液相色譜質(zhì)譜分析

1、 液相色譜質(zhì)譜分析液相色譜質(zhì)譜分析一、一、 液相色譜概述液相色譜概述二、二、 HPLCHPLC儀器構(gòu)成儀器構(gòu)成三、高效液相色譜法的類型及分離機(jī)理三、高效液相色譜法的類型及分離機(jī)理四、色譜分離方法的選擇四、色譜分離方法的選擇五、質(zhì)譜儀五、質(zhì)譜儀主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、一、 概概 述述 高效液相色譜高效液相色譜（HPLC）是一種以是一種以液體為流液體為流動(dòng)相動(dòng)相的的快速分離分析色譜技術(shù)快速分離分析色譜技術(shù)。具有。具有高壓、高速、高壓、高速、高效、高靈敏度高效、高靈敏度的特點(diǎn)，對(duì)于那些的特點(diǎn)，對(duì)于那些沸點(diǎn)高沸點(diǎn)高，熱穩(wěn)熱穩(wěn)定性差定性差，相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量大的的有機(jī)化合物有機(jī)化合物如烷烴、如烷烴、

2、烯烴、芳烴、染料、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等均烯烴、芳烴、染料、蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等均可進(jìn)行分離分析。可進(jìn)行分離分析。 1 、高效液相色譜、高效液相色譜1）高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá) 10cm3min-1.2）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)高效液

3、相色譜的優(yōu)點(diǎn)3）氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)。因此，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。 4）氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)2 、液相色譜儀器液相色譜儀器（high performance liquid chromatograph）液相色譜儀（液相色譜儀（1）液相色譜儀（液相色譜

4、儀（2）液相色譜儀（液相色譜儀（3）液相色譜儀（液相色譜儀（4）LCQ Deca XP MAX液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀二、二、 HPLC儀器構(gòu)成儀器構(gòu)成1 、流程流程2 、 HPLC儀器組成：儀器組成： 高壓輸液裝置高壓輸液裝置 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng) 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng) 高壓輸液系統(tǒng) (1) 貯液器貯液器 用來供給足夠數(shù)量的合乎要求的流動(dòng)相以完成分析用來供給足夠數(shù)量的合乎要求的流動(dòng)相以完成分析工作。工作。材質(zhì)：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮材質(zhì)：玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料聚醚醚酮（PEEK） 容積：容積：0.52.0L 放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓

5、差放置位置：高于泵體，保持一定的輸液靜壓差 注意：密封、過濾注意：密封、過濾流動(dòng)相過濾與脫氣裝置 流動(dòng)相過濾裝置 分為在線過濾和真空過濾 流動(dòng)相脫氣裝置 分為在線真空脫氣和超聲波脫氣泵體材料耐腐蝕泵體材料耐腐蝕泵腔的體積要小，泵腔的體積要小，以便快速更換以便快速更換溶劑溶劑能在高壓下連續(xù)能在高壓下連續(xù)工作工作, ,耐壓耐壓40-40-50MPa. cm50MPa. cm2 2壓力平穩(wěn)，無壓力平穩(wěn)，無脈沖脈沖高壓輸液泵高壓輸液泵輸出流量穩(wěn)定，輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高重復(fù)性高, ,輸出輸出流量范圍寬流量范圍寬(2) 高壓輸液泵高壓輸液泵 梯度淋洗裝置梯度淋洗裝置 (內(nèi)梯度)(外梯度)梯度淋洗裝置梯度

6、淋洗裝置等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫梯度洗脫梯度洗脫的特點(diǎn)的特點(diǎn)分配比變化范圍寬的分配比變化范圍寬的復(fù)雜樣品應(yīng)采取復(fù)雜樣品應(yīng)采取梯度洗脫方式分離梯度洗脫方式分離1) 對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。對(duì)樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產(chǎn)生沉淀。2) 適用于所選擇的檢測(cè)器。適用于所選擇的檢測(cè)器。3) 化學(xué)惰性好，以免破壞固定相?；瘜W(xué)惰性好，以免破壞固定相。4) 低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。低粘度，增加樣品的擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效。5) 純度高。溶劑不純會(huì)增加檢測(cè)器噪聲，產(chǎn)生偽峰。純度高。溶劑不純會(huì)增加檢測(cè)器噪聲，產(chǎn)生偽峰。流動(dòng)相溶劑選流動(dòng)相溶劑選擇的一般要求擇的一般要求(2)

