第八章吸光光度法

1、第第 八八 章章 吸吸 光光 光光 度度 法法 吸光光度法吸光光度法是基于物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收而建是基于物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收而建立的一種分析方法。立的一種分析方法。可見(jiàn)分光光度法可見(jiàn)分光光度法Visible Spectrophotometry特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高靈敏度高，微量、痕，微量、痕量組分（量組分（10-4-10-5%）；）；準(zhǔn)確準(zhǔn)確度高度高，2%-5%。知識(shí)點(diǎn)：知識(shí)點(diǎn)：1 單色光單色光 復(fù)合光復(fù)合光 互補(bǔ)光互補(bǔ)光2 吸收曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線吸收曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線3 吸光度、透光率及其關(guān)系吸光度、透光率及其關(guān)系 4 朗伯朗伯-比爾定律的應(yīng)用（計(jì)算）比爾定律的應(yīng)用（計(jì)算）5 分光光度計(jì)的基本

2、組成部件分光光度計(jì)的基本組成部件6 吸光光度法的靈敏度吸光光度法的靈敏度-摩爾吸光系數(shù)及其計(jì)算摩爾吸光系數(shù)及其計(jì)算7 影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的因素（了解）影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的因素（了解）8 顯色反應(yīng)和測(cè)定條件的選擇（了解）顯色反應(yīng)和測(cè)定條件的選擇（了解）8.1 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)之所以呈現(xiàn)五彩繽紛的不同顏色，就是因?yàn)槲镔|(zhì)之所以呈現(xiàn)五彩繽紛的不同顏色，就是因?yàn)檫x擇性地吸收了某些特定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光所致。例選擇性地吸收了某些特定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光所致。例如：高錳酸鉀為紫色；重鉻酸鉀為橙色。如：高錳酸鉀為紫色；重鉻酸鉀為橙色。有色溶液顏色的深淺，與有色物質(zhì)的濃度成正比。有色溶液顏色的深淺

3、，與有色物質(zhì)的濃度成正比。光是電磁波中的一個(gè)很小波段。光是電磁波中的一個(gè)很小波段。紫外光紫外光：（：（10-400nm）可見(jiàn)光：（可見(jiàn)光：（400-760nm）紅外光紅外光 ： (0.76-300um)單色光：?jiǎn)紊猓簡(jiǎn)我徊ㄩL(zhǎng)的光。單一波長(zhǎng)的光。復(fù)合光：復(fù)合光：由不同波長(zhǎng)的光組合而成。由不同波長(zhǎng)的光組合而成。在可見(jiàn)光區(qū)：在可見(jiàn)光區(qū)：互補(bǔ)光：互補(bǔ)光：兩種特定的色光按一定比例混合得到兩種特定的色光按一定比例混合得到 白光。白光。物質(zhì)顏色與吸收光波長(zhǎng)的關(guān)系物質(zhì)顏色與吸收光波長(zhǎng)的關(guān)系物質(zhì)顏色物質(zhì)顏色吸收光吸收光波長(zhǎng)波長(zhǎng) / nm物質(zhì)顏色物質(zhì)顏色吸收光吸收光波長(zhǎng)波長(zhǎng) / nm黃綠黃綠400450（紫）（

4、紫）紫紫560580（黃（黃 綠）綠）黃黃450480（藍(lán)）（藍(lán)）藍(lán)藍(lán)580610（黃）（黃）橙橙480490（綠（綠 藍(lán)）藍(lán)）綠藍(lán)綠藍(lán)610650（橙）（橙）紅紅490500（藍(lán)（藍(lán) 綠）綠）藍(lán)綠藍(lán)綠650760（紅）（紅）紫紅紫紅500560（綠）（綠） 將不同波長(zhǎng)的光通過(guò)某一將不同波長(zhǎng)的光通過(guò)某一固定厚度固定厚度和和濃度濃度的有的有色溶液，測(cè)量吸光度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為色溶液，測(cè)量吸光度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作圖得到縱坐標(biāo)，作圖得到吸收曲線吸收曲線。吸收曲線吸收曲線最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)用用max表示表示高錳酸鉀溶液濃度不高錳酸鉀溶液濃度不同，同，最大吸收波長(zhǎng)不變，最

