酒精發(fā)酵和谷氨酸發(fā)酵的異同

1、一一.酒精發(fā)酵原料酒精發(fā)酵原料二二.酒精發(fā)酵微生物酒精發(fā)酵微生物三三. 酒精發(fā)酵生化機制酒精發(fā)酵生化機制酒精發(fā)酵酒精發(fā)酵 一、酒精發(fā)酵原料一、酒精發(fā)酵原料1.淀粉質原料 淀粉質原料是生產(chǎn)酒精的主要原料。我國發(fā)酵酒精的80%是用淀粉質原料生產(chǎn)的，其中以甘薯干等薯類為原料的約占45%，玉米等谷物為原料的約占35%。1.薯類原料薯類原料 甘薯北方俗稱紅薯、地瓜，南方稱為山芋，蕃薯。新鮮甘薯可能直接作酒精生產(chǎn)原料，但一般將鮮甘薯制成薯干，這樣便于保存并能供工廠全年使用。甘薯中固形物的主要成分是淀粉，還含有少量的糖類和蛋白質。甘薯干及鮮甘薯是一種良好的酒精生產(chǎn)原料，為我國大多數(shù)工廠所采用，是我國生產(chǎn)酒精

2、的主要薯類原料。3.谷物原料谷物原料 包括玉米、小麥、高梁、大米等。谷物原料也是很好的酒精生產(chǎn)原料。國際上最常用的谷物原料是玉米和小麥。我國由于人多地少，糧食珍貴，以往除玉米外，其他糧食一般較少用于生產(chǎn)酒精，只有當其他原料不足，或谷物受潮發(fā)熱霉變的情況下才用谷物原料。隨著我國糧食生產(chǎn)的發(fā)展，用于酒精生產(chǎn)的谷物數(shù)量會增加。2.糖質原料v 常用的糖質原料有糖蜜、甘蔗、甜菜和甜高梁等。v 糖蜜又稱廢糖蜜，它是干蔗或甜菜糖廠制糖過程中形成的一種副產(chǎn)物，分別稱為甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，其產(chǎn)量分別為加工甘蔗和甜菜間的30%左右和3.5%5%。糖蜜含糖量較高，一級甘蔗糖蜜含糖分50%以上，甜菜糖蜜含糖量50%左

3、右，所含主要成分為蔗糖甜高粱是一種高稈作物，起源于美國。其稈中含糖分10%12%，所結的高粱米富含淀粉，均可用于發(fā)酵酒精，是具有潛在發(fā)展前途的糖質原料。糖質原料生產(chǎn)酒精工序簡單，成本比較低，是酒精發(fā)酵的理想原料，只是制糖和其他發(fā)酵工業(yè)也都需要糖質原料，能用到酒精生產(chǎn)上的不太多，特別是我國糖質原料用于酒精生產(chǎn)較為有限。 纖維類物質是自然界中的可再生資源。其含量十分豐富。天然纖維原料由纖維素、半纖維素和木質素三大成分組成，它們均較難被降解，長期以來人們都在研究如何利用纖維質原料來生產(chǎn)酒精及其他化工產(chǎn)品。近年來，纖維素和半纖維素生產(chǎn)酒精的研究有了突破性的進展，纖維素和半纖維已成為很有潛力的酒精生產(chǎn)原

4、料。 (二)酒精發(fā)酵微生物許多微生物都能利用已糖化進行酒精發(fā)酵，但在實際生產(chǎn)中用于酒精發(fā)酵的幾乎全是酒精酵母，俗稱酒母。利用淀粉質原料的酒母在分類上叫啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，是屬于子囊菌亞門酵母屬的一種單細胞微生物。該種酵母菌繁殖速度快，發(fā)酵能力即產(chǎn)酒精能力強，并具有較強的耐酒精能力。常用的酵母的菌株有南陽酵母(1300及1308)、拉斯2號酵母(Rasse )、拉斯12號酵母(Rasse )、K字酵母、M酵母(Hefe M)、日本發(fā)研1號、卡爾斯伯酵母等。利用糖質原料的酒母除啤酒酵母外，還有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe

