浴中保溫10min，然后加入在25+0.5的恒溫水浴中事先預熱好的鄰苯三酚溶液61，（空白管用10mmol/L HCl代替），迅速搖勻倒入1cm比色皿中，以空白管為參比，在325nm下，每隔30s測一次吸光值，連續(xù)記錄3min，調(diào)節(jié)樣液體積，使樣液中鄰苯三酚的氧化速度控制在0.035（ +0.002）D/min，記錄此時樣液體積。SOD生產(chǎn)注意事項 在破碎細胞時要注意安全，一定要破碎的徹底。 PH的控制力度很重要，以及在實驗中的溫度等 要學會正確使用分光光度計 冷丙酮，一般用于細胞或組織固定，在作

11、冰凍切片免疫組化的 試驗中我們經(jīng)常用到，一般就是在切片前將丙酮放于4度冰箱就可以了，固定時一定要根據(jù)你所作材料確定固定時間，因為會引起組織萎縮。 在實驗過程中，所需化學試劑加入的量不是很準確，這可能是實驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)問題的另一個原因 在操作的過程中，加入鄰苯三酚后未混合均勻，可能致使化學反應進行得不很充分，這可能是造成實驗數(shù)據(jù)與預期不符的一個原因。 在操作工程中，每一步驟做到準確。參考文獻1徐固化，陳芳，生物化學與技術實訓 武漢：華中科技大學出版社，2010年1月；2楊榮武，高級生物化學實驗 北京：科學出版社，2012；3楊建雄，生物化學與分子生物學實驗技術教程 北京：科學出版社，2002年5月4黎瑞珍,楊慶建,陳貽銳.超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定及其應用研究J.瓊州大學學報.2004(05)5張宏,譚竹鈞.四種鄰苯三酚自氧化法測