5、大吸收波長(zhǎng)不變，都是都是525nm。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度，靈敏度最高靈敏度最高。高錳酸鉀溶液吸收曲線高錳酸鉀溶液吸收曲線8.2 朗伯朗伯-比爾定律比爾定律 被溶液被溶液吸收的吸收的光的強(qiáng)光的強(qiáng)度為度為Iabcm I0入射光入射光透射光透射光 It界面界面反射反射損失損失Ir一束一束平行單色光平行單色光通過(guò)有色溶液通過(guò)有色溶液0atrIIII=+0atIII=+Abc為摩爾吸光系數(shù)，單位為為摩爾吸光系數(shù)，單位為L(zhǎng)/molcm ； b為液層厚度，單位用為液層厚度，單位用cm表示；表示； c為有色溶液的濃度，單位用為有色溶液的濃度，單位用mol/L表示。表示。朗伯朗

6、伯- -比爾定律比爾定律 為摩爾吸光系數(shù)為摩爾吸光系數(shù)，顯色反應(yīng)的，顯色反應(yīng)的靈敏度靈敏度，越大表示越大表示該顯色物質(zhì)對(duì)此波長(zhǎng)的光吸收能力越強(qiáng)，顯色反應(yīng)該顯色物質(zhì)對(duì)此波長(zhǎng)的光吸收能力越強(qiáng)，顯色反應(yīng)越靈敏。越靈敏。 的物理意義的物理意義：吸光物質(zhì)濃度為：吸光物質(zhì)濃度為1mol/L，比色皿厚度，比色皿厚度為為1cm，以一定波長(zhǎng)的光通過(guò)時(shí)，所引起的吸光度。，以一定波長(zhǎng)的光通過(guò)時(shí)，所引起的吸光度。測(cè)定方法測(cè)定方法1 比較法（單點(diǎn)）比較法（單點(diǎn)）標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液 cs As As=bcs待測(cè)溶液待測(cè)溶液 cx Ax Ax=bcx 比較比較 得得xxssAccA2 工作曲線工作曲線法法配制一系列已知準(zhǔn)確濃

7、度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：配制一系列已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液：c1 c2 c3 c4 cn 測(cè)得吸光度值：測(cè)得吸光度值： A1 A2 A3 A4 An以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作工作曲線。以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作工作曲線。c(g/25ml) 測(cè)得未知試樣的吸光度測(cè)得未知試樣的吸光度Ax，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出其，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出其對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)應(yīng)的濃度cx。c(g/25ml)6.3 曲線擬合曲線擬合 根據(jù)最小二乘法，利用一系列的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)最小二乘法，利用一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及吸光度值計(jì)算出工作曲線的斜率和截距，溶液的濃度及吸光度值計(jì)算出工作曲線的斜率和截距，計(jì)算出未知樣的濃度。計(jì)算出未知樣的濃度。(

8、 )( )yaxbAcxxAbca 8.5 吸光光度分析的方法和儀器吸光光度分析的方法和儀器1 目視比色法目視比色法 吸光光度分析的方法吸光光度分析的方法2 光電比色法光電比色法 光電比色法是利用光電比色法是利用光電比色計(jì)光電比色計(jì)測(cè)定溶液的吸光測(cè)定溶液的吸光度以進(jìn)行定量分析的方法。度以進(jìn)行定量分析的方法。 光電比色計(jì)利用光電比色計(jì)利用濾光片濾光片獲得入射光。獲得入射光。 借助借助光電池和檢流計(jì)光電池和檢流計(jì)測(cè)得吸光度。測(cè)得吸光度。3 分光光度法分光光度法 可見(jiàn)光分光光度法的測(cè)定方法和原理與光電比可見(jiàn)光分光光度法的測(cè)定方法和原理與光電比色法相同，但獲得單色光的方法不同。色法相同，但獲得單色光的

9、方法不同。 光電比色法：濾光片光電比色法：濾光片 分光光度法：分光光度法：棱鏡、光柵棱鏡、光柵 分光光度法采用的儀器是分光光度法采用的儀器是分光光度計(jì)分光光度計(jì)。 分光光度計(jì)的主要組成部件分光光度計(jì)的主要組成部件光光 源源 單色器單色器 吸收池吸收池 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng) （1）光源）光源要求：發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，由足要求：發(fā)出所需波長(zhǎng)范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，由足夠強(qiáng)度且在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。夠強(qiáng)度且在一定時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。 常用：鎢絲燈、鎢鹵素?zé)舫Ｓ茫烘u絲燈、鎢鹵素?zé)簦?）單色器）單色器將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的裝置，稱為單色器。稱為單色器。 單

