第7章蛋白質(zhì)分離純化與表征

1、一種蛋白質(zhì)的混合物在pH6的DEAE-纖維素柱中被分離，用pH6稀鹽緩沖液可以洗脫C，用pH6的高鹽緩沖液，B和A依次被洗脫，用凝膠過(guò)濾測(cè)定得A的Mr 是240000，B的Mr是120000，C的Mr是60000。但SDS-PAGE只發(fā)現(xiàn)一條帶。請(qǐng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果 DEAE-纖維素柱層析的結(jié)果說(shuō)明，在pH6的條件下，A帶有較多的負(fù)電荷，B次之，C帶負(fù)電荷最少。凝膠過(guò)濾法測(cè)出A的Mr是C的4倍，B的Mr是C的2倍，但SDS-PAGE只發(fā)現(xiàn)一條帶。由于SDS-PAGE測(cè)定的亞基的Mr，凝膠過(guò)濾法可以測(cè)定寡聚體的Mr，可以推斷C是單體，B是以C為亞基的二聚體，A是以C 為亞基的4聚體，由于C在pH6時(shí)帶

2、負(fù)電荷，隨著亞基數(shù)的增加，帶負(fù)電荷的量也會(huì)增加，這與DEAE-纖維素層析的結(jié)果也是一致的。 蛋白質(zhì)分離純化是利用其特性的差異蛋白質(zhì)分離純化是利用其特性的差異 分子的大小和形狀分子的大小和形狀 酸堿性質(zhì)酸堿性質(zhì) 溶解度溶解度 吸附性質(zhì)吸附性質(zhì) 對(duì)配體分子的特異生物學(xué)親和力對(duì)配體分子的特異生物學(xué)親和力蛋白質(zhì)純化應(yīng)根據(jù)研究工作和生產(chǎn)的具體目的和要求，蛋白質(zhì)純化應(yīng)根據(jù)研究工作和生產(chǎn)的具體目的和要求，制訂分離純化的合理程序。制訂分離純化的合理程序。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)含有酸含有酸/ /堿堿AAAA殘基殘基具有兩性具有兩性 堿堿/ /酸酸越大越大pIpI 越大越大 pI通常在通常在 6.0 左右左右一、蛋白質(zhì)的

3、酸堿性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的分子量 一般在一萬(wàn)至一百萬(wàn)一般在一萬(wàn)至一百萬(wàn)道爾頓道爾頓之間之間 1道爾頓道爾頓1C12絕對(duì)質(zhì)量絕對(duì)質(zhì)量/12 1.6610-27千克千克二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的原理和方法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的原理和方法（一）（一） 根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量（二）（二） 沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（三）（三） 凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（四）（四） SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量量（

4、一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最小分子量（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最小分子量1 1、測(cè)定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量、測(cè)定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2 2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對(duì)分子質(zhì)量最低相對(duì)分子質(zhì)量= 100* 55.8/鐵的百分含量鐵的百分含量例如肌紅蛋白含鐵量為例如肌紅蛋白含鐵量為0.335%，那么其最低相對(duì)，那么其最低相對(duì)分子質(zhì)量就是分子質(zhì)量就是55.8/0.335 100 = 16700（二）（二）沉降分析法沉降分析法 蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大的離心作用時(shí)，由于比重的關(guān)系，蛋白質(zhì)分子作用時(shí)，由于比重的關(guān)系，蛋白質(zhì)分子就會(huì)沉降

5、，這就是蛋白質(zhì)的沉降作用。就會(huì)沉降，這就是蛋白質(zhì)的沉降作用。 沉降的速率與蛋白質(zhì)分子大小和密度有關(guān)，因此利用沉降速率來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。沉降系數(shù)：沉降系數(shù)：把物質(zhì)在單位（厘米）離心場(chǎng)的沉降速率稱沉降系數(shù)（把物質(zhì)在單位（厘米）離心場(chǎng)的沉降速率稱沉降系數(shù)（S）（三）凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（三）凝膠過(guò)濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠柱的速度并不取決于分子的質(zhì)量，而是它的斯托克半經(jīng)。如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體過(guò)柱速度相同，則認(rèn)為具有與該球體相同的半徑，稱斯托克半徑蛋白質(zhì)混合樣蛋白質(zhì)混合樣w 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知Mr和斯托克半徑）和待測(cè)和斯托克半徑）和待測(cè)蛋白質(zhì)必須

