基因診斷課件

1、基因診斷課件基因診斷課件 幾乎所有的疾病均在一定程度上與基因有某種聯(lián)幾乎所有的疾病均在一定程度上與基因有某種聯(lián)系，基因的改變，或是疾病發(fā)生的原因，或是疾系，基因的改變，或是疾病發(fā)生的原因，或是疾病發(fā)生的結果，或是疾病發(fā)生時的伴隨現(xiàn)象，而病發(fā)生的結果，或是疾病發(fā)生時的伴隨現(xiàn)象，而這些現(xiàn)象的出現(xiàn)是有規(guī)律的。因此，可以通過檢這些現(xiàn)象的出現(xiàn)是有規(guī)律的。因此，可以通過檢測基因的改變來反映疾病的發(fā)生和發(fā)展，療效和測基因的改變來反映疾病的發(fā)生和發(fā)展，療效和預后預后 基因診斷：是以基因診斷：是以DNADNA或或RNARNA為診斷材料，通過檢查為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達異常，對人體狀態(tài)和疾基因的

2、存在、缺陷或表達異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。病作出診斷的方法和過程。 第一階段：世紀年代，以DNA分子雜交為基礎，通過限制性片段長度多態(tài)性性（RFLP)分析進行 第二階段：應用PCR技術 第三階段：應用基因芯片技術一一 . .基因診斷中常用的幾種技術基因診斷中常用的幾種技術（一）（一） 核酸雜交核酸雜交（二）（二） PCRPCR（三）三） DNADNA序列測定序列測定（四）（四） DNADNA芯片技術芯片技術(1)(1)方法方法: : 以已知順序核酸片段作為探針,經(jīng)放射性或非放射性物質標記后,再與未知的目的核酸片段進行雜交反應,分離已雜交和未雜交的標記核酸鏈,通過標記信號的檢測

3、就可以對未知的目的核酸鏈進行定性、定量分析.(2)2)幾種不同形式的核酸分子雜交幾種不同形式的核酸分子雜交 a. Southern印跡(southern blot)雜交: 用于DNA的檢測，可用于基因的限制性內切酶譜分析，基因突變分析等 b. Northern印跡(Northern blot)雜交: 用于RNA的檢測，能對組織細胞中的總RNA 或mRNA進行定性和定量分析 c. 斑點雜交（dot blot): 既可以檢測DNA也可以檢測RNA,用于特定基因及其表達的定性和定量分析方法簡單、靈敏；但特異性低原位雜交（in situ hybridization): 是細胞學技術與核酸雜交技術結合的

4、一種核酸分析檢測技術可分為DNA原位雜交和RNA原位雜交,用于檢測染色體中特定的基因位置，用于染色體疾病的診斷 分類: 玻片原位雜交:如中期的染色體和組 織切片. 膜上原位雜交:將菌落或噬菌斑影印在尼 龍膜(如硝酸纖維膜) （）等位基因特異性寡聚核苷酸（）等位基因特異性寡聚核苷酸（allele allele specific oligonnucleotide,ASO)specific oligonnucleotide,ASO)探針斑點雜交：探針斑點雜交：PCR-ASOPCR-ASO該方法是該方法是診斷已知點的突變：診斷已知點的突變：需分別合成野生型和突變型探需分別合成野生型和突變型探針在基因診

5、斷時，只需用針在基因診斷時，只需用PCRPCR擴增受檢者目的擴增受檢者目的DNADNA片段，再片段，再分別與上述探針雜交雜交的結果有如下幾種情況：分別與上述探針雜交雜交的結果有如下幾種情況： PCR擴增產(chǎn)物與正常探針雜交，不與突變探針雜交-不 存在這種突變； 只與突變探針雜交-突變基因為純合子； 與正常探針和突變探針都可雜交-突變基因為雜合子； 與正常探針和突變探針都不能雜交-突變基因不屬于已發(fā) 現(xiàn)的類型（）單鏈構象多態(tài)性（）單鏈構象多態(tài)性（single strand single strand conformation ploymorphism,SSCP) conformation ploy