10、色器由棱鏡或光柵燈色散元件及狹縫和透鏡單色器由棱鏡或光柵燈色散元件及狹縫和透鏡組成。組成。（3）吸收池）吸收池 也叫比色皿也叫比色皿, 用于盛裝參比溶液和待測(cè)溶液，能用于盛裝參比溶液和待測(cè)溶液，能透過(guò)所需光譜范圍內(nèi)的光線。透過(guò)所需光譜范圍內(nèi)的光線。（4）檢測(cè)系統(tǒng)）檢測(cè)系統(tǒng) 檢測(cè)器檢測(cè)器 將透射光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)進(jìn)行測(cè)量的將透射光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)進(jìn)行測(cè)量的裝置。光電管（靈敏度高、不易疲勞）。裝置。光電管（靈敏度高、不易疲勞）。 指示器指示器 把放大的信號(hào)以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或記錄把放大的信號(hào)以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或記錄下來(lái)。和檢測(cè)器一起組成檢測(cè)系統(tǒng)。下來(lái)。和檢測(cè)器一起組成檢測(cè)系統(tǒng)。 8.3 吸光光度法的靈

11、敏度與準(zhǔn)確度吸光光度法的靈敏度與準(zhǔn)確度靈敏度的表示靈敏度的表示-摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù) 例例 0.0880mg Fe3+在酸性溶液中，以硫氰酸鉀顯色在酸性溶液中，以硫氰酸鉀顯色后，用水稀釋到后，用水稀釋到50.00ml，在，在480nm處用處用1cm比色皿比色皿測(cè)得吸光度測(cè)得吸光度A為為0.220，計(jì)算該顯色反應(yīng)的摩爾吸光，計(jì)算該顯色反應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)。系數(shù)。 解解3350.0880 10()3.15 10/55.85 0.0500c Femol L50.2206981 /1 3.15 10AL mol cmbc3+（Fe ）影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的因素影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的因素1 儀器的測(cè)量誤差

12、及其減免方法儀器的測(cè)量誤差及其減免方法透光率透光率T與待測(cè)與待測(cè)物濃度物濃度c是負(fù)對(duì)是負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系數(shù)關(guān)系透光率讀數(shù)誤差透光率讀數(shù)誤差T相同，但所相同，但所造成的濃度誤差造成的濃度誤差卻不一樣。卻不一樣。誤差最小時(shí)誤差最小時(shí) T=36.8%, A=0.434誤差誤差5% A為為0.20.8測(cè)量的相對(duì)誤差與透光率、吸光度的關(guān)系測(cè)量的相對(duì)誤差與透光率、吸光度的關(guān)系 溶液濃度較高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成直線的現(xiàn)溶液濃度較高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成直線的現(xiàn)象，稱為偏離比耳定律。象，稱為偏離比耳定律。偏離原因：偏離原因： （1）非單色光）非單色光引起的偏離；引起的偏離； （2）化學(xué)因素）化學(xué)因素引起的偏離。引起

13、的偏離。2 對(duì)比爾定律的偏離引起的誤差對(duì)比爾定律的偏離引起的誤差(1) 顯色反應(yīng)及其選擇顯色反應(yīng)及其選擇 將待測(cè)組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫做顯色反應(yīng)。將待測(cè)組分轉(zhuǎn)變成有色化合物的反應(yīng)叫做顯色反應(yīng)。 與待測(cè)組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。與待測(cè)組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。 選擇顯色劑應(yīng)考慮的因素：選擇顯色劑應(yīng)考慮的因素： 靈敏度高：一般希望靈敏度高：一般希望 達(dá)到達(dá)到104 105 選擇性好：其它離子干擾少選擇性好：其它離子干擾少 顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收 反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。 8.

