第八章發(fā)酵機制及發(fā)酵過程動力學(xué)

1、第六章-2 發(fā)酵過程動力學(xué)的基本概念 發(fā)酵過程的反應(yīng)描述及速度概念 發(fā)酵過程動力學(xué)研究的基本內(nèi)容 菌體生長、產(chǎn)物形成、基質(zhì)消耗動力學(xué)的基本概念 反應(yīng)動力學(xué)的應(yīng)用連續(xù)培養(yǎng)的 操作特性第一節(jié) 發(fā)酵過程的反應(yīng)描述及速度概念 XS（底物）（底物） X（菌體）（菌體） P（產(chǎn)物）（產(chǎn)物）發(fā)酵研究的內(nèi)容：1 發(fā)酵過程反應(yīng)的描述菌種的來源找到一個好的菌種發(fā)酵過程的工藝控制最大限度發(fā)揮菌種的潛力基質(zhì)的消耗速度：dsrdt dsdt X X發(fā)酵過程反應(yīng)速度的描述基質(zhì)的消耗比速：(g.L-1.s-1)(h-1、s-1)單位時間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì)或形成產(chǎn)物（菌體）的量稱為比速，是生物反應(yīng)中用于描述反應(yīng)速度的常用概念

2、 XS（底物）（底物） X（菌體）（菌體） P（產(chǎn)物）（產(chǎn)物）比生長速率概念的引出在一個在一個1mL的反應(yīng)容器中，的反應(yīng)容器中，1個個細(xì)菌細(xì)菌1 min分裂產(chǎn)生分裂產(chǎn)生10個細(xì)菌個細(xì)菌;反應(yīng)速率為反應(yīng)速率為9個個/(mLmin)哪個反應(yīng)速率大？哪個反應(yīng)速率大？哪種細(xì)菌生產(chǎn)效能大？為什么？哪種細(xì)菌生產(chǎn)效能大？為什么？菌體數(shù)量不一樣？如何更科學(xué)地菌體數(shù)量不一樣？如何更科學(xué)地衡量？衡量？采用采用比生長速率比生長速率！細(xì)胞濃度變化量細(xì)胞濃度變化量/(時間時間催化劑濃催化劑濃度度)在一個在一個1mL的反應(yīng)容器中，的反應(yīng)容器中，100個細(xì)菌個細(xì)菌1min分裂產(chǎn)生分裂產(chǎn)生200個細(xì)菌個細(xì)菌;反應(yīng)速率為反應(yīng)速

3、率為100個個/(mLmin)注意：單位催化劑濃度時，反應(yīng)注意：單位催化劑濃度時，反應(yīng)物或產(chǎn)物的反應(yīng)速率變化！物或產(chǎn)物的反應(yīng)速率變化！4dsdt X X基質(zhì)的消耗比速：(h-1)菌體的生長比速：dxdtX X產(chǎn)物的形成比速：dpdtX X(h-1)(h-1)發(fā)酵過程反應(yīng)速度的描述 XS（底物）（底物） X（菌體）（菌體） P（產(chǎn)物）（產(chǎn)物）2 發(fā)酵反應(yīng)動力學(xué)的研究內(nèi)容研究反應(yīng)速度及其影響因素并建立反應(yīng)速度與影響因素的關(guān)聯(lián)反應(yīng)動力學(xué)模型反應(yīng)器特性+反應(yīng)器的操作模型操作條件與反應(yīng)結(jié)果的關(guān)系，定量地控制反應(yīng)過程已建立動力學(xué)模型的類型q 機制模型：根據(jù)反應(yīng)機制建立幾乎沒有q 現(xiàn)象模型（經(jīng)驗?zāi)Ｐ停耗壳?/p>