5、)和克魯維酵母(Kluyveromyces.sp)等 三、酒精發(fā)酵生化機制 C6H12O62C2H5OH+2CO2+能量 酵母菌在厭氧條件下可發(fā)酵己糖形成乙醇，其生化過程主要由兩個階段組成。第一階段己糖通過糖酵解途徑(EMP途徑) 由脫羧酶催化生成乙醛和二分解成丙酮酸。第二階段丙酮酸氧化碳，乙醛進一步被還原成乙醇，葡萄糖發(fā)酵成乙醇的總反應式為：v發(fā)酵過程中除主要生成乙醇外，還生成少量的其他副產(chǎn)物，包括甘油、有機酸（主要是琥珀酸）、雜醇油（高級醇）、醛類、酯類等，理論上1mol葡萄糖可產(chǎn)生2mol乙醇；即180克葡萄糖產(chǎn)生92克乙醇，的率為51.5%，可是實際得率沒有這么高。因酵母菌體的積累約需

6、2% 的葡萄糖，另外2%的葡萄糖用于形成甘油，0.5%用于形成有機酸，0.2%用于形成雜醇油。因此實際上只有約47的葡萄糖轉化成乙醇。乙醇發(fā)酵中大部分能量仍儲存于乙醇之中，所釋放的226kJ自由能中除67kJ(29)用于形成ATP外，其余能量以熱的形式散發(fā) 谷氨酸發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵v氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵。由發(fā)酵所生成的產(chǎn)物氨基酸，都是微生物的中間代謝產(chǎn)物，它的積累的關鍵是取決于是否能打破微生物的正常代謝調節(jié)。（一）合成谷氨酸的生化途徑（二）谷氨酸生成菌的生化特征（三）GA 生物合成的理論得率（四）生物素對GA發(fā)酵的影響（五）GA發(fā)酵的外在因素（六）谷氨酸發(fā)酵工藝谷氨酸產(chǎn)生菌因環(huán)境條件變化

7、而引起的發(fā)酵轉換谷氨酸產(chǎn)生菌因環(huán)境條件變化而引起的發(fā)酵轉換環(huán)境因子環(huán)境因子發(fā)發(fā) 酵酵 產(chǎn)產(chǎn) 物物 轉轉 換換溶解氧溶解氧谷氨酸谷氨酸乳酸和琥珀酸乳酸和琥珀酸酮戊二酸酮戊二酸（通氣不足）（通氣不足）（適中）（適中） （通風過量，轉速過快）（通風過量，轉速過快）NH4+酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺（適量）（適量）（缺乏）（缺乏）（過量）（過量）pH值值谷氨酰胺，谷氨酰胺，N-乙酰谷酰胺乙酰谷酰胺谷氨酸谷氨酸（pH值值55.8，NH4+過多）過多）（中性或微堿性）（中性或微堿性）磷酸磷酸纈纈 氨氨 酸酸谷氨酸谷氨酸（高濃度磷酸鹽）（高濃度磷酸鹽） （磷酸鹽適中）（磷酸鹽適中）生物素生

8、物素乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸谷氨酸谷氨酸（過量）（過量）（限量）（限量）（一）合成谷氨酸的生化途徑生化途徑葡萄糖丙酮酸草酰乙酸檸檬酸琥珀酸透過細胞膜異檸檬酸- 酮戊二酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸的生物合成途徑大致是：谷氨酸的生物合成途徑大致是：葡萄糖葡萄糖經(jīng)糖酵解（經(jīng)糖酵解（EMP途徑）途徑）和己糖磷酸支路（和己糖磷酸支路（HMP途徑）生成途徑）生成丙酮酸丙酮酸，再氧化成乙酰輔酶，再氧化成乙酰輔酶A（乙酰（乙酰COA），然后進入三羧酸循環(huán)，生成），然后進入三羧酸循環(huán)，生成酮戊二酸酮戊二酸。酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下，生存在的條件下，生成成谷氨酸

9、谷氨酸。GlucoseGlucose的酵解，的酵解，EMPEMPGlucoseGlucose的有氧氧化，的有氧氧化，HMPHMP丙酮酸的有氧氧化，丙酮酸的有氧氧化，TCATCA循循環(huán)環(huán)乙醛酸循環(huán)途徑，乙醛酸循環(huán)途徑，DCADCA循環(huán)循環(huán)COCO2 2固定反應固定反應-KGA-KGA的還原氨基化的還原氨基化v主要的生產(chǎn)菌種： v（1） 棒狀桿菌屬 谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)：生物素缺陷型、溫度敏感型；北京棒桿菌；鈍齒棒桿菌 v（2） 短桿菌屬 黃色短桿菌；天津短桿菌（二）谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征（二）谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征內(nèi)在因素內(nèi)在因素 v1 1 生物