7、(2) 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣針進(jìn)樣針六通閥六通閥 準(zhǔn)備狀態(tài)準(zhǔn)備狀態(tài) 進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)六通閥進(jìn)樣六通閥進(jìn)樣 裝置裝置六通閥進(jìn)樣六通閥進(jìn)樣 裝置的使用及保養(yǎng)裝置的使用及保養(yǎng)1、進(jìn)樣樣品要求無微粒和能阻死針頭及進(jìn)樣閥的物質(zhì)，樣品 溶液均要用045微米的濾膜過濾。 2、進(jìn)樣時(shí)，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，以免漏液和引 入空氣；另外，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。 3、進(jìn)樣時(shí)，要求完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，以此提 高精密度及重現(xiàn)性。4、進(jìn)樣時(shí)，手柄處于Load和Inject之間時(shí)，應(yīng)盡快轉(zhuǎn)閥，不 能停留在中途。5、每次結(jié)束后應(yīng)反復(fù)沖洗進(jìn)樣器再用無纖維紙擦凈注射器針 頭的外側(cè)。(3) 分離系統(tǒng)分

8、離系統(tǒng) 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長，柱長540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱色譜柱1使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有 一定的溶解度)。2大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是27.5，盡量不超過該色譜 柱的pH范圍。3避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化。4流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。5如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱 子沖洗干凈，并保存大乙腈中。6壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號(hào)。色譜柱的使用和維護(hù)色譜柱的使用和維護(hù)(4) 液相色譜檢測(cè)器液相色譜檢測(cè)器a.

9、紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器b. 光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器f. 質(zhì)譜檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器a. 紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)?；衔镉许憫?yīng)。特點(diǎn)：特點(diǎn)： 靈敏度高； 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm 10mm，容積 8L）； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。b. 光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器 紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長，

10、計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。兩種檢測(cè)器的色譜圖兩種檢測(cè)器的色譜圖(a)：可變波長紫外檢測(cè)器；：可變波長紫外檢測(cè)器；(b)：二極管陣列檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器nm254 紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器靈敏度高，靈敏度高，精密度及線性范圍較好精密度及線性范圍較好 ，可用于梯度洗脫。可用于梯度洗脫。 流動(dòng)相選擇有限制。流動(dòng)相選擇有限制。一些常用溶劑的紫外截止波長一些常用溶劑的紫外截止波長類類 型型 主要分離機(jī)理主要分離機(jī)理 主要分析對(duì)象或應(yīng)用領(lǐng)域主要分析對(duì)象或應(yīng)用領(lǐng)域 吸附色譜吸附色譜 吸附能，氫鍵吸附能，氫鍵 異構(gòu)體分離、族分離，制備異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜分配色譜 疏水分配作用疏水分配

11、作用 各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備凝膠色譜凝膠色譜 溶質(zhì)分子大小溶質(zhì)分子大小 高分子分離，分子量及其分布的測(cè)定高分子分離，分子量及其分布的測(cè)定離子交換色譜離子交換色譜 庫侖力庫侖力 無機(jī)離子、有機(jī)離子分析無機(jī)離子、有機(jī)離子分析離子排斥色譜離子排斥色譜 Donnan膜平衡膜平衡 有機(jī)酸、氨基酸、醇、醛分析有機(jī)酸、氨基酸、醇、醛分析離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜 疏水分配作用疏水分配作用 離子性物質(zhì)分析離子性物質(zhì)分析 疏水作用色譜疏水作用色譜 疏水分配作用疏水分配作用 蛋白質(zhì)分離與純化蛋白質(zhì)分離與純化 手性色譜手性色譜 立體效應(yīng)立體效應(yīng) 手性異構(gòu)體分離，藥物純化手性異構(gòu)體

12、分離，藥物純化親和色譜親和色譜 生化特異親和力生化特異親和力 蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析三、高效液相色譜法的類型及分離機(jī)理三、高效液相色譜法的類型及分離機(jī)理2. 分配色譜（液液分配色譜）分配色譜（液液分配色譜）（1）原理）原理 根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過

13、程。過程。分離原理分離原理msccK K不僅與固定相的不僅與固定相的種類有關(guān)，也與流種類有關(guān)，也與流動(dòng)相的種類有關(guān)動(dòng)相的種類有關(guān)固定相極性固定相極性流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性正相分配色譜正相分配色譜組分極性越大，組分極性越大，保留時(shí)間越長保留時(shí)間越長反相分配反相分配色譜色譜固定相極性固定相極性流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性組分極性越小，組分極性越小，保留時(shí)間越長保留時(shí)間越長（2）分類）分類四、四、 色譜分離方法的選擇色譜分離方法的選擇五、質(zhì)譜儀五、質(zhì)譜儀1. 質(zhì)譜分析法質(zhì)譜分析法2. 質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)及工作原理質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)及工作原理3. 質(zhì)譜圖及離子峰的主要類型質(zhì)譜圖及離子峰的主要類型 質(zhì)譜分析法質(zhì)譜分析法（Ma