4、大多數(shù)模型 能定量地描述發(fā)酵過程 能反映主要因素的影響3 微生物生長動力學(xué)的基本概念一、微生物在一個密閉系統(tǒng)中的生長情況：時間菌體濃度延遲期指數(shù)生長期減速期靜止期衰亡期延遲期：dxdt0 0指數(shù)生長期:mma ax x倍增時間倍增時間：td減速期:ddt 0 0靜止期： ;dxdt0 0maxmaxXXXX衰亡期:dxdt0 0二、微生物的生長動力學(xué)、Monod方程q 微生物的生長速度： f(s,p,T,pH,)q 在一定條件下(基質(zhì)限制)： f(S)Monod研究了基質(zhì)濃度與生長速度的關(guān)系Monod方程(1949)00.20.40.60.811.202004006008001000SVVmV

5、m/2Km00.20.40.60.811.202004006008001000SVVmVm/2KmmaxsSKSmaxsSvvKS米氏方程:00 . 20 . 40 . 60 . 811 . 202 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0SVVmVm/2KmmaxsSKS ：菌體的生長比速：菌體的生長比速 S：限制性基質(zhì)濃度：限制性基質(zhì)濃度 Ks：半飽和常數(shù)：半飽和常數(shù)max: 最大比生長速度最大比生長速度單一限制性基質(zhì)：就是單一限制性基質(zhì)：就是指在培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)指在培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物中，對微生物的生長物中，對微生物的生長起到限制作用的營養(yǎng)物。起到限制作用的營養(yǎng)物。12Monod

6、方程與方程與M-M方程的比較方程的比較M-M方程方程 方程 1. 酶催化反應(yīng) 2. 一種酶參與 3. 單底物的反應(yīng) 4. 反應(yīng)速率Monod方程方程 方程 1. 自催化反應(yīng) 2. 多酶反應(yīng)的系統(tǒng)集成 3. 多底物參與，一種底物限制 4. 比反應(yīng)速率Monod方程的參數(shù)求解(雙倒數(shù)法)：將Monod方程取倒數(shù)可得：111smmSKsmmSKS或： 這樣通過測定不同限制性基質(zhì)濃度下，微生物的比生長速度，就可以通過回歸分析計算出Monod方程的兩個參數(shù)。maxsKSS例：在一定條件下培養(yǎng)大腸桿菌，得如下數(shù)據(jù)：S(mg/l) 6 33 64 153 221(h-1) 0.06 0.24 0.43 0.

7、66 0.70求在該培養(yǎng)條件下，求大腸桿菌的max，Ks和td?解：將數(shù)據(jù)整理：S/ 100 137.5 192.5 231.8 311.3 S 6 33 64 153 221smmSKSmax，1.11 (h-1); Ks97.6 mg/L01002000100200300400 /ssm10.9m108.4sktdln2/ max0.64 hsmmSKS4 產(chǎn)物形成動力學(xué)的基本概念一、初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物次級代謝產(chǎn)物：還有一類產(chǎn)物，對細(xì)胞的代謝功能沒有明顯還有一類產(chǎn)物，對細(xì)胞的代謝功能沒有明顯 的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等，的影響，一般是在穩(wěn)定期形成，如抗生素等， 這一類化

8、合物稱為次級代謝產(chǎn)物。這一類化合物稱為次級代謝產(chǎn)物。初級代謝產(chǎn)物：微生物合成的主要供給細(xì)胞生長的一類物質(zhì)。微生物合成的主要供給細(xì)胞生長的一類物質(zhì)。 如氨基酸、核苷酸等等，這些物質(zhì)稱為初級如氨基酸、核苷酸等等，這些物質(zhì)稱為初級 代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物。二、Gaden對發(fā)酵的三分類與Pirt方程：一類發(fā)酵 產(chǎn)物的形成和菌體的生長相偶聯(lián)xp二類發(fā)酵 產(chǎn)物的形成和菌體的生長部分偶聯(lián)xp三類發(fā)酵 產(chǎn)物的形成和菌體的生長非偶聯(lián)偶聯(lián)xpPirt方程 a + bq a=0、b0： 可表示一類發(fā)酵q a0、b=0： 可表示二類發(fā)酵q a0、b0：可表示三類發(fā)酵5 微生物反應(yīng)器操作基礎(chǔ)微生物培養(yǎng)過程根據(jù)是否要求供氧，

