微生物鑒定技術(shù)在藥品檢驗及監(jiān)管中的應(yīng)用

1、上海市食品藥品檢驗所上海市食品藥品檢驗所2021年年5月月27徐徐 偉偉 東東微生物鑒定技術(shù)在藥品檢驗微生物鑒定技術(shù)在藥品檢驗和監(jiān)管中的應(yīng)用和監(jiān)管中的應(yīng)用微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二二樣品微生物的鑒定及同源性分析樣品微生物的鑒定及同源性分析三三微生物實驗室能力建設(shè)微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用微生物新技術(shù)的應(yīng)用四四微生物污染監(jiān)管方式的思考微生物污染監(jiān)管方式的思考五五背景介紹背景介紹一一一、背景介紹一、背景介紹v 在在1993-1998年間，美國年間，美國FDA報告的由微生物污染引起的召報告的由微生物污染引起的召回案件到達(dá)回案件到達(dá)1370件，占所有產(chǎn)品召回案件的件

2、，占所有產(chǎn)品召回案件的36%v 我國藥品微生物污染的調(diào)查數(shù)據(jù)較少，但微生物污染仍居首位，我國藥品微生物污染的調(diào)查數(shù)據(jù)較少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龍江完達(dá)山刺五加注射液受微生物污染的問題，近期披露的黑龍江完達(dá)山刺五加注射液受微生物污染的問題，已經(jīng)造成了十分嚴(yán)重后果和無法挽回的損失。已經(jīng)造成了十分嚴(yán)重后果和無法挽回的損失。v 藥品平安管理仍存在監(jiān)管漏洞，造成定性難、溯源難、應(yīng)變慢藥品平安管理仍存在監(jiān)管漏洞，造成定性難、溯源難、應(yīng)變慢等問題，以及新的致病微生物或變異體的出現(xiàn)，導(dǎo)致藥品受到等問題，以及新的致病微生物或變異體的出現(xiàn)，導(dǎo)致藥品受到微生物污染微生物污染v 我國各大城市不斷承辦國際

3、大型體育賽事和國際會議尤其是我國各大城市不斷承辦國際大型體育賽事和國際會議尤其是2021年在我國召開的上海世界博覽會，也進一步增強了對藥年在我國召開的上海世界博覽會，也進一步增強了對藥品的監(jiān)督管理水平的要求。品的監(jiān)督管理水平的要求。 對微生物分類水平較低，只能鑒定對微生物分類水平較低，只能鑒定到到“屬，鑒定微生物種類有限屬，鑒定微生物種類有限傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限分子方法分子方法v 分子生物學(xué)技術(shù)研究的是分子生物學(xué)技術(shù)研究的是微生物微生物DNA序列信息，常序列信息，常用于細(xì)菌分類的用于細(xì)菌分類的16S r DNA也有也有1500個堿基，個堿基，每個堿基位置由每個堿基位

4、置由ATGC四四種核苷酸中的一種組成，種核苷酸中的一種組成，多樣性可達(dá)種可能約多樣性可達(dá)種可能約10900。v 新版的新版的?伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊手冊?微生物微生物DNA變異信變異信息為主息為主 傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法v 人類的土壤微生物已到達(dá)人類的土壤微生物已到達(dá)10萬種萬種 v 現(xiàn)在常用的微生物鑒定用生現(xiàn)在常用的微生物鑒定用生化反響只有化反響只有20多種，實際多種，實際經(jīng)過研究形成一致標(biāo)準(zhǔn)的、經(jīng)過研究形成一致標(biāo)準(zhǔn)的、有意義的生化鑒定結(jié)果僅有意義的生化鑒定結(jié)果僅2000多種。多種。 v 微生物生化鑒定金標(biāo)準(zhǔn)的微生物生化鑒定金標(biāo)準(zhǔn)的API鑒定系統(tǒng)鑒定系統(tǒng)僅能鑒定僅能鑒定550種細(xì)菌種