14、ss Spectrometry, MS）是）是在高真空系統(tǒng)中測(cè)定樣品的分子離子及碎片離在高真空系統(tǒng)中測(cè)定樣品的分子離子及碎片離子質(zhì)量，以確定樣品相對(duì)分子質(zhì)量及分子結(jié)構(gòu)子質(zhì)量，以確定樣品相對(duì)分子質(zhì)量及分子結(jié)構(gòu)的方法?；衔锓肿邮艿诫娮恿鳑_擊后，形成的方法?；衔锓肿邮艿诫娮恿鳑_擊后，形成的帶正電荷分子離子及碎片離子，按照其質(zhì)量的帶正電荷分子離子及碎片離子，按照其質(zhì)量m和電荷和電荷z的比值的比值m/z（質(zhì)荷比）大小依次排列（質(zhì)荷比）大小依次排列而被記錄下來的圖譜，稱為質(zhì)譜。而被記錄下來的圖譜，稱為質(zhì)譜。 1. 質(zhì)譜分析法質(zhì)譜分析法 根據(jù)質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比測(cè)定化合物的分子量，根據(jù)質(zhì)譜峰的質(zhì)荷比測(cè)定化合物

15、的分子量，推測(cè)分子式及結(jié)構(gòu)式推測(cè)分子式及結(jié)構(gòu)式 根據(jù)峰強(qiáng)度進(jìn)行定量分析根據(jù)峰強(qiáng)度進(jìn)行定量分析 CH32.2.質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)（1） 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)作用：作用：將樣品分子引入到離子源中將樣品分子引入到離子源中。 蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣六通閥直接進(jìn)樣六通閥直接進(jìn)樣 色譜進(jìn)樣系統(tǒng)色譜進(jìn)樣系統(tǒng)方式：方式：(2) 離子源離子源作用：作用： 1. 將導(dǎo)入質(zhì)譜儀系統(tǒng)的樣品去溶劑化將導(dǎo)入質(zhì)譜儀系統(tǒng)的樣品去溶劑化 2. 將離子源處的大氣壓與質(zhì)譜儀系統(tǒng)一級(jí)將離子源處的大氣壓與質(zhì)譜儀系統(tǒng)一級(jí) 真空阻隔開真空阻隔開 3. 被分析物離子化或?qū)⑷軇┲械碾x子轉(zhuǎn)化被分析物離子化或?qū)⑷軇┲械碾x子轉(zhuǎn)化 成氣相成氣

16、相 4. 去除中性物質(zhì)和帶反極性電荷離子，否去除中性物質(zhì)和帶反極性電荷離子，否 則會(huì)對(duì)分析產(chǎn)生干擾則會(huì)對(duì)分析產(chǎn)生干擾電噴霧電離源電噴霧電離源(ESI)多電荷離子多電荷離子測(cè)定的樣品分子量大測(cè)定的樣品分子量大(3) 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器 a 單聚焦型磁分析器單聚焦型磁分析器作用作用: 是將不同碎片按質(zhì)荷比是將不同碎片按質(zhì)荷比m/z分開。分開。質(zhì)量分析器類型：磁分析器、飛行時(shí)間、四極桿、離子捕獲、離子回旋等。 b 四級(jí)桿分析器四級(jí)桿分析器(4) 檢測(cè)器檢測(cè)器 電子倍增器示意圖 質(zhì)譜儀常用的檢測(cè)器有法拉第杯(Faraday Cup)、電子倍增器及閃爍計(jì)數(shù)器、照相底片等。陰極陰極放大放大105-108

17、倍倍特點(diǎn)：特點(diǎn)：實(shí)現(xiàn)高靈敏度、快速測(cè)定實(shí)現(xiàn)高靈敏度、快速測(cè)定.(5) 真空系統(tǒng)真空系統(tǒng)作用：作用： 1) 消減離子的不必要碰撞，避免離消減離子的不必要碰撞，避免離子損失；子損失；2) 避免避免離子分子反應(yīng)改變裂解模離子分子反應(yīng)改變裂解模式，使質(zhì)譜復(fù)雜化；式，使質(zhì)譜復(fù)雜化；3) 減小本底。減小本底。離子源離子源質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器真空度要求：真空度要求： 脂環(huán)硫醚、硫酮共軛烯烴直鏈烷烴酰胺酮醛胺脂醚羧酸支鏈烴腈伯醇叔醇縮醛c、分子離子峰與鄰近峰的質(zhì)量差是否合理。分子離子峰與鄰近峰的質(zhì)量差是否合理。 有機(jī)分子失去碎片大小是有規(guī)律的：如失去H、CH3、H2O、C2H5，因而質(zhì)譜圖中可看到M-1，M-

