微工第2章培養(yǎng)基制備與滅菌

1、第二章 培養(yǎng)基的制備與滅菌2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌1純種培養(yǎng)的基礎(chǔ)影響生長(zhǎng)、代謝、產(chǎn)物合成與純化1、培養(yǎng)基的組成？如何選擇培養(yǎng)基？ 2、如何制備培養(yǎng)基？ 3、如何對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌？2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌2第一節(jié) 培養(yǎng)基的原材料一、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分及用途 光 光能自養(yǎng) 自養(yǎng)菌 氫、硫、氨 化能自養(yǎng) 1.能源 亞硝酸鹽、亞鐵鹽 碳水化合物等有機(jī)物 石油天然氣和石油化工產(chǎn)品（如醋酸） 異養(yǎng)菌 功能：生長(zhǎng)、繁殖需要；2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌3 碳酸氣 2.碳源 淀粉水解糖、糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等 石油、正構(gòu)石蠟、天然氣 醋酸、甲醇、乙醇等石油化

2、工產(chǎn)品 功能：提供能量、構(gòu)成菌體、代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)；2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌4 有機(jī)氮：黃豆餅粉、花生餅粉、玉米漿、蛋白胨、 3.氮源 酵母粉、魚粉、發(fā)酵菌絲體、酒糟水等 無機(jī)氮： 尿素、硫酸銨、氨水、硝酸鹽 功能：構(gòu)成菌體、含氮代謝物；2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌5 磷酸鹽、鉀鹽、鈣鹽等礦物鹽 4.無機(jī)鹽 鐵、錳、鈷等微量元素 功能：構(gòu)成菌體，參與酶的組成，維持酶活性，調(diào)節(jié)滲透壓，調(diào)節(jié)pH值，維持氧化還原電位；2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌65.特殊生長(zhǎng)因子：硫胺素、生物素、對(duì)氨基苯甲酸、肌醇等 功能：酶的輔助部分，維持生命活動(dòng)；2022-5-1

3、9第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌76發(fā)酵的促進(jìn)劑與抑制劑發(fā)酵培養(yǎng)基中某些成分的加入有利于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，這些物質(zhì)包括前體、促進(jìn)劑和抑制劑2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌81）、前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)沒有多大的變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。 如：在青霉素生產(chǎn)中加入玉米漿，青霉素產(chǎn)量可從20u/mL增加到100u/mL，研究發(fā)現(xiàn)玉米漿中的苯乙胺被有限結(jié)合到青霉素分子中，從而提高了青霉素G的產(chǎn)量。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌92）、促進(jìn)劑：指那些既不是營(yíng)養(yǎng)物又不是

4、前體，但卻能提高產(chǎn)量的添加劑。比如在酶制劑發(fā)酵過程中，加入誘導(dǎo)物、表明活性劑及其它一些產(chǎn)酶促進(jìn)劑（比如吐溫80、植酸、洗衣粉等）2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌103）、抑制劑：在發(fā)酵過程中加入抑制劑會(huì)抑制某些代謝途徑的進(jìn)行，同時(shí)會(huì)使另外一些代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某種產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間物積累起來。 例如：微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油中，例如亞硫酸氫鈉，它與代謝過程中的乙醛生成加成物。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌117.水分功能：生化反應(yīng)均在水溶液中進(jìn)行2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌12二、培養(yǎng)基的類型1.依營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來源分類天然培養(yǎng)基；天然培養(yǎng)

5、基；合成培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基，也稱組合培養(yǎng)基（多用于定量研究）；半合成培養(yǎng)基，（半合成培養(yǎng)基，（用的最多，在部分天然有機(jī)碳源、氮源、生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)上，適當(dāng)加入一些化學(xué)藥品）；2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌132.依培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來分：1）固體培養(yǎng)基A、凝固培養(yǎng)基 ：即遇熱可融化，冷卻后則凝固的固體培養(yǎng)基B、非可逆性凝固培養(yǎng)基：指有血清凝固成的固體培養(yǎng)基或由無機(jī)硅膠配成的凝固后即不能再融化的固體培養(yǎng)基C、天然固體培養(yǎng)基：由天然固體狀基質(zhì)直接制成的培養(yǎng)基，如麩皮，米糠，木屑等D、濾膜：是一種堅(jiān)韌且?guī)в袩o數(shù)微孔的醋酸纖維薄膜，把它制成圓片狀覆蓋再營(yíng)養(yǎng)瓊脂或浸有培養(yǎng)液的纖維襯墊上，就形成了