14、4 顯色反應(yīng)及其影響因素顯色反應(yīng)及其影響因素?zé)o機(jī)顯色劑無(wú)機(jī)顯色劑 種類(lèi)不多，主要有硫氰酸鹽、鉬酸銨等。種類(lèi)不多，主要有硫氰酸鹽、鉬酸銨等。有機(jī)顯色劑有機(jī)顯色劑 有機(jī)顯色劑種類(lèi)很多，主要可分為：有機(jī)顯色劑種類(lèi)很多，主要可分為： 偶氮類(lèi)顯色劑偶氮類(lèi)顯色劑 如偶氮胂如偶氮胂 三苯甲烷類(lèi)顯色劑三苯甲烷類(lèi)顯色劑 如結(jié)晶紫如結(jié)晶紫 其它有機(jī)顯色劑其它有機(jī)顯色劑 如丁二酮肟如丁二酮肟顯色劑用量顯色劑用量反應(yīng)體系的酸度反應(yīng)體系的酸度顯色反應(yīng)的溫度顯色反應(yīng)的溫度顯色反應(yīng)的時(shí)間顯色反應(yīng)的時(shí)間干擾的消除干擾的消除顯色反應(yīng)條件的選擇顯色反應(yīng)條件的選擇加入配位掩蔽劑或氧化還原掩蔽劑加入配位掩蔽劑或氧化還原掩蔽劑控制溶液

15、酸度控制溶液酸度 選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng) 選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤?。選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤?。?）吸光度測(cè)量條件的選擇）吸光度測(cè)量條件的選擇 入射光波長(zhǎng)的選擇入射光波長(zhǎng)的選擇 入射光的波長(zhǎng)根據(jù)入射光的波長(zhǎng)根據(jù)吸收光譜吸收光譜選擇，選擇的原則選擇，選擇的原則是是吸收最大，干擾最小吸收最大，干擾最小。 一般情況下選擇被測(cè)溶液的一般情況下選擇被測(cè)溶液的最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)為入為入射光波長(zhǎng)。這樣測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度都較高。射光波長(zhǎng)。這樣測(cè)定的靈敏度和準(zhǔn)確度都較高。 如果干擾物質(zhì)在最大吸收波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的吸收，如果干擾物質(zhì)在最大吸收波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的吸收，則可選其它波長(zhǎng)，但要注意盡可能選擇值隨波長(zhǎng)改則可選其它

16、波長(zhǎng)，但要注意盡可能選擇值隨波長(zhǎng)改變而變化不太大的范圍內(nèi)的波長(zhǎng)。變而變化不太大的范圍內(nèi)的波長(zhǎng)。 最大吸收波長(zhǎng)處有干擾時(shí)，可選擇其它一最大吸收波長(zhǎng)處有干擾時(shí)，可選擇其它一處合適的波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定。處合適的波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定。參比溶液的選擇參比溶液的選擇 在吸光度測(cè)量中，將發(fā)生反射、吸收和透射等在吸光度測(cè)量中，將發(fā)生反射、吸收和透射等作用，由于反射以及溶劑、試劑等對(duì)光的吸收會(huì)造作用，由于反射以及溶劑、試劑等對(duì)光的吸收會(huì)造成透射光的減弱，為使光強(qiáng)度減弱僅與溶液中待測(cè)成透射光的減弱，為使光強(qiáng)度減弱僅與溶液中待測(cè)物質(zhì)的濃度有關(guān)，必須進(jìn)行校正。物質(zhì)的濃度有關(guān)，必須進(jìn)行校正。 校正方法：采用光學(xué)性質(zhì)完全相同、厚度相同校正

17、方法：采用光學(xué)性質(zhì)完全相同、厚度相同的比色皿貯放參比溶液，調(diào)節(jié)儀器使透過(guò)參比皿的的比色皿貯放參比溶液，調(diào)節(jié)儀器使透過(guò)參比皿的吸光度為零。吸光度為零。 參比溶液的選擇方法：參比溶液的選擇方法： （1）如果僅所測(cè)物質(zhì)有吸收，其它試劑均無(wú)吸收，）如果僅所測(cè)物質(zhì)有吸收，其它試劑均無(wú)吸收，則可用純?nèi)軇┳鰠⒈热芤?；則可用純?nèi)軇┳鰠⒈热芤海?（2）如果顯色劑或其它試劑略有吸收，應(yīng)用空白）如果顯色劑或其它試劑略有吸收，應(yīng)用空白溶液（不加試樣溶液）做參比溶液；溶液（不加試樣溶液）做參比溶液； （3）如果試樣中其它組分有吸收，但不與顯色劑）如果試樣中其它組分有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)，則當(dāng)顯色劑無(wú)吸收時(shí)，可用試樣溶液做參比溶反應(yīng)，則當(dāng)顯色劑無(wú)吸收時(shí)，可用試樣溶液做參比溶液；當(dāng)顯色劑