6、具有相同的分子形狀（接近球形）蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球形）LogMLogMA AB BC CLogMLogM測(cè)測(cè)V V測(cè)測(cè)蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)：量有關(guān)： LogM LogM Ve VeVe洗脫體積，自樣品開(kāi)始洗洗脫體積，自樣品開(kāi)始洗脫到該組分的洗脫峰（峰頂）脫到該組分的洗脫峰（峰頂）出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的VeVe，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)VeVe作圖得一直線，再測(cè)出作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的待測(cè)樣品的VeVe，查標(biāo)準(zhǔn)曲，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定

7、分子量。線即可確定分子量。葡葡聚糖凝膠過(guò)濾法聚糖凝膠過(guò)濾法（四）（四）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法（最常用）（最常用）蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于：它的遷移率取決于：w所帶電荷所帶電荷w分子量分子量w分子形狀分子形狀但是如果在該系統(tǒng)中添加SDS和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的相對(duì)分子質(zhì)量。 SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）一種陰離子去污劑，（十二烷基硫酸鈉）一種陰離子去污劑，作為變性劑破壞分子內(nèi)的疏水作用和氫鍵。作為變性劑破壞分子內(nèi)的疏水作用和氫鍵。 目前測(cè)定亞基分子量的最好辦法。目前測(cè)定亞基分子

8、量的最好辦法。蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)郭堯君編著蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)郭堯君編著 科學(xué)出版社科學(xué)出版社SDSboiling均勻帶上一層負(fù)電荷所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體有相同的荷質(zhì)比亞基構(gòu)象改變，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體為棒狀由于不同的由于不同的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體具蛋白質(zhì)復(fù)合體具有相同的荷質(zhì)比和相同的構(gòu)象，有相同的荷質(zhì)比和相同的構(gòu)象，因此因此遷移率不受原有的電荷、分子形狀的遷移率不受原有的電荷、分子形狀的影響，只取決于分子量。影響，只取決于分子量。原態(tài)蛋白質(zhì) 肽鏈伸展肽鏈伸展且且SDS 以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈以其烴鏈與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合，每克蛋白可結(jié)合結(jié)合，每克蛋白可結(jié)合1.4克克SDS，相，相當(dāng)于每

9、兩個(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)當(dāng)于每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS。棒狀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）（一）膠體性質(zhì)膠體性質(zhì)（colloidal system）膠體溶液的特點(diǎn)：膠體溶液的特點(diǎn)：w分子直徑在分子直徑在1-100 nm1-100 nm內(nèi)內(nèi)w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液如：NH3、COO 、OH、-SH、-CONH-等，它們都具有高度的親水性，當(dāng)與水接確時(shí)，極易等，它們都具有高度的親水性，當(dāng)與水接確時(shí)，極易吸附水分子，使蛋白質(zhì)顆粒外圍形成一層水化膜，將吸附水分子，使

10、蛋白質(zhì)顆粒外圍形成一層水化膜，將顆粒彼此隔開(kāi)，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。顆粒彼此隔開(kāi)，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。蛋白質(zhì)的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因：蛋白質(zhì)的水溶液能形成穩(wěn)定的親水膠體的原因：、蛋白質(zhì)多肽鏈上含有許多極性基團(tuán)。、蛋白質(zhì)多肽鏈上含有許多極性基團(tuán)。 2、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在非等電狀態(tài)時(shí)，相、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在非等電狀態(tài)時(shí)，相同蛋白質(zhì)顆粒帶有同性電荷，同蛋白質(zhì)顆粒帶有同性電荷，與周圍的反離子構(gòu)成與周圍的反離子構(gòu)成穩(wěn)定的穩(wěn)定的雙電層雙電層。使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持使蛋白質(zhì)顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致互相凝聚而沉淀。一定距離，不致互相凝聚而沉淀。 +帶正電荷的蛋白