9、分為厭氧和 好氧培養(yǎng)。前者主要采用不通氧的深層培養(yǎng)；后 者采用以下幾種方法：液體表面培養(yǎng)(如使用淺盤） 通風(fēng)固態(tài)發(fā)酵 通氧深層培養(yǎng)就操作方式而言，深層培養(yǎng)可分為： (1) 分批式操作 (2) 反復(fù)分批式操作 (3) 半分批式操作 (4) 反復(fù)半分批式操作 (5) 連續(xù)式操作2223液體發(fā)酵根據(jù)微生物的聚集狀態(tài)，又可分為深層培養(yǎng)（浸沒培養(yǎng)）、表面培養(yǎng)和附著培養(yǎng)24表表 5-1發(fā)酵過程的種類發(fā)酵過程的種類分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)補料分批培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)一 分批發(fā)酵 分批發(fā)酵是指在一封閉培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)含有初始限制量的基質(zhì)的發(fā)酵方式。 分批發(fā)酵是胰一簡單的過程，培養(yǎng)基中接分批發(fā)

10、酵是胰一簡單的過程，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除入菌種以后，沒有物料的加入和取出，除了空氣的通入和排氣。整個過程中菌的濃了空氣的通入和排氣。整個過程中菌的濃度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都度、營養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時間變化。隨時間變化。Growth cycle of populations in batch culture遲滯期遲滯期對數(shù)生長期對數(shù)生長期穩(wěn)穩(wěn) 定定 期期死亡期死亡期微生物生長的各階段特征生長階段生長階段特征特征延滯期延滯期細(xì)胞不分裂（不生長），但細(xì)胞變大，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞不分裂（不生長），但細(xì)胞變大，細(xì)胞內(nèi)RNARNA含量增高，含量增高，原生質(zhì)呈堿性

11、，合成代謝活躍，易合成新的誘導(dǎo)酶，對外界原生質(zhì)呈堿性，合成代謝活躍，易合成新的誘導(dǎo)酶，對外界環(huán)境變化敏感。接種物中死細(xì)胞較多或培養(yǎng)基不豐富時延滯環(huán)境變化敏感。接種物中死細(xì)胞較多或培養(yǎng)基不豐富時延滯期較長期較長指數(shù)期指數(shù)期細(xì)胞分裂（生長）最快，細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，酶系活躍，代細(xì)胞分裂（生長）最快，細(xì)胞進(jìn)行平衡生長，酶系活躍，代謝旺盛。生長速率由營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件決定謝旺盛。生長速率由營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件決定穩(wěn)定期穩(wěn)定期(靜止期靜止期)新繁殖的細(xì)胞與死亡細(xì)胞數(shù)目相等，菌體產(chǎn)量達(dá)到最高，細(xì)新繁殖的細(xì)胞與死亡細(xì)胞數(shù)目相等，菌體產(chǎn)量達(dá)到最高，細(xì)胞開始儲藏糖原、脂肪等儲藏物，產(chǎn)芽孢的開始形成芽孢，胞開始儲藏糖

12、原、脂肪等儲藏物，產(chǎn)芽孢的開始形成芽孢，開始合成次生代謝產(chǎn)物?？赡苡捎跔I養(yǎng)物的消耗或抑制生長開始合成次生代謝產(chǎn)物。可能由于營養(yǎng)物的消耗或抑制生長的代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞停止增殖，但仍存活的代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞停止增殖，但仍存活衰亡期衰亡期死亡細(xì)胞數(shù)目超過新生細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)多樣，細(xì)胞開始自溶，死亡細(xì)胞數(shù)目超過新生細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)多樣，細(xì)胞開始自溶，開始釋放次生代謝產(chǎn)物開始釋放次生代謝產(chǎn)物1. 分批發(fā)酵的基礎(chǔ)理論 式中：X0原始菌體濃度，g/L； Xt經(jīng)間隔時間t后的菌體濃度； 比生長速率,h-1。 將菌體的自然對數(shù)與時間作圖可得一直線，其斜率是。微生物在指數(shù)生長期間的比生長速率最大（ max）。 典型微

