基因敲除小鼠的實(shí)驗(yàn)流程

1、 基本實(shí)驗(yàn)流程基本實(shí)驗(yàn)流程 擴(kuò)增擴(kuò)增 一、動(dòng)物基因組一、動(dòng)物基因組DNA的提取的提取實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來(lái)真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來(lái)制備制備基因組基因組 DNA。真核生物的。真核生物的DNA是以染色體的形式是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，制備存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分分子的完整。提取子的完整。提取DNA的一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞的一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞在含在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶（十二烷

2、基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。從溶液中析出。每只小鼠鼠尾加入每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和裂解液和10ul 蛋白酶蛋白酶K(20mg/ml)，55度水浴過(guò)夜，至鼠尾溶解。度水浴過(guò)夜，至鼠尾溶解。提提DNA步驟：步驟：1. 每管鼠尾加入每管鼠尾加入300ul飽和飽和NaCl，充分混勻，充分混勻，12500rpm 離心離心20min2. 取上清取上清700ul至新的離心管中，加入預(yù)冷的異丙至新的離心管中，加入預(yù)冷的異丙

3、醇醇700ul，上下顛倒混勻，動(dòng)作輕柔，直至看到，上下顛倒混勻，動(dòng)作輕柔，直至看到絮狀絮狀DNA析出為止析出為止, 12500rpm 離心離心20min，棄上清棄上清3. 加入加入800ul 75%乙醇于離心管中，洗沉淀，乙醇于離心管中，洗沉淀，12500rpm離心離心10min4. 晾干沉淀，加入晾干沉淀，加入100ul的的PCR級(jí)的水。級(jí)的水。二、二、PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 cycle2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量可以的含量可以放大放大100萬(wàn)倍萬(wàn)倍以上。以上。動(dòng)畫(huà)動(dòng)畫(huà)PCR:（20ul體系）o2x Mix 10ulo無(wú)菌水 2ulo2pmol引物1 2ulo2pmol引物2

4、2ulo2pmol引物3 2ulo模板DNA 2ulPCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀95 3min95 30sec60 30sec72 30sec72 5min35 cycles三、瓊脂糖凝膠電泳三、瓊脂糖凝膠電泳原理：原理： 在在pH8.08.3的緩沖液中，核酸分子帶負(fù)電荷，的緩沖液中，核酸分子帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。由于不同大小和構(gòu)象的核酸分子電荷密度向正極移動(dòng)。由于不同大小和構(gòu)象的核酸分子電荷密度大致相同，因此在自由泳動(dòng)時(shí)，各種核酸分子的遷移率大致相同，因此在自由泳動(dòng)時(shí)，各種核酸分子的遷移率相似，無(wú)法分開(kāi)。然而，在濃度適當(dāng)?shù)哪z中，由于分相似，無(wú)法分開(kāi)。然而，在濃度適當(dāng)?shù)哪z中，由于分子篩效應(yīng)，使大小和構(gòu)象不同的核酸遷移率出現(xiàn)差異，子篩效應(yīng)，使大小和構(gòu)象不同的核酸遷移率出現(xiàn)差異，從而把它們分開(kāi)。核酸在凝膠中的遷移率取決于其分子從而把它們分開(kāi)。核酸在凝膠中的遷移率取決于其分子大小、高級(jí)結(jié)構(gòu)、膠濃度和電場(chǎng)強(qiáng)度，與分子的堿基組大小、高級(jí)結(jié)構(gòu)、膠濃度和電場(chǎng)強(qiáng)度，與分子的堿基組成及電泳溫度（成及電泳溫度（430之間）無(wú)明顯關(guān)系。一般說(shuō)，之間）無(wú)明顯關(guān)系。一般說(shuō)，同樣構(gòu)象的分子遷移率與分子