百草枯急性中毒大鼠肺組織MDA、T-SOD、GSH水平及三七皂苷的干預(yù)作用

1、百草枯急性中毒大鼠肺組織MDA、T-SOD、GSH水平及三七皂苷的干預(yù)作用潘東峰 趙素琴 李政軍寧夏人民醫(yī)院急診科 750021摘要目的 觀察百草枯（PQ）急性中毒大鼠血漿、肺組織勻漿中丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽還原酶（GSH）水平，探討三七皂苷(PNS)對(duì)PQ中毒大鼠的抗氧化治療作用。方法：將54只SD大鼠隨機(jī)分為 3 組：Control組、PQ組、PQ+PNS組。PQ組、PQ+PNS組采用一次性灌胃構(gòu)建SD大鼠中毒模型，后者同時(shí)給予PNS預(yù)防性治療，采用化學(xué)比色法檢測(cè)肺勻漿中丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽還原酶(GSH)的含量。結(jié)

2、果：PQ組和PQ+PNS組血漿和肺勻漿中MDS高于Control組，T-SOD、GSH低于Control組(P<0.01)。PQ組與PQ+PNS組比較：PQ+PNS組中MDA含量在血漿和肺勻漿中均較PQ組降低（P<0.01）；PQ+PNS組血漿中T-SOD高于PQ組（P<0.01）；肺勻漿中T-SOD高于PQ組（P<0.05）；PQ+PNS組血漿和肺勻漿中GSH含量高于PQ組（P<0.05）。結(jié)論：三七皂苷可抑制由PQ誘導(dǎo)的過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)PQ中毒具有抗氧化治療作用。關(guān)鍵詞百草枯 MDA T-SOD GSH 三七皂苷 抗氧化The MDA, T-SOD, GSH l

3、evels in rat lung tissue of acute paraquat poisoning and notoginsenoside intervention study Pan Dongfeng Zhao Suqing lizhengjun Ningxia People's Hospital Emergency Department 750021Abstract Objective To observe the malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione reductase (GS

4、H) levels in rat plasma and lung homogenates of acute paraquat (PQ) poisoning,explore Panax notoginseng saponins on the role of antioxidant treatment to PQ poisoning rats. Methods: 54 SD rats were randomly divided into three groups: Control group、 PQ group and PQ + PNS group. PQ group and PQ + PNS g

5、roup with disposable gavage to build the SD rat poisoning model, the latter at the same time give PNS preventive treatment, the chemical colorimetric assay in lung homogenates of malondialdehyde (MDA), total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione reductase (GSH) content. Results: The MDS in th

6、e plasma and lung homogenates of the PQ group and PQ + PNS group than Control group, the T-SOD and GSH lower than the Control group (P <0.01). PQ group and PQ + PNS group: PQ + PNS group content of MDA in plasma and lung homogenates compared with PQ group lower (P <0.01); PQ + PNS group, the p

7、lasma T-SOD higher than the PQ group (P <0.01); T-SOD in the lung homogenate higher than the PQ group (P <0.05); GSH content higher than the PQ group (P <0.05) in plasma and lung homogenate of the PQ + PNS group. Conclusion: notoginsenoside inhibit PQ-induced peroxidation,have antioxidant t

8、reatment to PQ poisoning.Key words paraquat MDA T-SOD GSH antioxidant notoginsenoside百草枯（paraquat）, 為速效觸殺型滅生性除草劑，對(duì)人、畜有很強(qiáng)的毒性作用。由于其價(jià)廉效優(yōu)，應(yīng)用面廣、人群接觸面寬，加之人們對(duì)其危害認(rèn)識(shí)不足，中毒病例并不罕見(jiàn)。人類(lèi)中毒的突出表現(xiàn)是以急性化學(xué)性肺間質(zhì)病變及迅速發(fā)展的肺間質(zhì)纖維化為主的多臟器損害或衰竭。因無(wú)特效解毒藥，中毒后死亡率高。三七皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）臨床上多用于心腦血管疾病，但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其有抗氧化和抗纖維化作用，本實(shí)驗(yàn)