6、morphism,SSCP)分析分析 基因突變導致的基因堿基組成或(和)順序發(fā)生改變,會在基因結構中產(chǎn)生新的限制性內切酶位點或使原有的位點消失. 用限制酶對不同個體基因組進行消化時，其電泳條帶的數(shù)目和大小就會產(chǎn)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷出突變是否存在. 限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms)樣品一樣品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP為遺傳標記繪制了第一張人類遺傳圖譜 雙鏈DNA在一定濃度變性劑(尿素,甲酰胺)作用下,會變性而解鏈,導致DNA分子電泳遷移率變化.當在不

7、同梯度濃度變性膠中電泳時, DNA泳動到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性，DNA開始解鏈，從而不同的DNA片段會形成不同的遷移率條帶優(yōu)點：可靠，檢出單堿基突變率可達缺點：富含高熔點GC區(qū)時，則難以檢測出突變 在PCR擴增前，先用化學試劑（NaHSO3)處理模板DNA,將所有未甲基化的胞嘧啶（C)轉變成尿嘧啶(U)，在PCR擴增時，U與引物中A配對；而CpG島上甲基化的C不受影響，在擴增時仍與G配對,基于這種差異可以進行甲基化特異性PCR設計一對甲基化特異性引物（引物中甲基化特異性引物（引物中G G結合模板中結合模板中C);C);和非甲基化特異性引物（引物中和非甲基化特異性引物（引物中A A結合模板

8、中結合模板中U),U),通過通過PCRPCR擴增就可檢測出甲基化等位基因化學修飾擴增就可檢測出甲基化等位基因化學修飾的的DNADNA序列和非甲基化等位基因序列序列和非甲基化等位基因序列用于一些疾病和腫瘤的基因診斷用于一些疾病和腫瘤的基因診斷 定量PCR(quantiative PCR, Q-PCR): 就是對靶核酸分子進行定量分析的技術.根據(jù)PCR擴增指數(shù)增長期原理，理論上擴增產(chǎn)物累積分子數(shù)N=No(1+E),其中E是指每次循環(huán)中參與復制的模板數(shù)與總模板數(shù)的比率.通過N值可求出No. 但PCR擴增時平臺期(15-25)的出現(xiàn)會影響測量的準確度.定量PCR的策略和方法較多.n a. 通過測定PC

9、R產(chǎn)物量 方法: 對已知量的靶DNA進行系列稀釋,比較待測樣品和已知系列稀釋樣品的PCR產(chǎn)量,還可對未知量的靶DNA進行絕對定量. b. 采用極限稀釋法對靶核酸進行定量分析: 方法:將待測DNA標本進行倍數(shù)稀釋,直至擴增不到靶基因的稀釋度,用稀釋程度表示啟始靶基因分子數(shù)的相對量,是一種半定量方法. c.采用非競爭性對照法對靶核酸進行定量分析 方法:該方法是在一個試管內同步擴增來自同一DNA的一段靶序列和另一段內標序列,用內標序列控制DNA的用量、可擴增性和管間擴增效率的變化,通過比較兩段序列PCR擴增產(chǎn)物電泳帶的熒光強度,對靶序列進行定量分析 d. 采用競爭抑制法對靶核酸進行定量分析: 方法:

10、參照標準不是同一核酸分子上的另一段序列,通常是人工模板,與待測序列具有相同的引物結合位點,能與待測序列競爭聚合酶,底物,引物分子. 方法:將競爭模板作系列稀釋后加入恒量的樣品DNA進行PCR擴增,通過分離和分析競爭模板和樣品DNA的PCR產(chǎn)量,對樣品DNA進行定量分析 e.熒光定量PCR(FQ-PCR)技術是一種目前國內外應用較為廣泛的定量PCR技術,是通過始點定量和熒光檢測系統(tǒng)實時監(jiān)測累計熒光強度而實現(xiàn),具有靈敏度高,特異性強等優(yōu)點. FQ-PCR技術的兩種定量形式: 絕對定量:一般采用外標準品定量的制備來實現(xiàn)絕對定量. 如合成目的基因;將PCR產(chǎn)物直接梯度稀釋;或將PCR產(chǎn)物克隆到載體上,