10、素缺陷型生物素缺陷型v谷氨酸產(chǎn)生菌大多數(shù)為生物素缺陷型,谷氨酸發(fā)酵時, 控制生物素亞適量(貧乏量) ,引起菌種代謝失調, 使谷氨酸得到大量積累。v2 2 具有具有COCO2 2 固定反應的酶系固定反應的酶系v菌種能利用CO2 產(chǎn)生大量草酰乙酸, 有利于谷氨酸的大量積累。v3.-KGA3.-KGA脫氫酶酶活性微弱或喪失脫氫酶酶活性微弱或喪失v這是菌體生成并積累-KGA的關鍵，-KGA是菌體進行TCA循環(huán)的中間性產(chǎn)物，很快在-KGA脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶A，在正常的微生物體內(nèi)他的濃度很低，也就是說，由-KGA進行還原氨基化生成GA的可能性很少。只有當體內(nèi)只有當體內(nèi)-KGA-KGA脫脫

11、氫酶活性很低時，氫酶活性很低時，TCATCA循環(huán)才能夠停止，循環(huán)才能夠停止，-KGA-KGA才得以積累，為才得以積累，為谷氨酸的生成奠定物質基礎。谷氨酸的生成奠定物質基礎。v4.GA4.GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPHNADPH氧化能力欠缺或喪失氧化能力欠缺或喪失v（1）NADPH是-KGA-KGA還原氨基化還原氨基化生成GA必須物質，該還原氨基化所需要的NADPH是與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)相偶聯(lián) 的。v（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的NADPH有一定的積累，NADPH抑制-KGA的脫羧氧化。v5. 乙醛酸循環(huán)（乙醛酸循環(huán)（DCA）的關鍵酶）的關鍵酶異檸檬酸裂解酶異檸

12、檬酸裂解酶v該酶是一種別構酶別構酶，通過該酶酶活性的調節(jié)來實現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，糖的代謝才能沿著 - 酮戊二酸的方向進行, 從而有利于谷氨酸的積累。v6. 強烈的強烈的L-谷氨酸脫氫酶活性谷氨酸脫氫酶活性v-KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADPvL-谷氨酸脫氫酶的酶活性強， - 酮戊二酸易生成谷氨酸。（三）（三）GA 生物合成的理論得率生物合成的理論得率v1.存在乙醛酸循環(huán)，體系不存在CO2固定反應v3/2 C6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + 4 CO2 產(chǎn)率：147 /（180*3/2） = 54.4% 3/2GlucoseEMP丙酮酸丙酮酸 + 丙酮酸丙

13、酮酸 + 丙酮酸丙酮酸CO2乙酰輔酶乙酰輔酶A + 乙酰輔酶乙酰輔酶A + 乙酰輔酶乙酰輔酶A檸檬酸（檸檬酸（DCA循環(huán)）循環(huán)）谷氨酸谷氨酸不存在CO2固定反應草酰乙酸草酰乙酸v2. 封閉乙醛酸循環(huán)， 存在CO2固定反應vC6H12O6 + NH4+ C5H9NO4 + CO2 v產(chǎn)率：147 / 180 = 81.7%GlucoseEMP丙酮酸丙酮酸 + 丙酮酸丙酮酸CO2CO2草酰乙酸草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）（草酰乙酸羧化酶）乙酰輔酶乙酰輔酶A + C4二羧酸二羧酸蘋果酸蘋果酸（蘋果酸合成酶）（蘋果酸合成酶）檸檬酸（檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）循環(huán)封閉）谷氨酸谷氨酸存在CO2固定反應CO2固

