有機小分子熒光探針的研究

1、有機小分子熒光探針的研究什么是熒光探針？ 熒光探針是建立在光譜化學和光學波導與測量技術基礎上，選擇性的將分析對象的化學信息連續(xù)轉變?yōu)榉治鰞x器易測量的熒光信號的分子測量裝置。 熒光探針受到周圍環(huán)境的影響，使其發(fā)生熒光發(fā)射發(fā)生變化，從而使人們獲知周圍環(huán)境的特征或者環(huán)境中存在的某種特定信息熒光分子探針的優(yōu)點靈敏度高選擇性好使用方便成本低不需預處理不受外界電磁場影響遠距離發(fā)光熒光分子探針的結構 熒光分子探針通常由三部分組成：識別基團（receptor）報告基團（fluorophore）連接體部分（spacer） FSRhvstrongly fluorescentFluorephoreSpacerRec

2、eptorAnalyte識別基團決定了探針分子的選擇性和特異性，報告基團則決定了識別的靈敏度，而連接體部分則可起到分子識別樞紐的作用。熒光分子探針的設計原理 熒光分子探針的設計原理主要有以下幾種：鍵合-信號輸出法、置換法和化學計量計法。1、鍵合-信號輸出法 熒光 連接體 識別 被分析物 信號輸出 基團 基團鍵合-信號輸出法是指將探針中的識別基團和熒光基團通過共價鍵連接起來設計熒光探針的方法。 當識別基團與被分析物結合時會引起熒光基團的化學環(huán)境發(fā)生變化，通過顏色的改變、光譜的移動、熒光強度的增減等現(xiàn)象來表現(xiàn)，這些變化可被裸眼或者儀器識別。這是目前為止在設計熒光探針中應用最廣泛的方法 。 作為熒光

3、基團的香豆素和作為識別基團的鄰氨基苯硫醚以席夫堿相連，加入鋅離子后，與硫醚上的硫原子、席夫堿上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到結構2 2，抑制了席夫堿上C=N鍵的旋轉，實現(xiàn)了熒光從無到有的變化 12基于鍵合-信號輸出法設計的鋅離子熒光探針 2、置換法識別基團 被分析物 識別基團 熒光基團 結合熒光基團 結合被分析物 基于置換法設計的熒光探針 該原理是利用識別基團分別與熒光基團和被分析物結合能力的不同來實現(xiàn)對被分析物的檢測。 識別基團和熒光基團形成絡合物，當被分析物加入到該體系中時，由于識別基團與被分析物的結合能力要強于識別基團與熒光基團的結合能力，因此被測物將熒光基團置換出來，從而引起了整個

4、體系熒光等化學參數(shù)的變化，進而為儀器或者裸眼識別，該原理常用于設計陰離子熒光探針。 CN-Cu(CN)234Cu2+ 化合物3以氟硼熒為熒光團修飾了DPA為識別基團，探針本身熒光很強，但與銅離子絡合后可形成結構3，從而淬滅了氟硼熒的熒光，加入氰根離子后，由于銅離子與氰根離子的結合常數(shù)更大，從而把作為熒光基團的氟硼熒衍生物從絡合狀態(tài)中置換出來得到結構4，使之進入溶液，熒光恢復，而其它的陰離子沒有這樣的現(xiàn)象，因此可以實現(xiàn)對氰根離子的檢測。 3、化學計量計法 探針分子 被分析物 新物質A 探針分子 被分析物 中間體 新物質B 新物質C 基于化學計量計設計的熒光探針（I）被分析物和探針分子反應形成了共

5、價化合物； （II）被分析物催化探針分子反應生成兩種新物質 化學計量計法是利用探針分子和被分析物之間發(fā)生的特定化學反應（一般是不可逆反應）來改變探針所處的化學環(huán)境，從而對被分析物進行識別的一種方法。根據化學計量計法設計的探針可以稱為化學計量計，主要包括兩種類型： 一、探針分子和被分析物發(fā)生化學反應后形成共價化合物（I）； 二、被分析物催化探針分子反應生成兩種新物質（II）。 一般而言，基于化學計量計原理設計的熒光分子探針通常具有不可逆性和較好的選擇性。 基于化學計量計法設計的次氯酸根離子熒光探針 根據次氯酸根可以氧化羥胺的特性，設計合成了化合物5 5，當次氯酸根存在時可氧化羥胺結構，使羅丹明開

6、環(huán)，從而形成結構6 6，最終進一步水解為羅丹明6G本身7 7，而產生強烈的熒光。而其它氧化性分子沒有這樣的特性，因此可以實現(xiàn)對水相中次氯酸根的高選擇性檢測。 熒光探針的響應機理熒光分子探針主要有如下幾種響應機理：1、光誘導電子轉移（PET, photo-induced electron transfer）2、分子內電荷轉移（ICT, intramolecular charge transfer）3、熒光共振能量轉移（FRET, fluorescence resonance energy transfer）4、激基締合物（excimer/exciplex）1 光誘導電子轉移（PET, photo