11、抽取質粒,經(jīng)過測量濃度和拷貝數(shù)可準確定量.優(yōu)點:穩(wěn)定,準確. .相對定量:指在測定目的基因的同時測定一內源性管家基因(如-actin, rRNA等),該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較,反映反應體系內是否存在PCR擴增的影響因素. 1977年Sanger創(chuàng)建的鏈終止反應序列測序法 用放射性同位素標記引物，用雙脫氧核苷酸隨機終止DNA鏈的延伸，產(chǎn)生長度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些片段，放射自顯影讀出結果。 自動測序法 采用四色熒光標記代替了放射性同位素標記。 DNA 測序測定是基因突變檢測的最直接，最準確的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質 DNADNA芯

12、片（芯片（DNA chip)DNA chip)又稱為基因芯片，又稱為基因芯片，DNADNA微陣列微陣列（DNA microarray)DNA microarray) 該技術的基礎仍然是利用核酸分子雜交原理：首先將一系列預先設計好的核酸探針（oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龍膜等固體支持物上，制成DNA微陣列。用熒光標記待測樣品（DNA,cDNA,RNA)與位于芯片上的核酸探針雜交后，通過激光共聚焦熒光掃描系統(tǒng)檢測雜交信號強度，再用特定的軟件對熒光信號進行綜合分析，就能獲得待測樣品的大量基因序列信息或表達信息。 基因芯片按照用途分為：表達芯片，診斷芯片，指紋圖譜

13、芯片，測序芯片，毒理芯片等。 該技術可用于新基因鑒定，突變檢測，表達監(jiān)控和遺傳制圖等。一.通過致病基因的檢測診斷疾病 已經(jīng)基本清楚基因突變與疾病發(fā)生之間的分子機制，相關的基因已被克隆，測序，并被定位在染色體上。 如：一些與疾病有關的內源基因-癌基因，抑癌基因和血紅蛋白基因突變型。 診斷方法：根據(jù)突變的基因序列設計探針. 許多基因病，雖然它們的基因結構還沒有闡明，但通過染色體分析已被定位在染色體的特定位置上，這些基因是通過檢測與特定染色體位點連鎖的遺傳標記來發(fā)現(xiàn)的。 原理：同一染色體上位置十分靠近的相鄰基因或其它遺傳標記，在遺傳過程中分離的幾率很低，常常一起遺傳，形成連鎖。可以通過一個或幾個基因

14、或遺傳標記的分析，了解另一個或幾個基因。40-60年代: 功能克隆,即基于明顯可見的或直接與生化功能相關的線索確定與疾病相關的基因: 如苯丙酮尿癥與鐮刀型的貧血病等.70-80年代:定位克隆,即基于疾病-染色體-基因的反向遺傳學策略對沒有明顯的表型或生化功能異常的疾病.90- 今 :表型克隆,不考慮基因在染色體上的位置信息,而是直接在疾病與正常樣本之間尋找分子水平上的差異. 表型克?。簩膊∠嚓P的一組基因進行克隆 一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血壓，冠心病，腫瘤，精神病，自體免疫性疾病等，由于疾病發(fā)生的原因復雜，不僅涉及多基因互作，還涉及基因與環(huán)境互作。不可能通過前面的方法來診斷