9、將通過(guò)建立急性百草枯中毒大鼠模型，研究PNS對(duì)百草枯急性中毒大鼠是否具有抗氧化治療的作用，為臨床治療急性百草枯中毒提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。，1、 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠54只(200±30)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。百草枯水劑（鄭州先利達(dá)化工有限公司生產(chǎn)），劑量200g/升，三七皂苷注射液（哈爾濱圣泰制藥股份有限公司生產(chǎn)）劑量70mg2ml。MDA、SOD、GSH-Px檢測(cè)試劑盒由南京建成生物研究所提供。1.2 動(dòng)物分組及模型制備54只大鼠依照隨機(jī)化數(shù)字表隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(Control組)6只、百草枯染毒組(P

10、araquat，PQ組)24只、百草枯+三七皂苷治療組(Paraquat+ Panax notoginseng saponins，PQ+PNS組)24只。后兩組大鼠按觀察時(shí)點(diǎn)6h、1d、3d、7d隨機(jī)又分成四個(gè)亞組，每亞組6只。各組大鼠均自由飲水進(jìn)食，12 h晝夜規(guī)律，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。Control組：每日給予生理鹽水（NS，4 ml/kg）腹腔注射； PQ組：于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始一次性PQ(80mgkg)灌胃染毒，后每日予以生理鹽水（NS，4 ml/kg）腹腔注射；PQ+PNS組：于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始一次性PQ(80mgkg)灌胃染毒，灌胃后2小時(shí)，予以三七皂苷(PNS，lOOmgkg) 腹腔注射干預(yù)

11、，且同劑量PNS每日一次。各組均標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，直至處死。1.3 標(biāo)本采集給藥后觀察大鼠呼吸、動(dòng)作及精神狀態(tài)等。Control組在實(shí)驗(yàn)第3d、PQ組和PQ+PNS組在染毒后第6h、1d、3d、7d分別取6只各組大鼠用水合氯醛(03 mlloog)麻醉后下腔靜脈采血，低溫離心，留取血漿。取各組大鼠左上肺行HE染色進(jìn)行病理觀察、左下肺2戊二醛固定后行電鏡檢查、右肺組織在低溫條件下，按常規(guī)方法制作肺組織勻漿，（肺質(zhì)量(g)生理鹽水(ml)=19，4 3000rmin離心10 min后取上清，放入一20冰箱中保存待測(cè)）。14 檢測(cè)指標(biāo) 采用化學(xué)比色法檢測(cè)血漿和肺勻漿中丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-

12、SOD）和谷胱甘肽還原酶（GSH）含量。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析后Dunnett-t檢驗(yàn)和LSD-t檢驗(yàn)比較各組間差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均設(shè)=005，以P<005表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2 結(jié)果2.1中毒大鼠行為表現(xiàn)PQ組大鼠于染毒20min后出現(xiàn)煩躁，lh后精神萎靡、少動(dòng)、厭食，45h后出現(xiàn)呼吸急促等表現(xiàn)，癥狀持續(xù)加重，24h左右癥狀最為明顯，3d后大鼠精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)、開(kāi)始進(jìn)食、呼吸困難等癥狀緩解，7d時(shí)大部分大鼠中毒癥狀明顯減輕，進(jìn)食正常，無(wú)明顯呼吸困難等，但仍有個(gè)別大鼠精