7、-induced electron transfer） 光誘導電子轉移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉移的過程。 識別基團與被分析物結合之前，熒光基團受激發(fā)，最終被光激發(fā)到激發(fā)態(tài)的電子不能躍遷到基態(tài)，使得熒光基團的熒光淬滅。而識別基團與被分析物結合后，PET過程受阻，熒光基團的熒光得以恢復。 PET過程可以用前線軌道理論具體解釋：當識別基團不存在時，熒光團被光激發(fā)后，其最高占據軌道（HOMO）的一個電子躍遷到最低空軌道（LUMO）,能夠產生熒光； 若外來識別基團的HOMO或LOMO軌道介于熒光團兩軌道能量之間，此時就可以發(fā)生識別基團與熒光團之間的電子轉

8、移而導致熒光的猝滅。即PET過程阻止了熒光團的一個電子從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的非輻射躍遷途徑，降低了熒光團的量子產率，表現(xiàn)為熒光強度的減弱或淬滅。 PET識別分析物理論示意圖 PET1 識別基團對熒光團的PET過程發(fā)生和受阻的前線軌道理論解釋 第一種是識別基團對熒光基團的電子轉移（PET1），如圖1.9所示，即識別基團的HOMO軌道介于熒光基團的HUMO和LUMO軌道之間，當被分析物不存在時，熒光基團被激發(fā)后，識別基團的HOMO軌道的電子轉移到熒光基團的HOMO軌道，致使熒光基團被激發(fā)到LUMO軌道上的電子無法回到基態(tài)而難以產生熒光，導致熒光淬滅，即PET1過程發(fā)生。 當識別基團與被分析物結合后，識別

9、基團HOMO軌道能量降低，使PET過程受阻，這樣熒光基團的激發(fā)態(tài)電子可以返回基態(tài)，熒光恢復 。 總的來說，識別基團對熒光基團的電子轉移，即識別基團的HUMO軌道上的電子占據了熒光基團的HOMO軌道；熒光基團對識別基團的電子轉移(PET2),即識別基團LUMO消耗掉了熒光基團被激發(fā)的電子，兩者最終導致熒光基團被激發(fā)的電子不能回到基態(tài)，使熒光被淬滅。2 、分子內電荷轉移 （ICT，intramolecular charge transfer） 分子內電荷轉移是指分子在激發(fā)態(tài)時發(fā)生分子內電子轉移，造成正負電荷分離，形成分子電荷轉移態(tài)。分子內電荷轉移熒光探針分子通常是熒光團上同時連有推電子基團（電子給

10、體，Donor）和吸電子基團（電子受體，Acceptor）,通過鍵提供電子轉移的通道，形成強的推-拉作用的共軛體系，其吸電子基團或推電子基團本身充當識別基團的一部分。當識別基團和被分析物結合后，作為識別基團的供電子部分或拉電子部分的推拉電能力發(fā)生的改變，整個體系的的電子結構重新分布，從而導致吸收光譜，發(fā)射光譜發(fā)生變化，主要是光譜紅移或藍移 。識別基團分別為電子供體和電子受體的ICT過程光譜移動示意圖（其中D、A分別表示電子給體和電子受體） 化合物8 8是另一類香豆素熒光探針，在香豆素的3號位以烯鍵連接了一個苯并拉電子基，7號位修飾了一個二乙胺基供電子基，構成了推拉電子體系的熒光分子探針。當羥基

11、自由基存在時，能夠將化合物8 8氧化為化合物9 9，這樣化合物9 9共軛度大大擴大，氮原子帶正電荷增強了其拉電子能力，使整個體系p電荷離域程度增大，從而導致吸收光譜和熒光光譜分別紅移了60 nm和156 nm，發(fā)射波長已位于近紅外，基本不受樣品熒光背景的干擾，熒光顏色由綠色變?yōu)榧t色，該探針可對細胞中的羥基自由基進行比率檢測，比率信號可達210倍。 8 93 熒光共振能量轉移（FRET, fluorescence resonace energy transfer） 熒光共振能量轉移指一個熒光體系含有兩個熒光團，一個充當能量供體D，另一個為能量受體A，當用供體D的激發(fā)去激發(fā)熒光體系時，可以發(fā)生從D