15、，必須利用差異顯示等技術找出正常人和疾病患者之間的差異序列，鑒定與疾病相關的多個基因，確定導致疾病的分子缺陷。 方法：根據(jù)克隆到的一組基因制作相應的一組探針，用這組探針檢測一組與疾病相關的基因來診斷多基因病 限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs )1985 短串聯(lián)重復序列短串聯(lián)重復序列 (short tendem repeats, STRs ,mini- satellites )1990s 單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性 (single-nucleotide polymor-phisms SNPs)短串聯(lián)重復序列短串聯(lián)重復序列STRs (short tendem repeats,

16、 Microsatellites )STR廣泛存在于人基因組，占約廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是基本單位是1bp-8bp的的串聯(lián)重復，串聯(lián)重復，重復次數(shù)重復次數(shù) n=15-60，已知，已知8000多個，多個，主要形式為：主要形式為： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ， (CAA)n， (CGG)n ，其中以其中以 (CA)n ， (GT)n 為多見。為多見。1992年，年，Welssenbanch等以等以STR為標記的為標記的第二代連鎖圖取代了第二代連鎖圖取代了RFLP連鎖圖連鎖圖。 定義定義: :主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的主要是指在基因組水平上

17、由單個核苷酸的變異所引起的變異所引起的DNADNA序列多態(tài)性。序列多態(tài)性。與與RFLPRFLP與與STRSTR不同不同, ,它是直接以序列的變異作為標記它是直接以序列的變異作為標記, ,而不是以片段的而不是以片段的長度差異作為標記長度差異作為標記. . 人類基因組圖譜的初步分析表明，共有人類基因組圖譜的初步分析表明，共有3 3萬萬至至3.53.5萬個基因。有萬個基因。有300300多萬個單核苷酸多態(tài)多萬個單核苷酸多態(tài)性性,SNP,SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每在人類基因組中廣泛存在，平均每50050010001000個堿基對中就有個堿基對中就有1 1個，個，3-43-4個相鄰的標記構成個

18、相鄰的標記構成的單倍型（的單倍型（haplotypehaplotype）就可有）就可有8-168-16種。種。 19961996年，年，LanderLander報道了用單核苷酸多態(tài)性報道了用單核苷酸多態(tài)性 標記制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標記。標記制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標記。單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotid polymorphismsingle nucleotid polymorphism，SNPSNP） SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標記廣泛得多。與串聯(lián)重復的微衛(wèi)星位點(STR)相比，SNP是

19、高度穩(wěn)定的.尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。部分位于基因內部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質的結構或基因表達水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點。易于進行自動化分析，縮短了研究時間 . 分為異常血紅蛋白病和地中海貧血分為異常血紅蛋白病和地中海貧血, ,前者是由于珠蛋前者是由于珠蛋白的基因突變；后者是由于珠蛋白合成速率降低，白的基因突變；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a a鏈和鏈和b b鏈合成不平衡。鏈合成不平衡。（一）異常血紅蛋白病的基因診斷：（一）異常血紅蛋白病的基因診斷： 如鐮狀紅細胞貧血病如鐮狀紅細胞貧血病:鏈第六

20、位氨基鏈第六位氨基酸酸:GAA(:GAA(谷谷)GUA()GUA(頡頡) )代替代替. . 對該病的基因診斷應采用對該病的基因診斷應采用: : 1)PCR+1)PCR+限制酶切限制酶切, ,即用即用PCRPCR從患者基因組擴增含突變從患者基因組擴增含突變位點的珠蛋白基因片段位點的珠蛋白基因片段, ,再選適當?shù)膬惹忻赶龠x適當?shù)膬惹忻赶疨CRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物, ,根據(jù)電泳圖譜上片段數(shù)量和大小做出判斷根據(jù)電泳圖譜上片段數(shù)量和大小做出判斷 2)Southern 2)Southern 印跡雜交分析印跡雜交分析（二）（二） 地貧的基因診斷：地貧的基因診斷： 1 1. . 定性分析：定性分析：PCRPC

