生物化學(xué)14 DNA的生物合成.

1、編碼蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)或RNA等具有特定功能產(chǎn)物的、負(fù)等具有特定功能產(chǎn)物的、負(fù)載遺傳信息的基本單位，載遺傳信息的基本單位，通常是指染色體或基因組的一通常是指染色體或基因組的一段段DNA序列。序列。復(fù)制復(fù)制(replication) 是指是指DNADNA復(fù)制復(fù)制是是以母鏈以母鏈DNADNA為模板合成子鏈為模板合成子鏈DNADNA的過程。的過程。復(fù)制復(fù)制親代親代DNA子代子代DNA目錄目錄第十四章第十四章DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )目錄目錄n本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容： DNA DNA復(fù)制的基本特征復(fù)制的基本特征 DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)?/p>

2、學(xué)變化復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化 原核生物原核生物DNADNA復(fù)制過程復(fù)制過程真核生物真核生物DNADNA生物合成過程生物合成過程 逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式DNA復(fù)制的基本特征復(fù)制的基本特征Basic Rules of DNA Replication第第 一一 節(jié)節(jié)目錄目錄半保留復(fù)制半保留復(fù)制(semi-conservative replication)雙向復(fù)制雙向復(fù)制(bidirectional replication)半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication) nDNA復(fù)制的主要特征復(fù)制的主要特征 目錄目錄一、一、 DNA以半保留方

3、式進行復(fù)制以半保留方式進行復(fù)制 n半保留復(fù)制半保留復(fù)制的概念的概念: :AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈母鏈DNA復(fù)制過程中形成復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉的復(fù)制叉子代子代DNA目錄目錄n子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 目錄目錄按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式

4、，子代DNA與親代與親代DNA A的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。n半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義: :遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但但不是絕對的不是絕對的。目錄目錄 原核生物基因組是環(huán)狀原核生物基因組是環(huán)狀DNA，只有一個，只有一個復(fù)制起復(fù)制起點（點（origin）。復(fù)制從起點開始，向兩個方向。復(fù)制從起點開始，向兩個方向進行解鏈，進行的是單點起始進行解鏈，進行的是單點起始雙向復(fù)制雙向復(fù)制。二、二、DNA復(fù)制從起點向兩個方向延伸復(fù)制從起點向兩個

5、方向延伸復(fù)制中的放射自顯影圖象復(fù)制中的放射自顯影圖象A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點及復(fù)制起始點B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點復(fù)制接近終止點(termination, ter)oriterA B C目錄目錄 真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子的復(fù)制。從一個制子的復(fù)制。從一個DNA復(fù)制起點起始的復(fù)制起點起始的DNA復(fù)制區(qū)稱為一個復(fù)制區(qū)稱為一個復(fù)制子復(fù)制子(replicon) 。復(fù)制。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。子是獨立完成復(fù)制的功能單位。 53oriorioriori5353oriorioriori5355

6、33553復(fù)制復(fù)制3目錄目錄DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第第 二二 節(jié)節(jié)The Enzymology and Topology of DNA Replication目錄目錄n參與參與DNA復(fù)制的物質(zhì)復(fù)制的物質(zhì): 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，簡寫為簡寫為 DNA-pol； 模板模板(template): 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈；母鏈； 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次聚合；聚合；

7、其他的其他的酶和蛋白質(zhì)因子酶和蛋白質(zhì)因子。生成磷酸二酯鍵生成磷酸二酯鍵(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi目錄目錄n聚合反應(yīng)的特點聚合反應(yīng)的特點: : DNA 新鏈生成需新鏈生成需RNA引物引物和和模板模板； 新鏈的延長只可沿新鏈的延長只可沿5 3 方向進行。方向進行。目錄目錄一、一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合 全稱：全稱：依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 簡稱：簡稱：DNA-pol 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A

8、G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : 目錄目錄（一）原核生物有（一）原核生物有3種種DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目錄目錄原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死