12、到A的非輻射能量轉移，從而發(fā)射出受體熒光團的熒光。熒光共振能量轉移發(fā)生必須具備以下幾個條件：（1）能量供體熒光團D的熒光發(fā)射位于短波長處，且發(fā)射光譜和能量受體熒光團A的吸收光譜有一定重疊，能量受體能夠在能量供體的發(fā)射波長處吸收能量；（2）能量供體與能量受體相隔的距離必須遠大于它們之間的碰撞直徑（有時甚至為70-100）；（3）能量供體與能量受體還必須以適當?shù)姆绞脚帕小?化合物1010是以氟硼熒和羅丹明為熒光團設計的FRET熒光探針，由于氟硼熒的熒光發(fā)射光譜與羅丹明的吸收光譜有較大范圍重疊，通過連接臂連接，氟硼熒作為能量供體，羅丹明作為能量受體，加入被分析物后，熒光共振能量轉移過程便能實現(xiàn)。加入

13、汞離子之前，表現(xiàn)為氟硼熒的綠色熒光，汞離子的存在能促使氨基硫脲形成噁二唑酮類化合物而致使羅丹明內酰胺結構開環(huán)，此時氟硼熒的能量傳遞給羅丹明，最終使得共振能量轉移發(fā)生，氟硼熒的發(fā)射峰減弱，從而發(fā)射出羅丹明的紅色熒光，從而實現(xiàn)了對汞離子的比率型檢測。 10 114 激基締合物/復合物（ excimer / exciplex ） 激基締合物指一些熒光團在激發(fā)態(tài)與另一相同或不同的基態(tài)熒光團接近時往往能生產激基締合物（通過-堆積作用形成激基締合物）可觀察到雙重熒光。它的發(fā)射光譜不同于單體的熒光，新的熒光會產生一定的紅移，且出現(xiàn)強而寬的，無精細結構發(fā)射峰。這種作用本質上是光致電荷轉移作用，在兩個相同的熒光

14、分子之間形成激基締合物以及在兩個完全不同的熒光分子之間形成激基復合物，可以用下式表示：A* + A A*-A ( excimer )A* + B A*-B ( exciplex ) 激基締合物對距離的要求更為苛刻，只有激發(fā)態(tài)分子和基態(tài)分子達到碰撞距離3 時才可能形成激基締合物，因此可以利用各種分子間作用力改變兩個熒光團之間的距離，通過結合客體前后單體和激基締合物的熒光光譜的變化來表達客體被識別的信息。由于萘、芘、葸等熒光團具有較長的激發(fā)單線態(tài)壽命，易形成激基締合物等特點，因此常常被用于此類探針中。 化合物12基于激基締合物的熒光探針，加入汞離子之前兩個芘分子相距很遠，因此發(fā)射的是芘單體熒光，當

15、汞離子存在時，O、N原子與其配位形成化合物13，從而拉近了兩個芘分子之間的距離，且讓其平行排列，最后產生二聚體熒光。 12 135、 有機載體在熒光分子探針中的應用 羅丹明羅丹明及其衍生物是一種氧雜蒽類熒光染料 ，由于苯環(huán)間氧橋的存在，從而分子具有剛性共平面結構，使其分子結構穩(wěn)定性增強，開環(huán)狀態(tài)下，在激發(fā)光的作用下能產生強烈的吸收和熒光，其最大發(fā)射波長位于500-700 nm之間，為紅色可見光區(qū)，可有效的避開生物體系背景熒光，從而能提高探針的靈敏度，因此是生物分析中經常用到的熒光探針，具有很高的研究和應用價值。 羅丹明內酰胺螺環(huán)結構具以下特點：1）羅丹明的內酰胺螺環(huán)是非共軛結構的，因此在長波長

16、處無吸收，無色，無熒光；2）內酰胺螺環(huán)結構在酸性條件或者與被分析物結合后能夠誘導羅丹明內酰胺結構開環(huán)，氧雜蒽結構電子重新排布，共軛結構恢復，因此在長波長有吸收，有顏色，強熒光。由于此結構的優(yōu)勢，羅丹明內酰胺類衍生物是一類很好的OFF-ON型熒光傳感器熒光團。因此可以用羅丹明作為母體來進行設計，首先使它形成具有酰胺螺環(huán)結構的化合物，當它與被分析物作用時，內酰胺螺環(huán)結構被打開，信號從無到有，達到對被分析物的識別的目的。 14 15芘芘分子由四個苯環(huán)構成，是一種四環(huán)多環(huán)芳香類物質，有很強的熒光，在丙酮中量子產率可達0.99，其晶體加電壓可發(fā)光，最初用于電致發(fā)光研究。芘熒光基團是最有用的熒光化學敏感器