11、質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶液由于具有蛋白質(zhì)溶液由于具有水化層水化層與與雙電層雙電層兩方面的穩(wěn)定因素，所兩方面的穩(wěn)定因素，所以作為膠體系統(tǒng)是相對(duì)穩(wěn)定的。以作為膠體系統(tǒng)是相對(duì)穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應(yīng)用 由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)過(guò)半透膜半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。透析法：透析法：以半透膜提純蛋白質(zhì)的方以半透膜提純蛋白質(zhì)的方法叫透析法法叫透析法半透膜：半透膜：只允許溶劑小分子通過(guò)，只允許溶劑小分子通過(guò)，而溶質(zhì)大分子不能通過(guò)，如羊皮紙、而溶質(zhì)大分子不能通過(guò)，如羊皮紙、火棉膠、玻璃

12、紙等火棉膠、玻璃紙等 如果破壞這如果破壞這兩個(gè)因素，蛋兩個(gè)因素，蛋白質(zhì)溶液會(huì)出白質(zhì)溶液會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？現(xiàn)什么現(xiàn)象？+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的（二）蛋白質(zhì)的沉淀沉淀 Pr從膠體溶液中析出從膠體溶液中析出任何破壞穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素都可能使蛋白質(zhì)沉淀任何破壞穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素都可能使蛋白質(zhì)沉淀I I 可逆沉淀可逆沉淀 溫和溫和條件，改變?nèi)芤簵l件，改變?nèi)芤簆H或或Pr所所帶電荷帶電荷 Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒(méi)有變化結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒(méi)有變化 適當(dāng)條件下可適當(dāng)條件下可重新溶解重新溶解 非變性沉淀非變性沉淀 可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如如等電點(diǎn)沉

13、淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。等。 不可逆沉淀不可逆沉淀 強(qiáng)烈強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件沉淀?xiàng)l件 破壞破壞Pr膠體溶液膠體溶液穩(wěn)定性穩(wěn)定性 也破壞也破壞Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 沉淀沉淀不能再重新溶解不能再重新溶解變性沉淀變性沉淀 如如加熱沉淀、強(qiáng)酸加熱沉淀、強(qiáng)酸/ /堿沉淀、重金屬鹽堿沉淀、重金屬鹽 和生物堿沉淀和生物堿沉淀等等1. 鹽析 在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的高濃度的強(qiáng)電解強(qiáng)電解質(zhì)鹽質(zhì)鹽如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，如硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等，可破壞蛋白質(zhì)可破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，中和它們的電荷分子表面的水化層，中和它們的

14、電荷，因而使蛋白，因而使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析鹽析。 而而低濃度低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶鹽溶。鹽析的機(jī)理鹽析的機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。如：微生物發(fā)酵酶制劑如：微生物發(fā)酵酶制劑 各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不各種蛋白質(zhì)的親水性及荷電性均有差別，因此不同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃

15、度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性同蛋白質(zhì)所需中性鹽濃度也有不同，只要調(diào)節(jié)中性鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分鹽濃度，就可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分散沉淀析出，這種方法稱為散沉淀析出，這種方法稱為分段鹽析分段鹽析。 等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入加入NaCl后沉后沉淀溶解淀溶解鹽溶鹽溶 原因？原因？鹽溶鹽溶分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量鹽離子量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中溶于水中鹽溶2. 有機(jī)溶劑沉淀法： 在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的在蛋白質(zhì)溶液中，加入能

16、與水互溶的有機(jī)溶劑如有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)的水化膜以及降低介電常數(shù)而增破壞蛋白質(zhì)的水化膜以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用。注意：注意：有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫低溫條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。3.弱酸或弱堿沉淀法(等電點(diǎn)沉淀） 用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH處處于等電點(diǎn)處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。使蛋白質(zhì)沉淀