5、細(xì)菌v 通過碳源利用進行微生物鑒通過碳源利用進行微生物鑒定的定的Biolog系統(tǒng)也僅能鑒系統(tǒng)也僅能鑒定定2000種微生物種微生物 微生物變異能力強，生化反響準(zhǔn)確微生物變異能力強，生化反響準(zhǔn)確度不高，錯檢漏檢現(xiàn)象普遍度不高，錯檢漏檢現(xiàn)象普遍傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限v 生化反響鑒定主要是利用不同微生物自身所特有的生化反響鑒定主要是利用不同微生物自身所特有的不同酶系統(tǒng)，根據(jù)微生物利用分解底物的種類和營不同酶系統(tǒng)，根據(jù)微生物利用分解底物的種類和營養(yǎng)來源進行分類鑒定。在大多數(shù)情況下，同養(yǎng)來源進行分類鑒定。在大多數(shù)情況下，同“屬屬微生物的酶系統(tǒng)根本相同，可以到達(dá)鑒定的目的微微生物的

6、酶系統(tǒng)根本相同，可以到達(dá)鑒定的目的微生物生物DNA突變能力強，如果這些突變點涉及到微生突變能力強，如果這些突變點涉及到微生物酶系統(tǒng)的表達(dá)，就會造成酶活性降低甚至酶缺陷，物酶系統(tǒng)的表達(dá)，就會造成酶活性降低甚至酶缺陷，導(dǎo)致鑒定失敗導(dǎo)致鑒定失敗 v 在現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中，只有血漿凝固酶陽性反響才會在現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中，只有血漿凝固酶陽性反響才會被確證為金黃色葡萄球菌陽性，陰性反響的微生物被確證為金黃色葡萄球菌陽性，陰性反響的微生物那么被作為無害菌處理。然而，近幾年引起高度關(guān)那么被作為無害菌處理。然而，近幾年引起高度關(guān)注的血漿凝固酶陰性金黃色葡萄球菌的流行使得金注的血漿凝固酶陰性金黃色葡萄球菌的流行使得金黃色

7、葡萄球菌被漏檢，血漿凝固酶陰性金黃色葡萄黃色葡萄球菌被漏檢，血漿凝固酶陰性金黃色葡萄球菌往往含有腸毒素和其他毒素，是引起醫(yī)院感染、球菌往往含有腸毒素和其他毒素，是引起醫(yī)院感染、社區(qū)食物中毒的重要污染源。社區(qū)食物中毒的重要污染源。 不能對微生物污染進行準(zhǔn)確溯源分析不能對微生物污染進行準(zhǔn)確溯源分析傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限v 在進化過程中生物在進化過程中生物DNA分子會形成大量分子會形成大量DNA多態(tài)性多態(tài)性區(qū)域和非編碼區(qū)域和非編碼DNA序列。序列。 不會造成生物種屬歸類爭議不會造成生物種屬歸類爭議 也不會造成任何形態(tài)上或酶系統(tǒng)表達(dá)的改變也不會造成任何形態(tài)上或酶系統(tǒng)表達(dá)的改變

8、 通過生化鑒定方法無法對這類變化進行有效的分析通過生化鑒定方法無法對這類變化進行有效的分析DNA位點變化卻包含大量重要的微生物所獨有的進位點變化卻包含大量重要的微生物所獨有的進化信息，可以與其他來源的同種微生物相區(qū)別，也是化信息，可以與其他來源的同種微生物相區(qū)別，也是微生物種內(nèi)差異的來源微生物種內(nèi)差異的來源v 如常用于真菌種類鑒定的如常用于真菌種類鑒定的ITS基因基因v ITS片段能保持相對穩(wěn)定的變異頻率片段能保持相對穩(wěn)定的變異頻率v 親緣關(guān)系非常接近的親緣關(guān)系非常接近的2個種都能在個種都能在ITS序列上表現(xiàn)出序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進化特征差異，顯示最近的進化特征微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)