14、定反應 v(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下 磷酸丙酮酸 + CO2 + GDP = 草酰乙酸 + GTPv(2)蘋果酸酶蘋果酸酶的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH = 蘋果酸 + NADv 需要Mn2+做輔因子，所以，在GA發(fā)酵過程中需要向培養(yǎng)基中補充Mn2+（四）、生物素對GA發(fā)酵的影響vGA 產(chǎn)生菌大都是生物素的營養(yǎng)缺陷型，即：VH-v生物素對發(fā)酵的影響是全面的，在發(fā)酵過程中生物素對發(fā)酵的影響是全面的，在發(fā)酵過程中要嚴格控制其濃度。要嚴格控制其濃度。 1. 生物素對糖代謝的影響 （1） VH對于糖酵解有促進作用;對丙酮酸的有氧氧化乙酰輔酶乙酰輔酶A A的生成

15、也有促進作用， 對兩者的促進作用不一樣，對前者大一些。這樣培養(yǎng)基中如果有較豐富的VH，就會打破糖酵解與丙酮酸氧化之間的平衡，導致丙酮酸的積累，丙酮酸積累則可能導致乳酸的形成，乳酸生成，則使得碳源利用率降低，而且?guī)淼氖前l(fā)酵液的pH值下降。v當VH缺乏時：vA：丙酮酸的有氧氧化就會減弱(由于VH對TCA循環(huán)的促進作用)，則：乙酰輔酶A的生成量就會少，產(chǎn)醋酸濃度降低，降低對異檸檬酸裂解酶的誘導作用；vB：VH對TCA循環(huán)促進作用的降低，使中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，產(chǎn)生積累，阻遏和抑制異檸檬酸裂解酶作用加強；v兩者綜合的作用：異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA循環(huán)得到封閉。v（2）對乙醛酸循的調控

16、?？梢酝ㄟ^控制VH的濃度，以實現(xiàn)對于乙醛酸循環(huán)的封閉。v當當V VH H豐富時，異檸檬酸裂解酶的活性加強豐富時，異檸檬酸裂解酶的活性加強，則DCA 循環(huán)正常進行，DCA循環(huán)的進行，一方面提供了大量的“中間性產(chǎn)物”，另一方面，菌體的能荷水平得到提高。前者是菌體增殖的物質基礎，后者則是菌體增殖的能量的保證。結果是利于菌體的增殖和生長；則GA的生物合成就會受到影響，甚至停止，這在生產(chǎn)上，就是通常我們說的“只長菌，不只長菌，不產(chǎn)酸產(chǎn)酸”的現(xiàn)象。 v以上分析說明，以上分析說明，GA發(fā)酵過程中，發(fā)酵過程中，前期，前期，菌體的增殖期，一菌體的增殖期，一定量的生物素是菌體增殖所必需的；而在定量的生物素是菌體增

17、殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期產(chǎn)物合成期，則，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。2.2.生物素影響細胞膜的通透性生物素影響細胞膜的通透性v用能積累谷氨酸菌株做如下實驗實驗: :v生物素充足時,細胞內(nèi)含大量谷氨酸,但培養(yǎng)液里幾乎不含谷氨酸v用溶菌酶消化細胞壁得到的原生質體仍不分泌谷氨酸v當把原生質體放入低滲溶液里,將其漲破,谷氨酸才排出v生物素亞適量時,培養(yǎng)液里含大量谷氨酸,細胞里含量少1. 1.結論結論: :谷氨酸的分泌是由細胞膜控制；生物素影谷氨酸的分泌是由細胞膜控制；生物素影響細胞膜的通透性進而影響谷氨酸積累響細胞膜的通透性進而影響谷氨酸積累

18、v生物素是脂肪酸生物合成最初反應的關鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶,參與了脂肪酸的合成,進而影響脂肪酸的合成.當磷脂合成量少到正常的1/2左右時,細胞變形,Glu向膜外泄漏.葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸 +丙酮酸丙酮酸乙酰輔酶乙酰輔酶A乙酰輔酶乙酰輔酶乙酰輔酶乙酰輔酶A羧化酶羧化酶CO2丙二酰輔酶丙二酰輔酶AC4丙二酰輔酶丙二酰輔酶ACO2C6CO2培養(yǎng)基中生物素限量時，胞內(nèi)AA 92% 胞外培養(yǎng)基中生物素豐富時，胞內(nèi)AA 12% 胞外 2. VH對菌體細胞膜通透性的影響v菌體進入產(chǎn)物合成期時，有GA的產(chǎn)生，如果能夠大量的把產(chǎn)物及時的排泄到細胞膜外，可以解除解除GAGA對對L-L-谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫

