(公開課)分解尿素的細菌、分解纖維素的微生物的分離

1、允許允許特定種類特定種類的微生物生長，同時的微生物生長，同時抑制或阻止抑制或阻止其他種類其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基以尿素為以尿素為唯一氮源唯一氮源的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)基是是分離分離尿素尿素細菌細菌判斷該判斷該培養(yǎng)基培養(yǎng)基有無選有無選擇性擇性實驗組實驗組 對照組對照組培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型是否是否接種接種 目的目的 結(jié)果結(jié)果只生長尿只生長尿素細菌素細菌生長多種生長多種微生物微生物是是找規(guī)律：找規(guī)律：1：判斷某個培養(yǎng)基是否具有選擇作用時，：判斷某個培養(yǎng)基是否具有選擇作用時，應(yīng)設(shè)立應(yīng)設(shè)立_培養(yǎng)基進行對照。培養(yǎng)基進行對照。2

2、：判斷所使用的培養(yǎng)基是否被雜菌污染：判斷所使用的培養(yǎng)基是否被雜菌污染時，應(yīng)設(shè)立時，應(yīng)設(shè)立_培養(yǎng)基進行空培養(yǎng)基進行空白對照？白對照？基基 礎(chǔ)礎(chǔ)不接該菌種的不接該菌種的在設(shè)計實驗時，一定在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少要涂布至少3 3個平板，作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力個平板，作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與準(zhǔn)確性與準(zhǔn)確性。在分析實驗結(jié)果時，。在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗重新實驗。計算公式：計算公式：每克樣品中的菌株數(shù)每克樣品中的菌株數(shù) =（CV）M某同學(xué)

3、在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每克樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B（三）設(shè)置對照（三）設(shè)置對照判斷培養(yǎng)基的制備是否合格（有無被雜菌污染）：判斷培養(yǎng)基的制備是否合格（有無被雜菌污染）：將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。將未接種的培養(yǎng)基同時進行培養(yǎng)。判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用：完全培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng)完全培養(yǎng)基（營養(yǎng)成分齊全）接種后培養(yǎng)觀察菌落數(shù)目。觀察菌落數(shù)目。主要目的是主要目的是排除排除實驗組中實驗組中非測試因素非測試因素對實

4、驗對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。從肥沃、酸堿度接近中性的濕潤土壤中取樣。先鏟去先鏟去表層土表層土3 cm3 cm左右左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。用前都要滅菌。實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明實驗時要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)培養(yǎng)基類型基類型、培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間、稀釋度稀釋度。還少了什么嗎？還少了什么嗎？未接種的選擇培養(yǎng)基未接種的選擇培養(yǎng)基接種的完全培養(yǎng)基接種的完全培養(yǎng)基1 1

5、、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2 2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、稀釋度等。注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、稀釋度等。 三、三、纖維素是地球上含量最豐富纖維素是地球上含量最豐富的的多糖類多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過生的纖維素超過7070億噸；分億噸；分布植物的根、莖、葉中；

6、布植物的根、莖、葉中；纖維素生物燃料：纖維素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識纖維素酶纖維素酶纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識 纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過植物每年產(chǎn)生的纖維素超過7070億噸，其中億噸，其中40%-40%-60%60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會大量積累。不會大量積累。 在草食性動物等的消化道內(nèi)，也在草食性動物等的消化道內(nèi)，也共

7、生有共生有分解纖維素的微生物分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。能力。3 3、纖維素的分解、纖維素的分解請用一個簡單的實驗來驗證此問題請用一個簡單的實驗來驗證此問題纖維素酶水解濾紙實驗纖維素酶水解濾紙實驗1U表示表示1個酶活力單位，是指在溫度為個酶活力單位，是指在溫度為25，其他反應(yīng)條件，如，其他反應(yīng)條件，如pH等，均為最適的情況下，在等，均為最適的情況下，在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化內(nèi)轉(zhuǎn)化1mmol的底物所需的的底物所需的酶量。酶量。底物：酶所作用和催化的化合物。底物：酶所作用和催化的化合物。 試管A

8、B濾紙條1cmx6cm1cmx6cm緩沖液10ml11ml纖維素酶1ml/振動1h1h現(xiàn)象分解不分解纖維素酶的作用對照實驗（2 2）纖維素分解菌的篩選）纖維素分解菌的篩選1、篩選纖維素分解菌的方法、篩選纖維素分解菌的方法_。該方法可以通過該方法可以通過_反應(yīng)直接篩選。反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法剛果紅染色法顏色顏色2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成_，但不能和水解后的纖維二糖和葡萄但不能和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)纖維素被。當(dāng)纖維素被_分解后，分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_為中心的為中心的_，可以通過

9、，可以通過_ 來篩選纖維素分解菌。來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素酶纖維素分解菌纖維素分解菌 透明圈透明圈是否產(chǎn)生透明圈是否產(chǎn)生透明圈實驗原理實驗原理 即：可根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。即：可根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌?？筛鶕?jù)是否可根據(jù)是否產(chǎn)生產(chǎn)生透明圈透明圈來篩選纖維來篩選纖維素分解菌素分解菌練一練：練一練：1.1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是A. 纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B. 纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C. 纖維素酶可用于去掉植物的細胞

10、壁纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是菌，下列說法錯誤的是A. 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物 B. 剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物 C. 剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D. 若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩選出了纖維素分解菌選出了纖維素分解菌( (三三) )、實驗設(shè)計、實驗設(shè)計土壤土壤取樣取樣選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)梯