13、生物max值如下：產(chǎn)黃青霉菌0.12，構(gòu)巢曲霉菌0.36，甲烷單孢菌0.53，貝內(nèi)克氏菌4.24 h-1 。tXXt0lnln 在分批培養(yǎng)過程中根據(jù)產(chǎn)物生成是否與菌體生長同步的關(guān)系，Pirt(1975)將微生物產(chǎn)物形成動力學(xué)分為與生長有聯(lián)系的和與生長無聯(lián)系的類型。A.生長關(guān)聯(lián)型 與生長有關(guān)的產(chǎn)物形成，可用下式描述： qP=Yp/X 式中： qP 產(chǎn)物形成比速率，g/hL； Yp/X 菌體生長為基準(zhǔn)的產(chǎn)物得率（g/g) ； 比生長速率,h-1。B.非生長關(guān)聯(lián)型 產(chǎn)物的形成速度只與細(xì)胞積累量有關(guān)，可用下式描述：式中： 比例常數(shù)； dP/dt產(chǎn)物合成速度g/L h； X菌體濃度g/L。XdtdP抗生

14、素發(fā)酵過程可分為三個階段：菌體生長期、抗生素合成期和菌體自溶期圖圖 殺念珠菌發(fā)酵中葡萄糖、殺念珠菌發(fā)酵中葡萄糖、DNA、抗生素產(chǎn)、抗生素產(chǎn)量的代謝變化量的代謝變化ADNA； B葡萄糖；葡萄糖； C殺念珠菌素產(chǎn)量殺念珠菌素產(chǎn)量2. 重要的生長參數(shù) （下圖）在濃度較低的（A-B）范圍內(nèi)，靜止期的細(xì)胞濃度與初始基質(zhì)濃度成正比：X=Y(S0-St) 在后期，菌量不隨初始基質(zhì)濃度的增加而增加，菌的生長受到有害代謝物的抑制?？捎肕onod方程描述和s之間的關(guān)系：SKSSmax3.分批發(fā)酵的優(yōu)缺點 產(chǎn)物為細(xì)胞本身：維持最高生長量的條件 產(chǎn)物為初級代謝產(chǎn)物：延長與產(chǎn)物關(guān)聯(lián)的對數(shù)生長期； 產(chǎn)物為次級代謝產(chǎn)物：縮

15、短對數(shù)生長期，延長生產(chǎn)期，或降低對數(shù)期的生長速率。 優(yōu)缺點： 操作簡單，周期短，染菌的機會減少，產(chǎn)品質(zhì)量易掌握； 存在基質(zhì)抑制問題，出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象，產(chǎn)品產(chǎn)量低。二 補料分批發(fā)酵 在分批培養(yǎng)過程中補入新鮮的料液在分批培養(yǎng)過程中補入新鮮的料液，以克服營養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過，以克服營養(yǎng)不足而導(dǎo)致的發(fā)酵過早結(jié)束的缺點。早結(jié)束的缺點。 在此過程中只有料液的加入沒有料在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時有所增加。在工體積比發(fā)酵開始時有所增加。在工廠的實際生產(chǎn)中采用這種方法很多廠的實際生產(chǎn)中采用這種方法很多。 補料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵

16、，是指在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。Xt=X0+Y(S0-St) 補料分批發(fā)酵與傳統(tǒng)分批發(fā)酵相比，其優(yōu)點在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度。 低基質(zhì)濃度的優(yōu)點：1)可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當(dāng)?shù)木w濃度，使不致于加劇供氧的矛盾。2)避免培養(yǎng)基積累有毒代謝物。 與連續(xù)發(fā)酵相比，補料分批發(fā)酵不需要嚴(yán)格的無菌條件，也不會產(chǎn)生菌種老化和變異等問題，其應(yīng)用范圍十分廣泛，包括抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有機酸及高聚物等。缺點缺點 由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最由于沒有物料取出，產(chǎn)物的積累最終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料終導(dǎo)致比生產(chǎn)速率的下降。由于有物料的加入