17、。弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理： 破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷，蛋白質(zhì)分子帶有相破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷，蛋白質(zhì)分子帶有相同數(shù)量的正負(fù)電荷，因此，蛋白質(zhì)分子相互吸同數(shù)量的正負(fù)電荷，因此，蛋白質(zhì)分子相互吸引，從而聚集沉淀。引，從而聚集沉淀。酸酸酸酸堿堿堿堿堿堿酸酸溶液中蛋白質(zhì)的聚沉溶液中蛋白質(zhì)的聚沉4.重金屬鹽沉淀(條件：pH 稍大于pI為宜) 當(dāng)當(dāng)pH 稍大于稍大于pI時(shí)，時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷這蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷這樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而樣就容易與重金屬離子結(jié)合成不溶性鹽而沉沉淀。淀。重金屬沉淀法的機(jī)理重金屬沉淀法的機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合重金屬鹽加入之后，與帶

18、負(fù)電的羧基結(jié)合。 例如：例如：“牛奶解毒，汞消毒牛奶解毒，汞消毒”5.生物堿試劑沉淀法（條件：pH稍小于pI） 生物堿生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類是植物組織中具有顯著生理作用的一類含氮含氮的堿性物質(zhì)。的堿性物質(zhì)。 能夠沉淀生物堿的試劑稱為能夠沉淀生物堿的試劑稱為生物堿試劑生物堿試劑。生物生物堿試劑一般為堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。氯乙酸等。 生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理： 在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)

19、生沉淀。 例如：例如：“柿石癥，啤酒澄清柿石癥，啤酒澄清”6.加熱變性沉淀法 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固固。少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固少量鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，加熱凝固最完全和最迅速完全和最迅速. 如：如：煮雞蛋煮雞蛋 酶的制備：酶的制備：超氧化物歧化酶的提取超氧化物歧化酶的提取原因：天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露，原因：天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露， 破壞水化層及帶電狀態(tài)破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.1.前處理：因動(dòng)前處理：因動(dòng)/ /植

20、物植物/ /細(xì)菌而異細(xì)菌而異2.2.粗分級(jí)分離：采用鹽析粗分級(jí)分離：采用鹽析/ /等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀/ /有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過(guò)濾、離子交細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等換層析、吸附層析以及親和層析等4.4.結(jié)晶是最后步驟結(jié)晶是最后步驟五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)根據(jù)分子大小不同分子大小不同的純化方法的純化方法 1、透析和超過(guò)濾、透析和超過(guò)濾w利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜將其利用蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜將其 與小分子物質(zhì)分開(kāi)與小分子物質(zhì)分開(kāi)w半透膜為玻璃紙或纖維素材料半透膜為玻璃紙或纖維素材料血液透析血液

21、透析小分子溶出小分子被帶出小分子被帶出透析機(jī)透析機(jī)透析液透析液加加壓壓血液血液2 2、密度梯度（區(qū)帶）離心、密度梯度（區(qū)帶）離心用一定的介質(zhì)（如蔗糖）在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將蛋白質(zhì)混合液置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使蛋白質(zhì)分層、分離。 3、凝膠過(guò)濾、凝膠過(guò)濾3. 凝膠過(guò)濾（二）利用溶解度差別的純化方法（二）利用溶解度差別的純化方法 1. 1.等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀 調(diào)整溶液調(diào)整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI處依次沉淀處依次沉淀 2.2.鹽溶和鹽析鹽溶和鹽析3.3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法有機(jī)溶劑分級(jí)分離法w降低介電常數(shù)降低介電常數(shù)w爭(zhēng)奪水化膜爭(zhēng)奪水化膜影響溶解度的外部因素有：pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。4. 溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶劑度的影響溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶劑度的影響（三（三) )根據(jù)電荷不同的分離方法根據(jù)電荷不同的分離方法1.1.電泳電泳原理：原理： 蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為0 0 分子大小不同，電場(chǎng)中移動(dòng)速度也不同分子大小不同，電場(chǎng)中移動(dòng)速度也不同平板電泳平板電泳等電聚焦電泳等電聚焦電泳雙向電泳雙向電泳離子交換層析離子交換層析（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