基因敲除小鼠的實驗流程

1、 基本實驗流程基本實驗流程 擴增擴增 一、動物基因組一、動物基因組DNA的提取的提取實驗原理實驗原理 真核生物的一切有核細胞（包括培養(yǎng)細胞）都能用來真核生物的一切有核細胞（包括培養(yǎng)細胞）都能用來制備制備基因組基因組 DNA。真核生物的。真核生物的DNA是以染色體的形式是以染色體的形式存在于細胞核內(nèi)，因此，制備存在于細胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分分子的完整。提取子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞的一般過程是將分散好的組織細胞在含在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶（十二烷

2、基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。從溶液中析出。每只小鼠鼠尾加入每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和裂解液和10ul 蛋白酶蛋白酶K(20mg/ml)，55度水浴過夜，至鼠尾溶解。度水浴過夜，至鼠尾溶解。提提DNA步驟：步驟：1. 每管鼠尾加入每管鼠尾加入300ul飽和飽和NaCl，充分混勻，充分混勻，12500rpm 離心離心20min2. 取上清取上清700ul至新的離心管中，加入預冷的異丙至新的離心管中，加入預冷的異丙

3、醇醇700ul，上下顛倒混勻，動作輕柔，直至看到，上下顛倒混勻，動作輕柔，直至看到絮狀絮狀DNA析出為止析出為止, 12500rpm 離心離心20min，棄上清棄上清3. 加入加入800ul 75%乙醇于離心管中，洗沉淀，乙醇于離心管中，洗沉淀，12500rpm離心離心10min4. 晾干沉淀，加入晾干沉淀，加入100ul的的PCR級的水。級的水。二、二、PCR擴增擴增 cycle2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量可以的含量可以放大放大100萬倍萬倍以上。以上。動畫動畫PCR:（20ul體系）o2x Mix 10ulo無菌水 2ulo2pmol引物1 2ulo2pmol引物2

4、2ulo2pmol引物3 2ulo模板DNA 2ulPCR擴增儀擴增儀95 3min95 30sec60 30sec72 30sec72 5min35 cycles三、瓊脂糖凝膠電泳三、瓊脂糖凝膠電泳原理：原理： 在在pH8.08.3的緩沖液中，核酸分子帶負電荷，的緩沖液中，核酸分子帶負電荷，向正極移動。由于不同大小和構象的核酸分子電荷密度向正極移動。由于不同大小和構象的核酸分子電荷密度大致相同，因此在自由泳動時，各種核酸分子的遷移率大致相同，因此在自由泳動時，各種核酸分子的遷移率相似，無法分開。然而，在濃度適當?shù)哪z中，由于分相似，無法分開。然而，在濃度適當?shù)哪z中，由于分子篩效應，使大小和構象不同的核酸遷移率出現(xiàn)差異，子篩效應，使大小和構象不同的核酸遷移率出現(xiàn)差異，從而把它們分開。核酸在凝膠中的遷移率取決于其分子從而把它們分開。核酸在凝膠中的遷移率取決于其分子大小、高級結構、膠濃度和電場強度，與分子的堿基組大小、高級結構、膠濃度和電場強度，與分子的堿基組成及電泳溫度（成及電泳溫度（430之間）無明顯關系。一般說，之間）無明顯關系。一般說，同樣構象的分子遷移率與分子