17、增加了染菌機會的加入增加了染菌機會三 半連續(xù)發(fā)酵 在補料分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上加上間歇放掉部分發(fā)酵液稱為半連續(xù)發(fā)酵。 優(yōu)點：放掉部分發(fā)酵液，再補入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產(chǎn)物合成，提高了總產(chǎn)量。 不足：損失部分養(yǎng)分、前體和菌體；提煉的發(fā)酵液體積增大；可能產(chǎn)生更多的代謝有害物；有利于非產(chǎn)生菌突變株的生長。 四 連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)發(fā)酵或連續(xù)培養(yǎng)也稱開放性培養(yǎng)即培養(yǎng)基連續(xù)發(fā)酵或連續(xù)培養(yǎng)也稱開放性培養(yǎng)即培養(yǎng)基料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時放出含有產(chǎn)品的料液連續(xù)輸入發(fā)酵罐，并同時放出含有產(chǎn)品的發(fā)酵液。發(fā)酵液。 達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，整個過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，整個過程中菌的濃度，產(chǎn)物濃度，限制性基質(zhì)濃度

18、都是恒定的。，限制性基質(zhì)濃度都是恒定的。1.管式反應(yīng)器 2.種子罐Continuous culture-the chemostatDVFdtdxx1SSXYSX0F培養(yǎng)基流速；D稀釋率連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：優(yōu)點： 1.1.能維持低基質(zhì)濃度；能維持低基質(zhì)濃度； 2.2.具有培養(yǎng)液濃度和代謝產(chǎn)物含量的相對穩(wěn)定性，保證具有培養(yǎng)液濃度和代謝產(chǎn)物含量的相對穩(wěn)定性，保證 了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定；了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定； 3.3.減少了分批培養(yǎng)中每次清洗、裝料、消毒、接種、卸減少了分批培養(yǎng)中每次清洗、裝料、消毒、接種、卸 料等操作時間，從而縮短培養(yǎng)周期，提高設(shè)備利用率料等操作時間，從而縮短培養(yǎng)周期，提高設(shè)備利用率; ;

19、 4. 4.減輕勞動強度和便于自控等；減輕勞動強度和便于自控等；缺點：缺點： 1.1.延續(xù)的時間長，發(fā)生雜菌污染的機會比較多；延續(xù)的時間長，發(fā)生雜菌污染的機會比較多； 2.2.長期進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)時細(xì)胞發(fā)生變異退化的可能性比長期進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)時細(xì)胞發(fā)生變異退化的可能性比 分批培養(yǎng)突出；分批培養(yǎng)突出； 3.3.細(xì)胞在反應(yīng)器壁、攪拌軸、排液管等處生長，增加細(xì)胞在反應(yīng)器壁、攪拌軸、排液管等處生長，增加 了連續(xù)培養(yǎng)的困難；了連續(xù)培養(yǎng)的困難；第二節(jié) 微生物反應(yīng)過程中的質(zhì)量和能量衡算 48第三節(jié) 基質(zhì)消耗動力學(xué)的基本概念SS1 菌體菌體S2 產(chǎn)物產(chǎn)物S3 維持維持 XS（底物）（底物） X（菌體）（菌體） P（產(chǎn)物）（產(chǎn)物）+維持維持維持消耗維持消耗(m) ：指維持細(xì)胞最低活性所指維持細(xì)胞最低活性所需消耗的能量，一般來需消耗的能量，一般來講，單位重量的細(xì)胞在講，單位重量的細(xì)胞在單位時間內(nèi)用于維持消單位時間內(nèi)用于維持消耗所需的基質(zhì)的量是一耗所需的基質(zhì)的量是一個常數(shù)。個常數(shù)。 XS（底物）（底物） X（菌體）（菌體） P（產(chǎn)物）（產(chǎn)物）+維持維持m: 維持消耗系數(shù)維持消耗系數(shù)YP/s: 產(chǎn)物對基質(zhì)的理論得率系數(shù)產(chǎn)物對基質(zhì)的理論得率系數(shù)XPssmYYYX/s: 細(xì)胞對基質(zhì)的理論得率系數(shù)細(xì)胞對基質(zhì)的理論得率系數(shù)312dsdsdsdsdtdtdtdt物料衡算：o反應(yīng)動力學(xué)