9、性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞多亞基不對稱多亞基不對稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I目錄目錄個核心酶個核心酶1個個 -復(fù)合物（復(fù)合物（ 、 、

10、 、 、 、 6種亞種亞基）基）1對對 -亞基（可滑動亞基（可滑動的的DNA夾子）夾子）DNA聚合酶聚合酶全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：全酶結(jié)構(gòu)包括：目錄目錄n功能：功能： DNA-pol （109kD）對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)對復(fù)制中的錯誤進行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補。中出現(xiàn)的空隙進行填補。目錄目錄323個氨基酸個氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實驗室合成片段是

11、實驗室合成DNA，進行，進行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 目錄目錄 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活?；虬l(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 DNA-pol 對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生損傷的損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。DNA-pol（二）常見的真核細(xì)胞（二）常見的真核細(xì)胞DNA聚合酶有聚合酶有5種種目錄目錄二、二、DNA聚合酶的堿基選擇和校對功聚合酶的堿基選擇和校對

12、功能實現(xiàn)復(fù)制的保真性能實現(xiàn)復(fù)制的保真性 復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。準(zhǔn)確傳代的基本原理。 此外還需酶學(xué)的機制來保證復(fù)制的保真性。此外還需酶學(xué)的機制來保證復(fù)制的保真性。目錄目錄遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；復(fù)制出錯時有即時校對功能。復(fù)制出錯時有即時校對功能。nDNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制：復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制：目錄目錄目錄目錄目錄目錄三、復(fù)制中的解鏈伴有三、復(fù)制中的解鏈伴有DNA 分子分子拓?fù)鋵W(xué)變化拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿

13、基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。解成單鏈，它才能起模板作用。目錄目錄（一）多種酶參與（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)理順理順DNA鏈鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 (gyrA, B)穩(wěn)定已解開的單鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)運送和協(xié)同運送和協(xié)同DnaBDnaC (dnaC)解開解開DNA雙鏈雙鏈解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨認(rèn)起始點辨認(rèn)起始點DnaA (dnaA)蛋白質(zhì)（基因）蛋白質(zhì)（基因）通用名通用名功能功能原核生物復(fù)

14、制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)目錄目錄目錄目錄解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成目錄目錄目錄目錄目錄目錄POO-O-OHO5POO-O-O335DNA連接酶連接酶ATPADP53535、DNA連接酶連接復(fù)制中的單鏈缺口連接酶連接復(fù)制中的單鏈缺口nDNA連接酶的作用：連接酶的作用：目錄目錄 DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。作用。 在在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用?？谧饔?。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能：功能：目錄目錄目錄目錄原核生物原核生物DNA復(fù)制

15、過程復(fù)制過程The Process of DNA Replication in Prokaryotes第第 三三 節(jié)節(jié)目錄目錄起始是復(fù)制中較為復(fù)雜的環(huán)節(jié)，在此過程起始是復(fù)制中較為復(fù)雜的環(huán)節(jié)，在此過程中，各種酶和蛋白因子在復(fù)制起始點處裝配引中，各種酶和蛋白因子在復(fù)制起始點處裝配引發(fā)體，形成復(fù)制叉并合成發(fā)體，形成復(fù)制叉并合成RNARNA引物。引物。需要解決兩個問題：需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。2. 形成引發(fā)體，合成引物，提供形成引發(fā)體，合成引物，提供3 -OH末端。末端。一、一、復(fù)制的起始復(fù)制的起始E.coli復(fù)制起始點復(fù)制起始點 oriC 1 13

16、17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 -TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 5 3 （一）（一） DNA的解鏈的解鏈TTATCCACA目錄目錄原核生物的復(fù)制起始部位及解鏈原核生物的復(fù)制起始部位及解鏈 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 （二）引物合成和引發(fā)體形成（二）引物合成和引發(fā)體形成含有解螺旋酶（含有解螺旋酶（DnaB蛋白）、蛋白）、D