11、度梯度稀釋稀釋將樣品涂將樣品涂布到布到鑒別鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基挑選挑選菌落菌落什么什么樣的樣的環(huán)境環(huán)境取樣取樣?培養(yǎng)的目的培養(yǎng)的目的? ? 挑選什挑選什么樣的么樣的菌落菌落? ?鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基的特點的特點? ?如何鑒別如何鑒別? ?根據(jù)根據(jù)：微生物：微生物對生存環(huán)境的對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)要求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；環(huán)境中去找；目的：目的：增加纖維素增加纖維素分解菌的濃度，分解菌的濃度，以以確保能夠從樣品中確保能夠從樣品中分離到所需要的微分離到所需要的微生物；生物；剛果紅染色法剛果紅染色法對比課題對比課題3 3與課題與課題2 2實驗流程，實驗流程，說說它們的不同之處：說說它們的不同之處：課題課

12、題2 2土壤取樣，直接稀釋。土壤取樣，直接稀釋。課題課題3 3土壤取樣，選擇培養(yǎng)，土壤取樣，選擇培養(yǎng)，增加纖維素分解菌濃度后，再稀釋。增加纖維素分解菌濃度后，再稀釋。1、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基屬于屬于_（固體、液體）培（固體、液體）培養(yǎng)基，原因是養(yǎng)基，原因是_【資料二】選擇培養(yǎng)【資料二】選擇培養(yǎng)閱讀資料二閱讀資料二“選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)”，回答以下幾問題：，回答以下幾問題：液體液體沒有添加瓊脂沒有添加瓊脂2、該培養(yǎng)基對微生物、該培養(yǎng)基對微生物_（具有，不具有）選擇作用。（具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機制是如果具有，其選擇機制是_ 具有具有 能分解纖維素的微生物可

13、利用能分解纖維素的微生物可利用纖維素作為碳源而大量繁殖；纖維素作為碳源而大量繁殖；其他微生物繁殖被抑制其他微生物繁殖被抑制 生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。境。 將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應(yīng)該埋進土壤多深？應(yīng)該埋進土壤多深？ 將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設(shè)置

14、纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右的腐殖土壤中。左右的腐殖土壤中。提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖或者將纖維素改為葡萄糖。維素改為葡萄糖。 旁欄思考題旁欄思考題為什么選擇培養(yǎng)能為什么選擇培養(yǎng)能夠夠“濃縮濃縮”所需的微生物？所需的微生物？ 指微生物的種類少了，而指微生物的種類少了，而某些微生物的數(shù)量多了某些微生物的數(shù)量多了比較項目比較項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解

15、菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型類型目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理現(xiàn)象現(xiàn)象方法方法將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有尿素做氮源的選擇尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上將細菌涂布在纖維將細菌涂布在纖維素粉做主要碳源的素粉做主要碳源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株篩選菌株選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)101102103104105106培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、生長因子KH2PO4 0.25g無機鹽無機鹽土豆汁土豆汁 100mL碳源、

16、生長因子碳源、生長因子瓊脂瓊脂 15g凝固劑凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至餾水定容至1000mL氫元素、氧元素氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)方法一：方法一：方法二：方法二：步步驟驟培養(yǎng)基經(jīng)涂布培養(yǎng)培養(yǎng)基經(jīng)涂布培養(yǎng)先先長出菌長出菌落落再再覆蓋覆蓋1mg/mL的的CR溶溶液液(1015min后后)倒去倒去CR溶溶液液加入加入1mol/L的的NaCl溶液溶液15min后倒掉后倒掉NaCl溶液溶液出現(xiàn)透明圈出現(xiàn)透明圈配置配置10mg/mL的的CR溶液溶液滅菌滅菌按照按照1mLCR溶液溶液/200mL培

17、養(yǎng)培養(yǎng)基的比例基的比例混勻混勻倒平板倒平板接種后接種后培養(yǎng)培養(yǎng)出現(xiàn)透明圈出現(xiàn)透明圈優(yōu)優(yōu)點點顯示出的顏色基本上是纖顯示出的顏色基本上是纖維素分解菌的作用維素分解菌的作用操作簡便，不存在菌落的混雜問操作簡便，不存在菌落的混雜問題題缺缺點點操作繁瑣，加入剛果紅會操作繁瑣，加入剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜使菌落之間發(fā)生混雜由于產(chǎn)生淀粉酶的微生物也形由于產(chǎn)生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能產(chǎn)生假陽性成透明圈，所以可能產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。反應(yīng)。有些微生物具有降解色素的能有些微生物具有降解色素的能力，他們在培養(yǎng)過程中也會形成力，他們在培養(yǎng)過程中也會形成明顯的透明圈，與纖維素的分解明顯的透明圈，與纖維素的分解菌

18、不易區(qū)分。菌不易區(qū)分。兩種剛果紅染色法的比較兩種剛果紅染色法的比較：比較比較項目項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)原理原理培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類型型目的目的鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原原理理現(xiàn)現(xiàn)象象方方法法在細菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)在細菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細菌合成的脲酶將尿素中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，的堿性增強，pHpH升高。在培升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果果pHpH升高指示劑會變紅升高指示劑會變紅剛果紅可以與纖維素形成剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被紅色復(fù)合物，當(dāng)

19、纖維素被纖維素酶催化分解后紅色纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈菌為中心的透明圈觀察菌落周圍是否有著色的觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法脲酶檢測法剛果紅染色法剛果紅染色法方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？思考：思考： 漂洗作用漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶以免出現(xiàn)的透明圈

20、不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖活力的大小，實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強！當(dāng)然分解纖維素的能就強！ 四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與評價 1.1.培養(yǎng)基的制作是否合格培養(yǎng)基的制作是否

21、合格 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。則說明培養(yǎng)基制作合格。 四、結(jié)果分析與評價四、結(jié)果分析與評價2. .培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。了分解纖維素的微生物。3. .分離的結(jié)果是否一致分離的結(jié)果是否一致 由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分