13、神萎靡、呼吸欠佳。PQ+PNS組大鼠精神、進(jìn)食狀態(tài)好于PQ組、呼吸困難等癥狀明顯輕于PQ組，7d后基本恢復(fù)正常。2.2 中毒大鼠肺組織病理改變PQ組大鼠6h后即出現(xiàn)肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,大量以中性白細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)見(jiàn)少量紅細(xì)胞滲出、1d及3d肺泡及肺血管充血水腫達(dá)到高峰，肺泡腔見(jiàn)紅細(xì)胞滲出較前增多，肺間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，7d時(shí)肺炎性細(xì)胞、充血等減輕。PQ+PNS組亦出現(xiàn)了肺炎性細(xì)胞、肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹等上述表現(xiàn)，但程度明顯減輕。HE染色如圖1、圖2。電鏡下PQ組大鼠肺組織上皮細(xì)胞核固縮，板層小體空泡化，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，PN+PNS組上述改變明顯減

14、輕。圖1 PQ組大鼠1d肺組織（HE×200） 圖2 PQ+PNS組大鼠1d肺組織（HE×200）2.3 各組大鼠血漿和肺勻漿中MDA、SOD、GSH含量變化PQ組、PQ+PNS組大鼠血漿及肺勻漿中MDA、T-SOD、GSH含量與Control組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），MDA在血漿和肺勻漿中含量升高，而T-SOD、GSH在血漿和肺勻漿中含量降低。PQ組和PQ+PNS組相比，血漿和肺勻漿中MDA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），PQ+PNS組MDA含量較PQ組升高；血漿中T-SOD差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；肺勻漿中T-SOD差異

15、有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05），PQ+PNS組血漿和肺勻漿中T-SOD高于PQ組；血漿和肺勻漿中GSH含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），PQ+PNS組血漿和肺勻漿中GSH高于PQ組。結(jié)果見(jiàn)表1表1 三組大鼠血漿和肺勻漿中MDA、SOD、GSH含量比較(,n=6)組別MDA（nmol/ml）T-SOD（U/ml）GSH（mg/l）血漿肺勻漿血漿肺勻漿血漿肺勻漿Control組6.26±0.1217.47±0.4253.67±8.3845.67±9.43763.33±16.08623.83±12.40PQ組8.35±

16、0.74*29.20±7.83*27.83±+.96*23.42±8.12*703.42±25.03*593.46±17.54*PQ+PNS組7.13±0.21*24.71±5.91*41.63±5.30*29.89±7.17*735.79±17.79*604.75±18.54*F55.00543.69235.00214.21925.277.757P0.0000.0000.0000.0000.0000.001注：與Control組比較 *：P<0.05 *P<0.01 PQ

17、組與PQ+PNS組比較 ：P<0.05;:P<0.012.4 不同時(shí)點(diǎn)大鼠血漿和肺勻漿中MDA、SOD、GSH含量變化2.4.1 MDA水平血漿和肺勻漿中MDA均呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，在第一天其含量達(dá)到峰值。PQ+PNS組的MDA含量在血漿和肺勻漿中均低于PQ組。 圖1 不同時(shí)點(diǎn)大鼠血漿和肺勻漿中MDA變化趨勢(shì)2.4.2 T-SOD水平血漿和肺勻漿中T-SOD水平呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)，在第一天其含量達(dá)到峰值。PQ+PNS組的T-SOD含量在血漿和肺勻漿中均高于PQ組。圖2 不同時(shí)點(diǎn)大鼠血漿和肺勻漿中T-SOD變化趨勢(shì)2.4.3 GSH水平血漿和肺勻漿中GSH水平呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)，在第三天其