17、naC蛋白、引物蛋白、引物酶（酶（DnaG蛋白）和蛋白）和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為為引發(fā)體引發(fā)體。功能：解開成單鏈，生成引物。功能：解開成單鏈，生成引物。引發(fā)體引發(fā)體目錄目錄3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。分子。引物引物3 HO5引物引物酶酶目錄目錄引發(fā)體和復(fù)制叉的生成引發(fā)體和復(fù)制叉的生成目錄目錄二、二、DNA鏈的延長鏈的延長復(fù)制的延長指在復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。其化

18、學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目錄目錄n領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5 5 33 方向可以連續(xù)地延長。方向可以連續(xù)地延長。n后隨鏈的合成后隨鏈的合成目錄目錄 在復(fù)制叉同時合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈在復(fù)制叉同時合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈復(fù)復(fù)制制過過程程簡簡圖圖目錄目錄 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。處匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500三

19、、復(fù)制的終止三、復(fù)制的終止目錄目錄5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA連接酶連接酶n 子鏈中的子鏈中的RNA引物被取代引物被取代目錄目錄目錄目錄真核生物真核生物DNA生物合成生物合成過程過程The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes第第 四四 節(jié)節(jié)目錄目錄真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進速度慢等；前進速度慢等；DNA復(fù)制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生復(fù)制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生DNA聚聚合酶合酶 / 轉(zhuǎn)換；轉(zhuǎn)換；切除岡崎片段切除岡崎片段RNA引物的是

20、核酸酶引物的是核酸酶RNAse H和和FEN1等。等。 真核生物與原核生物真核生物與原核生物DNA復(fù)制的差異：復(fù)制的差異：目錄目錄哺乳動物的哺乳動物的細(xì)胞周期細(xì)胞周期DNA合成期合成期G1G2SM細(xì)胞能否分裂，決定于進入細(xì)胞能否分裂，決定于進入S期及期及M期這兩個關(guān)期這兩個關(guān)鍵點。鍵點。G1S及及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。性有關(guān)。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實施調(diào)控作用。而實施調(diào)控作用。 真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子復(fù)制。子復(fù)制。復(fù)制的起始需要復(fù)制的起始需要

21、DNA-pol （引物酶活性）和（引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子制因子(replication factor, RF)。 一、真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似一、真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似增殖細(xì)胞核抗原（增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在復(fù)制起始和延長中起關(guān)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。具有鍵作用。具有與與E.coli DNA 聚合酶聚合酶的的亞基相同亞基相同的的功能和相似的構(gòu)象。功能和相似的構(gòu)象。 DNA-pol 和和pol 分別兼有解螺旋酶和引物酶活分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，性。在復(fù)制叉及引物生

22、成后，DNA-pol 通過通過PCNA的協(xié)同作用，逐步取代的協(xié)同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物引物的的3 -OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNA協(xié)同，協(xié)同，pol 置換置換pol ，繼續(xù)合成，繼續(xù)合成DNA子鏈。子鏈。 二、二、真核生物復(fù)制的延長發(fā)生真核生物復(fù)制的延長發(fā)生DNA聚合酶聚合酶/轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換目錄目錄3 5 5 3 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈3 5 3 5 親代親代DNA后隨鏈后隨鏈引物引物核小體核小體三、真核生物三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體合成后立即組裝成核小體染色體染色體DNA呈線狀，復(fù)制

23、在末端停止。呈線狀，復(fù)制在末端停止。染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問題末端末端DNA序列序列5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目錄目錄n端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 目錄目錄真核所有染色體真核所有染色體DNA復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細(xì)胞復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細(xì)胞周期的周期的S期期，而且只能復(fù)制一次。，而且只能復(fù)制一次。五、真核生物染色體五、真核生物染色體DNA在每個細(xì)胞周在每個細(xì)胞周期中只能復(fù)制一次期中只能復(fù)制一次目錄目錄逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways第五節(jié)第五節(jié)目錄目錄 雙鏈雙鏈DNA是大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)。某些是大