6、具有固體培養(yǎng)基性質(zhì)的培養(yǎng)條件。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌142）半固體培養(yǎng)基 配置好的液體培養(yǎng)基中加入0.5%左右的瓊脂作為凝固劑，形成的培養(yǎng)基稱之微半固體培養(yǎng)基。 主要用于菌種鑒定，觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)特征及噬菌體的效價(jià)測(cè)定等2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌153）液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中8090%是水。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌163.依培養(yǎng)基的用途來分1）、孢子培養(yǎng)基2）、種子培養(yǎng)基3) 、 發(fā)酵培養(yǎng)基4）、補(bǔ)料培養(yǎng)基5）、加富培養(yǎng)基6）、選擇培養(yǎng)基7）、鑒別培養(yǎng)基8）、增殖和保存培養(yǎng)基9）、富集培養(yǎng)基10）、測(cè)定培養(yǎng)基2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與

7、滅菌17三、發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇一）、配置培養(yǎng)基的原則1、根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基2、注意各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配比3、調(diào)節(jié)適宜的物理化學(xué)條件4、根據(jù)培養(yǎng)微生物的目的配置5、盡量使用廉價(jià)易得的原料2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌181、生態(tài)模擬2、查閱文獻(xiàn)3、借助優(yōu)選法或正交試驗(yàn)法精心設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方4、實(shí)驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)的規(guī)模一般由定性到定量，由小到大。發(fā)酵培養(yǎng)基的用途與要求、成分、配比經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定，配制時(shí)兼顧原料來源、成本及工藝管理；（舉例1 ，2，3）二）、配置培養(yǎng)基的方法2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌19培養(yǎng)基配方舉例牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(常用的細(xì)菌培養(yǎng)基) 牛肉膏5

8、克 蛋白胨10克 NaCl5克 水1000毫升 pH7.27.4 (瓊脂1520克)高氏一號(hào)培養(yǎng)基(常用的放線菌培養(yǎng)基) 可溶性淀粉20克 KNO31克 K2HPO40.5克 MgSO40.5克 NaCl 0.5克 FeSO40.01克水1000毫升瓊脂1520克pH7.47.62022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌20察氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)霉菌用) 蔗糖 20克 NaNO33克 K2HPO41克 KCl1克 MgSO40.5克 FeSO40.01克 瓊脂20克 水1000毫升自然pH無氮培養(yǎng)基(培養(yǎng)自生固氮菌用) 葡萄糖 10克 NaCl0.2克 KH2PO40.2克 CaSO42H2O0.1

9、克 MgSO40.2克 CaCO35克 瓊脂 20克水1000毫升自然pH伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基(檢查腸道細(xì)菌用) 蛋白胨 10克 K2HPO42克乳糖10克瓊脂25克，水1000毫升，pH7.6 2伊紅水溶液2毫升0.5美藍(lán)水溶液2毫升將乳糖、伊紅、美藍(lán)分別滅菌后，加入滅菌的培養(yǎng)基中搖勻，倒平板。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌21四、原料轉(zhuǎn)換及意義1、節(jié)約原料，減低單耗，提高發(fā)酵單位和總收率；2、開拓新的原料資源和微生物資源：野生植物淀粉、植物纖維、木屑水解物、石蠟、醋酸、乙醇2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌22第二節(jié) 淀粉水解糖的制備一、淀粉水解糖的制備方法1、酸解法：定義

10、：以酸（無機(jī)酸或有機(jī)酸）為催化劑，在高溫高壓下將淀粉水解為葡萄糖的方法.優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備要求簡(jiǎn)單，水解時(shí)間短（20min），設(shè)備生產(chǎn)能力大缺點(diǎn)：高溫高壓下進(jìn)行，設(shè)備要求耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，副反應(yīng)多，對(duì)原料要求嚴(yán)格，淀粉顆粒不宜過大，淀粉乳濃度不能過高。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌232、酶解法：（雙酶水解法） 定義：用淀粉酶將淀粉水解為葡萄糖的過程。一般分為兩步：第一步是利用淀粉酶將淀粉液化轉(zhuǎn)為糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，這個(gè)過程稱為液化。第二步是利用糖化酶將糊精或低聚糖進(jìn)一步水解，轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，稱為糖化。也稱雙酶法2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌24-淀粉酶