21、R法直接擴增法直接擴增11和和22 基因的基因的3 3端有差別，針對此可設計端有差別，針對此可設計 引物進行引物進行PCRPCR，如有缺失，則不能擴如有缺失，則不能擴 增出產(chǎn)物增出產(chǎn)物 2 2. . 定量分析定量分析:地貧的共同特點是地貧的共同特點是 珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA的量減少，因此可用的量減少，因此可用 RT-PCR RT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助診斷的量以助診斷 （三）（三） -地貧的基因診斷地貧的基因診斷 1 1. DN. DN檢測與分析檢測與分析 ： PCR+ASO PCR+ASO 探針法探針法 為主要方法為主要方法 根據(jù)根據(jù) -珠蛋珠蛋 白主要突變位點

22、，設計白主要突變位點，設計2 2對引物，擴增可能發(fā)生對引物，擴增可能發(fā)生 突變的突變的2 2個片段個片段, ,再分別與相應野生型探針和突再分別與相應野生型探針和突 變探針進行斑點雜交。變探針進行斑點雜交。 PCR+RFLP PCR+RFLP連鎖分析法連鎖分析法 檢測與檢測與-珠蛋白基因連珠蛋白基因連 鎖的遺傳標記進行基因診斷鎖的遺傳標記進行基因診斷, ,如如-珠蛋白珠蛋白5 5端端 有一限制內切酶有一限制內切酶HgiAIHgiAI的多態(tài)性位點的多態(tài)性位點, ,在中國人在中國人 群的頻率為群的頻率為0.5 0.5 DNA DNA芯片技術芯片技術 2 2.RNA.RNA檢測與分析：檢測與分析：RT

23、-PCRRT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助診的量以助診 斷斷 DMDDMD：是性連鎖隱性遺傳病是性連鎖隱性遺傳病, ,是由是由抗肌萎縮蛋白抗肌萎縮蛋白(dystrophin)(dystrophin)基因突變基因突變( (突變或缺失突變或缺失).). 其突出其突出特點為橫紋肌進行性萎縮，引起無力和攣縮。特點為橫紋肌進行性萎縮，引起無力和攣縮。DMDDMD相對更為常見。相對更為常見。DMDDMD患兒在患兒在5 5歲前發(fā)病，歲前發(fā)病，2020歲左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，發(fā)病歲左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，發(fā)病率在男性活嬰中約率在男性活嬰中約1/3500 1/3500 。

24、 RFLP連鎖分析:通過家系連鎖分析,找出與突變基因相連鎖的DNA多態(tài)性,并將其作為遺傳標記追蹤多態(tài)性在家族成員中的傳遞. 基因組DNA探針法: 用突變高發(fā)區(qū)的常見序列作為探針,檢測抗肌萎縮蛋白基因的相應變異. cDNA探針法:用較短的抗肌萎縮蛋白基因cDNA作為探針.比2方便、檢出率高. 多重PCR法:對基因突變較集中的區(qū)域,設計多對引物,擴增基因相應的突變高發(fā)區(qū),檢測相應的基因突變. 腫瘤的發(fā)生涉及多個基因、多種因素、發(fā)生、多種因素、發(fā)生過程呈多階段性、發(fā)生的分子機制十分復雜過程呈多階段性、發(fā)生的分子機制十分復雜, ,因此對不同的腫瘤要采用不同的基因診斷策因此對不同的腫瘤要采用不同的基因診

25、斷策略略. .一一. .通過檢測腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤通過檢測腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤淋巴造血系統(tǒng)腫瘤淋巴造血系統(tǒng)腫瘤: : 染色體易位及基因融合染色體易位及基因融合是較普遍的現(xiàn)象是較普遍的現(xiàn)象. . 如如: :淋巴瘤和淋巴結反應性淋巴瘤和淋巴結反應性增生增生. .它是由于它是由于T T細胞受體細胞受體(TCR)(TCR)基因和基因和IgHIgH基基因重排因重排, ,使原來相隔數(shù)百個堿基的使原來相隔數(shù)百個堿基的IgHIgH和和TCRTCR基因的基因的V V區(qū)和區(qū)和J J區(qū)靠近在一起區(qū)靠近在一起. .用用PCRPCR擴增該區(qū)擴增該區(qū)域片段域片段, ,通過長度分析就能判斷是否發(fā)生