18、15，M-18，M-28等峰，而不可能出現(xiàn)M-3，M-14，M-24等峰，如出現(xiàn)這樣的峰，則該峰一 定不是分子離子峰。 質(zhì)量差為(4-13)、19-25、37、38、50-53、65-66的不是分子離子峰，當(dāng) 差值為14=CH2時(shí)應(yīng)小心，這表明可能有待測(cè)物的同系物存在。b、利用經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：、利用經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：分子離子峰應(yīng)符合“氮律” 在C、H、O組成的化合物中，分子離子峰的質(zhì)量數(shù)一定是偶數(shù)；在含C、H、O、N化合物中，含偶數(shù)個(gè)N的分子量為偶數(shù)，含奇數(shù)個(gè)N的分子量為奇數(shù)不符合上述規(guī)律者必不是分子離子峰。 通過改變儀器實(shí)驗(yàn)條件來檢驗(yàn)：通過改變儀器實(shí)驗(yàn)條件來檢驗(yàn)： 1）采用化學(xué)電離源、場(chǎng)離子或場(chǎng)解吸源等電

19、離方法； 2）制備易揮發(fā)的衍生物，如通過甲基化、乙?；?、甲酯化、氧化或還原等方法將樣品制備成適當(dāng)?shù)难苌锖笤贉y(cè)定。 3、結(jié)構(gòu)鑒定、結(jié)構(gòu)鑒定 a) 根據(jù)質(zhì)譜圖，找出分子離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、m/z、相對(duì)峰高等質(zhì)譜信息，根據(jù)各類化合物的裂解規(guī)律，重組整個(gè)分子結(jié)構(gòu)。 b) 采用與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)照的方法。 由質(zhì)譜數(shù)據(jù)推導(dǎo)有物機(jī)分子結(jié)構(gòu)的過程，形象地說，由質(zhì)譜數(shù)據(jù)推導(dǎo)有物機(jī)分子結(jié)構(gòu)的過程，形象地說，如同用彈弓擊碎一個(gè)瓷花瓶，再由一堆碎片來拼湊復(fù)原花如同用彈弓擊碎一個(gè)瓷花瓶，再由一堆碎片來拼湊復(fù)原花瓶的過程。瓶的過程。 蜂膠素被譽(yù)為蜂膠素被譽(yù)為“紫色黃金紫色黃金”，集動(dòng)植物之精華，集動(dòng)植物之精華,

20、 ,具有復(fù)雜而獨(dú)特的化學(xué)組成。富含黃酮類和萜烯具有復(fù)雜而獨(dú)特的化學(xué)組成。富含黃酮類和萜烯類物質(zhì)。黃酮是人體必需營養(yǎng)成份之一，體內(nèi)不類物質(zhì)。黃酮是人體必需營養(yǎng)成份之一，體內(nèi)不能合成，但對(duì)調(diào)節(jié)生理功能，提高生命運(yùn)動(dòng)質(zhì)量能合成，但對(duì)調(diào)節(jié)生理功能，提高生命運(yùn)動(dòng)質(zhì)量有重要意義。而蜂膠中含有多種黃酮類物質(zhì)，因有重要意義。而蜂膠中含有多種黃酮類物質(zhì)，因此對(duì)蜂膠產(chǎn)品的開發(fā)和使用有重要的社會(huì)意義。此對(duì)蜂膠產(chǎn)品的開發(fā)和使用有重要的社會(huì)意義。53實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) HLPC分離蜂膠中的黃酮類物質(zhì)分離蜂膠中的黃酮類物質(zhì)儀器與試劑儀器與試劑 SURVEYORSURVEYOR液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀( (美國菲尼根公司美國菲尼根公司) ) 甲醇（色譜純）甲醇（色譜純）; ;水（高純水）水（高純水）; ;蘆丁蘆丁, ,槲皮素槲皮素, ,木犀草素木犀草素, ,染料染料木素木素, ,高良姜素高良姜素, ,姜黃素標(biāo)樣（分析純）姜黃素標(biāo)樣（分析純） 原料原料 蜂膠由河南科技學(xué)院養(yǎng)蜂廠提供蜂膠由河南科技學(xué)院養(yǎng)蜂廠提供54 色譜條件的選擇色譜條件的選擇 色譜柱色譜柱:EclipseXDB-C:EclipseXDB-C1818(4.6(4.6* *150m