11、（液化）葡萄糖淀粉酶（糖化）優(yōu)點(diǎn)：1、反應(yīng)條件溫和。 2、酶的專一性強(qiáng)，副反應(yīng)少 3、可在較高的淀粉乳濃度下水解 4、糖液的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富 5、糖液色澤淺，無苦味，有利于糖液的精制缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)（23）天，要求的設(shè)備多，糖液過濾困難。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌253、酸酶結(jié)合法酸酶法酶酸法2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌26二、淀粉酸水解理論基礎(chǔ)淀粉水解成葡萄糖的反應(yīng)過程中同時(shí)發(fā)生這：水解反應(yīng)、復(fù)合反應(yīng)、分解反應(yīng)；其中水解反應(yīng)是主要的。復(fù)合反應(yīng)：葡萄糖分子間經(jīng)1-6糖苷鍵結(jié)合成龍膽二糖（有苦味）、異麥芽糖和其他低聚糖（合稱復(fù)合低聚糖）。分解反應(yīng)：葡萄糖 羥甲基糠醛 有機(jī)酸

12、、色素等2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌27淀粉的水解反應(yīng)1.淀粉水解過程顏色變化：藍(lán)色 暗紫 紫 紅褐 暗紅 紅 淺紅糖苷鍵斷裂形成共軛酸進(jìn)攻糖苷鍵的OOHH3 2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌282、淀粉酸水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)屬于單分子一級(jí)反應(yīng)類型：K：反應(yīng)速度常數(shù)，由反應(yīng)條件（如溫度、酸度等）而定C：淀粉濃度dck cdt2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌293、影響酸水解的因素 酸的種類主要因素 濃度（酸的濃度、淀粉的濃度） 水解溫度2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌30（二）、葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)及其影響因素復(fù)合反應(yīng)：在淀粉的酸糖化過程中，水解生成的葡萄糖受

13、酸和熱的影響，葡萄糖分子之間通過糖苷鍵相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌31影響復(fù)合反應(yīng)的因素：1、淀粉濃度的影響（用DE值表示葡萄糖純度）：DE值還原糖/干物質(zhì)1002.、酸的影響：2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌32（三）葡萄糖的分解反應(yīng)及其影響因素葡萄糖 5-羥甲基糠醛 乙酰丙酸、蟻酸、有色素物質(zhì)；影響因素：濃度、溫度、pH值； 酸、熱2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌33第三節(jié) 糖蜜前處理一、糖蜜的來源與特點(diǎn)二、糖蜜前處理的方法1、加酸通風(fēng)沉淀法（冷酸通風(fēng)處理法）：糖蜜加水稀釋到500Bx 加入0.20.3濃硫酸，通入壓縮空

14、氣1h 靜置澄清8h，取上清液。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌342、加熱加酸沉淀法（熱酸通風(fēng)沉淀法）： 糖蜜加水稀釋到40 加適量硫酸調(diào)節(jié)pH值到44.5 放入澄清槽加熱至8090，通風(fēng)30min 保溫 7080 812 小時(shí)，取上清液。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌353、添加絮凝劑澄清處理法：糖蜜稀釋至3040 Bx 加硫酸調(diào)pH 33.8 加熱至90 添加8ppm聚丙烯酰胺（PAM），攪拌均勻 靜置1小時(shí)，取上清液。2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌36三、谷氨酸發(fā)酵糖蜜前處理1.糖蜜預(yù)處理法活性炭處理法樹脂處理法亞硝酸處理法2.添加化學(xué)藥劑處理法添加青

15、霉素法添加表面活性劑添加抗氧劑法2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌373.追加糖蜜法4. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異株法第四節(jié) 其他原料的處理一、纖維素及發(fā)酵廢液的處理（一）、利用纖維素廢料生產(chǎn)SCP稻草、麥稈、玉米的莖和葉、甘蔗渣、廢紙等流程如下：2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌38纖維原料 粉碎 水解 中和 澄清 過濾 發(fā)酵罐培養(yǎng) 分離 廢液 種子 營(yíng)養(yǎng)鹽 菌體 濃縮 磨碎 干燥 成品 2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌39（二）利用檸檬酸中和濾液生產(chǎn)酵母酵母菌種斜面一級(jí)種子二級(jí)種子離心分離中和廢液鹽酸調(diào)pH3.5發(fā)酵干燥粉碎包裝二次廢液用于發(fā)酵培養(yǎng)基的配置等2022-5-1