26、了通過長度分析就能判斷是否發(fā)生了基因重排基因重排. . 癌基因的激活及抑癌基因的失活與腫瘤的發(fā)生密切相關.大多人類腫瘤組織或細胞中都能檢測到癌基因和(或)抑癌基因的突變1.癌基因-ras與腫瘤: ras是腫瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子機制主要是點突變,高發(fā)區(qū)是第12 、13和61位密碼子.如90%的胰腺癌,50%的結直腸癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密碼子突變. ras癌基因點突變檢測方法: a.PCR-ASO法:檢測速度快，靈敏度高，檢測樣品量大等優(yōu)點； 但點突變的檢出僅限于寡核苷酸探針的探測位點和突變類 型。 b.PCR-SSCP法：根據(jù)PCR擴增的目標DNA片段在非

27、變性凝膠電泳中遷移率，將突變基因檢測出來。該法檢測點突變更方便； 缺點：不能檢測出突變的具體位點和具體類型。 2 .P53基因與腫瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基 因，失活的分子機制主要是基因突變，也有因為基 因表達異常而使p53失活，約50%以上的惡性腫瘤有 p53基因突變。 突變類型：130290密碼子間常發(fā)生點突變，也有少量的插入或缺失突變。 基因檢測方法： PCR-SSCP:可檢出有無突變 PCR-RFLP:通過內切酶位點的消 失或增加檢測p53的基因突變。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒與腫瘤的發(fā)生有關，它們有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆轉錄病毒(retro-virus)對動物細胞的致瘤作

28、用已得到公認.還發(fā)現(xiàn)一些與人腫瘤發(fā)生有關的病毒如: Burkitt 淋巴瘤人類乳頭瘤病毒(HPV)宮頸癌通過檢測這些病毒的基因就可以幫助診斷相應的腫瘤.EB病毒腫瘤標志物（tumor marker)是由腫瘤組織細胞產(chǎn)生的，與腫瘤形成和發(fā)展相關的物質，包括：腫瘤抗原，激素，酶和同工酶。僅存在腫瘤細胞中。 類型：基因標志：是指基因本身突變和異常表達，能反映癌前啟動階段的變化?；虮硇蜆酥荆夯虍a(chǎn)物表達和調控異常，表現(xiàn)為所編碼的表達產(chǎn)物合成紊亂，產(chǎn)生胚胎性抗原，一般出現(xiàn)較晚。 基因診斷方法： 基因變異導致腫瘤標記物的產(chǎn)生或含量改變，可選擇：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-測序，PCR-SS

29、CP等技術。 導致腫瘤標記物產(chǎn)生或含量改變分子機制不清楚，可用RT-PCR技術檢測腫瘤標記物mRNA的存在或含量的改變。如：端?；钚悦富钚员挥脕碜鳛槟[瘤標記物，在腫瘤細胞中該酶的活性增高。 每種病原體都有各自特異的遺傳物質每種病原體都有各自特異的遺傳物質, ,可以是可以是DNA,DNA,也可以是也可以是RNA.RNA.每種病原生物都有各自種屬特異的每種病原生物都有各自種屬特異的基因基因. . 一一. .病毒感染性疾病的診斷病毒感染性疾病的診斷 a.a.乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒: : 目前采用免疫法檢測血清中病毒目前采用免疫法檢測血清中病毒抗原抗原. . HBV HBV基因組包含基因組包含4 4個開放閱讀框個開放閱讀框,S,S、C C 、P P和和X X區(qū)區(qū),C,C區(qū)變異性小區(qū)