17、之一，芘基團附近連接一氨基已被廣泛采用的在選擇具體的金屬離子，通過控制信號光誘導電子轉移（PET）過程來選擇性識別金屬離子。 檢測銀離子:化合物1616和1717，加入了Ag+后，該探針熒光由單體熒光變?yōu)榧せ喓衔锏臒晒猓瑢g+有高靈敏度和高選擇性。其中，化合物1717對Ag+只有微弱的響應，這是由于化合物1616帶有羥基與Ag+配位起了決定性的作用。在自由態(tài)時，化合物1818表現(xiàn)出很強的激基締合物熒光，Ag+存在時與氮配位，使兩個芘分子距離變遠，激基締合物熒光減弱，單體熒光增強，因此可以對銀離子進行比率型檢測。 16 -17 1816R=OH17R=H有機熒光探針最新研究進展隨著熒光探針的

18、合成及應用技術的不斷改進,人們對有機熒光化合物的認識和研究也不斷深入,有機熒光探針的發(fā)展前景將越來越廣闊。1 BODIPY1 BODIPY類類二氟化硼2二吡咯甲烷(BODIPY) 是一類重要的有機熒光染料，由于其分子結構易于改性，近十年來研究人員合成了一系列的BODIPY衍生物，并在熒光探針技術上得到應用。這類熒光染料具有熒光量子產率高、摩爾吸光系數(shù)大、穩(wěn)定性好、對pH、溶液極性不敏感等優(yōu)點，因而在金屬離子檢測、PH值測定、DNA的標記及測序等方面得到重要應用。1.11.1基于BODIPYBODIPY的金屬離子熒光分子探針研究進展對金屬離子探針的研究早在20世紀七八十年代就已開始，2008年，

19、Serdar Atilgan 等人通過逐步法合成了一種高靈敏的鋅離子熒光探針。Wenwu Qin, Mukulesh Baruah等人合成了含氮雜冠醚取代基的BODIPY衍生物，這種基于BODIPY的染料分子表現(xiàn)強烈的依賴溶劑的熒光發(fā)射特征Xiaojun Peng研究組合成了一個能專識別Cd2+離子的熒光探針，該探針具有較好的細胞穿透性，并且首次被應用于活體細胞內Cd2+的檢測，其機理為分內電荷轉移機理(IcT)。探針的最大發(fā)射波長為656nm與Cd2+絡合后藍移至597nln，而Zn2+及其它金屬離子沒有干擾，結構如圖所示Yufang Xu 和Xuhong Qian則根據PET機理設計合成另

20、一種高選擇性的鎘離子熒光探針。探針分子本身在溶液中幾乎無熒光，而且不易受PH的影響。Zn2+, Pb2+, Cr3+, Fe3+,Cu2+, Hg2+, Ag+, Ba2+, Mg2+, Co2+, Cs+, Na+, K+, Ca2+ 和 Ni2+的存在幾乎不影響熒光發(fā)射廣譜，對Cd2+展示出高度的選擇性。 MingjianYuan等設計了一個基于PET和ICT雙重機理的Hg2+熒光探針，該探針包含有兩個受體，分別以PET機理和ICT機理與Hg2+結合。加入Hg2+前熒光較弱，最大發(fā)射波長在668nm，而絡合Hg2+后熒光增強超過7倍，最大發(fā)射波長藍移到578nm，對Hg2+顯示出良好的選擇

21、性和高度的敏感性。結構如圖所示Xuhong Qian等以BODIPY為熒光團，以聚酰胺為受體，合成一系列基于PET機理的Hg2+熒光探針，每個探針分子能夠絡合兩個Hg2+，熒光增強顯著，該系列探針擁有專一的選擇性、高靈敏性以及良好的水溶性，也許是因為水溶性太好所以不能夠透過細胞膜，未能做到在細胞內熒光成像。結構如圖所示1.21.2基于BODIPYBODIPY的pHpH熒光分子探針的研究進展pH在許多體系扮演重要角色，因而測定pH具有重大的意義。目前測定pH的方法很多，熒pH熒光探針是其中一種重要手段。相較其他分析方法，pH熒光探針具有不破壞待測體系、高靈敏度的特性，故在細胞生物學、藥物學、生物化學上應用廣泛。近年來，人們合成了多種pH熒光探針。1.3 1.3 基于BODIPYBODIPY的染料的其它熒光探針目前以BODIPY染料為母體結構的熒光探針多數(shù)都是用于檢測金屬離子及pH的，但研究人員的興趣不局限于此，近來利用BODIPY染料合成了一些可以對某些酸、酸根離子或氧化物響應的熒光探針。Engin U. Akkaya 合成了一種BODIPY衍生物可以檢測溶液中微摩爾濃度的氰離子。當溶液有氰離子存在時，這種結構簡單的熒光探針的發(fā)射強度急劇下降，溶液顏色可逆的由紅色變?yōu)樗{色