19、氫酶活性的抑制作用活性的抑制作用，從而使由GlucoseGA的高效率轉化。v谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是VH-，而VH又是菌體細胞膜合成的必須物質，因此，通過控制VH的濃度，可以實現(xiàn)對菌體細胞膜通透性的調節(jié)。v限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素亞適量(5-10g/L).在發(fā)酵初期(0-8小時),細胞可以正常生長,當生物素耗盡后,在菌的再次倍增時,開始出現(xiàn)異常形態(tài)細胞,即完成了細胞從生長型到積累型（細胞膜缺陷）轉換.v谷氨酸發(fā)酵過程中,合適的發(fā)酵條件如生長素、發(fā)酵溫度、pH值、通風和發(fā)酵產(chǎn)生的泡沫都是影響谷氨酸積累的主要因素。v在實際生產(chǎn)中,只有針對存在的問題,嚴格控制嚴格控制工藝條件工藝條件,才能達到穩(wěn)產(chǎn)、高

20、產(chǎn)的目的。 （五）（五）GA發(fā)酵的外在因素發(fā)酵的外在因素1.供氧濃度/通風v過量：vNADPH的再氧化能力會加強，使-KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA 的生成。v供氧不足： v則丙酮酸向乳酸方向轉化，積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生，同時，一部分葡萄糖轉成了乳酸，影響了糖酸轉化率，降低了產(chǎn)物的提出率。2. NH4+濃度v（1）影響到發(fā)酵液的pH值v（2）與產(chǎn)物的形成有關：vNH4+過量，菌體增殖階段會抑制菌體生長，產(chǎn)酸階段Glu會受谷氨酰胺合成酶作用轉化為GlnvNH4+不足，不利于-KGA的還原氨基化， -酮戊二酸積累，引起反饋調節(jié)NH4+的供給方式： （1）流加

21、液氨 （2）流加0.8%尿素3.磷酸鹽v過量：v（1）促進EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等 v（2）產(chǎn)生并積累Val， Glucose丙酮酸丙酮酸 + 丙酮酸丙酮酸（焦磷酸硫胺素，（焦磷酸硫胺素，TPP）活性乙醛活性乙醛-乙酰乳酸乙酰乳酸ValVal合成途徑合成途徑 Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止 （2）消耗丙酮酸，降低了糖酸轉化率 （3）發(fā)酵液中的Val存在，嚴重的影響GA 的結晶、提取。v4. 發(fā)酵液的碳氮比發(fā)酵液的碳氮比v碳源v在一定范圍內(nèi), 谷氨酸的產(chǎn)量隨糖含量的增加而增加；但糖含量過高, 滲透壓過大, 對菌體生長不利, 谷

22、氨酸對糖的轉化率低。發(fā)酵液中還原糖的含量一般應控制在10 %13 % ,v氮源v氮源是合成菌體細胞蛋白質、核酸和谷氨酸的氨基來源，大約85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌體。v谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般發(fā)酵工業(yè)多得多，一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100：0.22.0，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100：1521。v在谷氨酸發(fā)酵過程中, 菌體生長期碳氮比應大一些(氮低）,在產(chǎn)酸期,碳氮比應小些(氮高）。v6. 發(fā)酵溫度發(fā)酵溫度v谷氨酸發(fā)酵前期應采取菌體生長最適溫度,即3032 。溫度過低, 菌體生長繁殖慢;若溫度過高,菌體易衰老, 生產(chǎn)中表現(xiàn)為DO值增長慢, 耗糖慢, pH值高, 最終發(fā)酵周期長,產(chǎn)酸少。v發(fā)酵中、后期菌體生長基本停止, 為積累大量谷氨酸, 應適當提高發(fā)酵溫度（產(chǎn)谷氨酸的最適溫度35-37 )。但溫度過高,酶易失活,谷氨酸生成受阻。v7. pH值值v1） pH值對谷氨酸產(chǎn)生菌生長的影響v當高于或低于最適生長pH值范圍:(1) 菌體內(nèi)的酶受到抑制, 菌體新陳代謝受阻, 生長停滯; (