18、含量達(dá)到最低谷。PQ+PNS組的GSH含量在血漿和肺勻漿中均高于PQ組。 圖3 不同時(shí)點(diǎn)大鼠血漿和肺勻漿中GSH變化趨勢(shì)3 討論百草枯中毒后可引起多臟器功能衰竭，大劑量、多臟器功能衰竭可導(dǎo)致患者很快死亡。研究顯示1百草枯中毒后在肺、腎中較高，在腦組織中較低但存在時(shí)間較長(zhǎng)且百草枯在肺內(nèi)完全消除后，肺損傷仍可繼續(xù)發(fā)展,說(shuō)明百草枯中毒的主要靶器官為肺。在中等劑量下，最初肺部表現(xiàn)為對(duì)損傷的修復(fù)，后轉(zhuǎn)化為纖維化過(guò)程。目前百草枯中毒的機(jī)制尚不完全清楚。多認(rèn)為百草枯主要是通過(guò)自由基（ROS）產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)中毒機(jī)體發(fā)生作用。ROS是機(jī)體生化反應(yīng)的瞬間產(chǎn)物，在正常的生理情況下，機(jī)體存在有效的抗氧化防御體系

19、，這使得自由基的產(chǎn)生與清除之間處于動(dòng)態(tài)平衡，從而阻止機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，進(jìn)而達(dá)到防御外來(lái)化學(xué)物對(duì)機(jī)體的損傷的目的。但當(dāng) ROS產(chǎn)生過(guò)多或/和機(jī)體的抗氧化能力下降 ,ROS引起的氧化應(yīng)激就會(huì)發(fā)生 ,導(dǎo)致組織和細(xì)胞一系列的損害。超氧化物歧化酶(SOD) 、 谷胱甘肽( GSH)是機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御體系中重要的抗氧化酶，它們能清除體內(nèi)多種有毒性或氧化性物質(zhì)，從而消除這些物質(zhì)對(duì)DNA及生物功能蛋白的破壞。以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，起到抗毒、抗氧化的作用2、3。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要終產(chǎn)物之一，反映了組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明4、5，百草枯進(jìn)入機(jī)體后作用于細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，生成氧

20、自由基，消耗NADPH及其他還原物。氧自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，直接損害細(xì)胞膜的主要成分，致膜流動(dòng)性降低，通透性增大、脆性增加，功能下降，NADPH大量減少使細(xì)胞難以維持生理功能，對(duì)自由基所致的損傷更加敏感 。本研究證實(shí)，經(jīng)一次性灌毒的大鼠較正常NS對(duì)照組機(jī)體內(nèi)MDA升高，SOD和GRS降低，MDA、SOD在中毒后第1天表現(xiàn)為毒性峰值，GRS在中毒后第三天后為最低值，后又逐漸逐漸恢復(fù)，到第七天仍維持在較高水平，提示染毒大鼠在注入PQ后機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡被打破，機(jī)體因脂質(zhì)過(guò)氧化作用而受到損害。臨床上對(duì)PQ中毒患者的治療主要為對(duì)癥支持和血液灌流等，其療效不佳。如何對(duì)抗PQ中毒后的氧化應(yīng)激

21、也許會(huì)成為臨床治療PQ的新途徑，目前已有眾多學(xué)者對(duì)各種抗氧化劑進(jìn)行研究，其中發(fā)現(xiàn) “三七總皂苷”可提高血清超氧化物歧化酶(SOD)，還原型谷胱甘肽(GSH)水平，從而讓身體整個(gè)機(jī)能具有較強(qiáng)的抗自由基、抗氧化作用6。本次研究證實(shí)，經(jīng)PNS治療后，大鼠體內(nèi)MDA減少，SOD增多，提示了PNS具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，同時(shí)也可以保護(hù)機(jī)體免受脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷。病理表現(xiàn)同樣證實(shí)PNS可有效改善肺充血、水腫及炎細(xì)胞的擴(kuò)散。 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：三七皂苷能通過(guò)上調(diào)抗氧化物GSH 和T-SOD的含量，對(duì)抗PQ中毒后的脂質(zhì)過(guò)氧化損害，起到治療作用。參考文獻(xiàn) 1趙波,菅向東,張忠臣等. 百草枯染毒大鼠組織中毒物含量與臟器損傷的關(guān)系J. 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志,2010,28(3):5658.2Itoh K，lshii T,Wakabayashi N，et a1Regulatory mechanisms of cellar response to oxidativ