16、9第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌40二、亞硫酸鹽廢液的處理（一）亞硫酸鹽制漿廢液生產(chǎn)酒精和蛋白質(zhì)1、亞硫酸鹽紙漿廢液生產(chǎn)酒精2、亞硫酸鹽紙漿廢液發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)3、亞硫酸銨法非木材制漿廢液培養(yǎng)SCP （二）亞硫酸鹽廢液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸三、木屑水解液發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌41 第五節(jié) 培養(yǎng)基滅菌一、消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用消毒：指用物理和化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。消滅雜菌和防止雜菌污染2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌42二

17、、滅菌方法：干熱滅菌、濕熱滅菌、物理滅菌（射線、微波等）、化學(xué)滅菌（各種化學(xué)藥品）；1、干熱滅菌法 灼燒滅菌、在電熱或紅外線在設(shè)備內(nèi)加熱 主要用于保持干燥的物料、器具等2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌43 2、濕熱滅菌法 借助蒸汽釋放的熱使微生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，使微生物死亡。優(yōu)點(diǎn)： 1)蒸汽來源容易，操作費(fèi)用低廉，本身無毒 2)蒸汽具有很強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底 3)蒸汽均有很大的潛熱，冷凝后的水分有利于濕熱滅菌 4)蒸汽輸送可借助本身的壓強(qiáng)，調(diào)節(jié)方便，技術(shù)管理容易缺點(diǎn)： 1)設(shè)備費(fèi)用高 2)不能用于怕受潮的物料滅菌20

18、22-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌443、射線滅菌 紫外線、高速電子流的陰極射線、X射線和Y射線化學(xué)藥品滅菌法（1）第一大類：表面消毒劑高錳酸鉀溶液：0.10.25%、漂白粉 、75的酒精、新潔爾滅和杜滅芬、甲醛 37、戊二醛、過氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚類2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌45（2）第二大類：抗代謝藥物 化學(xué)結(jié)構(gòu)與微生物必須的代謝物類似 例如：磺胺類化合物取代氨基苯甲酸（3）第三大類：抗生素 2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌46三、加熱滅菌的原理1.、微生物的熱阻：微生物對(duì)熱的抵抗力； 致死溫度、致死時(shí)間2、微生物的熱致死動(dòng)力學(xué)：對(duì)數(shù)殘留定律2022-5-

19、19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌47一級(jí)反應(yīng)： 用N表示殘留活菌個(gè)數(shù)，則活菌的減少率（死亡率），與N呈線性關(guān)系，即：式中，K是反應(yīng)速度常數(shù)，對(duì)滅菌來講，是活菌的比熱致死速率常數(shù)，單位是min-1 ，其值與菌的種類和加熱溫度有關(guān)，需通過實(shí)驗(yàn)才能測(cè)定。NKddN2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌480000lnNKNdNNKdKNNeNN 積分邊界條件：N0N；t0=0式中， 滅菌時(shí)間（s）；N0 滅菌開始時(shí)，培養(yǎng)基中雜菌個(gè)數(shù)（個(gè)）；N 經(jīng)過滅菌時(shí)間后，殘存的活菌數(shù)（個(gè)）。 0001lnlnlnNNNKKNNKN 2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌493、熱致死反應(yīng)的速度常數(shù)K K是表

20、達(dá)微生物耐熱性的特征常數(shù) ，與微生物的種類和滅菌溫度有關(guān)。K越小，微生物越耐熱2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌502022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌512022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌524、滅菌溫度的選擇式中 E為菌體死滅反應(yīng)的活化能（J/mol），它是菌體死滅反應(yīng)的特征常數(shù)，所以，不同菌其熱死滅反應(yīng)的E不同。 TREeAK2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌532022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌54四、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)基中的顆粒、泡沫2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌55五、分批滅菌與連續(xù)滅菌一）、分批滅菌的操作過程（實(shí)罐滅菌）1）培養(yǎng)基的預(yù)熱培養(yǎng)基先加熱到8090，然后再導(dǎo)入蒸汽升溫到120180。目的：1）防止直接導(dǎo)入蒸汽時(shí)由于培養(yǎng)基與蒸汽的溫度過大而產(chǎn)生大量的冷凝水使培養(yǎng)基稀釋 2）防止直接導(dǎo)入蒸汽所造成的泡沫急劇上升而引起的物料外溢。方法：先將排氣閥打開2022-5-19第二章 培養(yǎng)基制備與滅菌562）培養(yǎng)基滅菌 從各路通