9、微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二二樣品微生物的鑒定及同源性分析樣品微生物的鑒定及同源性分析三三微生物實驗室能力建設(shè)微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用微生物新技術(shù)的應(yīng)用四四微生物污染監(jiān)管方式的思考微生物污染監(jiān)管方式的思考五五背景介紹背景介紹一一2.1 技術(shù)手段技術(shù)手段2.2 方法比較方法比較2.1 技術(shù)手段技術(shù)手段2.2 方法比較方法比較革蘭氏染色鏡鑒革蘭氏染色鏡鑒按照標(biāo)準(zhǔn)進行按照標(biāo)準(zhǔn)進行傳統(tǒng)的生化反響鑒定傳統(tǒng)的生化反響鑒定API試劑條試劑條菌鑒定國際金標(biāo)準(zhǔn)菌鑒定國際金標(biāo)準(zhǔn) 半自動細(xì)菌鑒定儀半自動細(xì)菌鑒定儀ATB Expression 全自動細(xì)菌鑒定儀全自動細(xì)菌鑒定儀（VITEK 2）微生物鑒定手

10、段微生物鑒定手段 Mini VIDAS篩選系統(tǒng)篩選系統(tǒng)免疫凝集免疫凝集/免疫沉淀實驗免疫沉淀實驗微生物檢測手段微生物檢測手段熒光定量熒光定量PCR(BAX)色譜、光譜分析技術(shù)色譜、光譜分析技術(shù)分子生物分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)技術(shù) 傳統(tǒng)篩選方法傳統(tǒng)篩選方法2.1 技術(shù)手段技術(shù)手段PCR基因分型基因分型分子雜交分子雜交陽性菌分子水平上的鑒定陽性菌分子水平上的鑒定12341.形態(tài)學(xué)鑒定形態(tài)學(xué)鑒定3.核糖體水平上核糖體水平上的鑒定的鑒定APIVITEK16S rDNA序列分析序列分析分子雜交分子雜交Dupont RiboPrinter2.生化鑒定生化鑒定傅里葉紅外光譜傅里葉紅外光譜Rep-PCR (Diver

11、siLab)4.全基因組水平上全基因組水平上的鑒定的鑒定5.脈沖場電泳技術(shù)脈沖場電泳技術(shù)(PFGE),多位點序多位點序列分析列分析(MLST),多多位點重復(fù)串聯(lián)序列位點重復(fù)串聯(lián)序列分析分析(MLVA),隨機擴隨機擴增多態(tài)性分析技術(shù)增多態(tài)性分析技術(shù)RAPD)API試劑條試劑條菌鑒定國際金標(biāo)準(zhǔn)菌鑒定國際金標(biāo)準(zhǔn)無需專用儀器，標(biāo)準(zhǔn)化手工方法完成細(xì)菌的生化鑒無需專用儀器，標(biāo)準(zhǔn)化手工方法完成細(xì)菌的生化鑒定，為低本錢替代傳統(tǒng)手工細(xì)菌生化鑒定的最正確產(chǎn)定，為低本錢替代傳統(tǒng)手工細(xì)菌生化鑒定的最正確產(chǎn)品。品。特點：特點：完整的鑒定譜：完整的鑒定譜：15種試條，可鑒定的細(xì)菌多于種試條，可鑒定的細(xì)菌多于550種種簡單

12、方便：標(biāo)準(zhǔn)化方法，本錢低廉，判讀結(jié)果簡單簡單方便：標(biāo)準(zhǔn)化方法，本錢低廉，判讀結(jié)果簡單快速結(jié)果：快速結(jié)果：4-24小時。小時。半自動細(xì)菌鑒定儀半自動細(xì)菌鑒定儀ATB Expression檢測工程：可鑒定由環(huán)境、原料及制成品別離出的菌檢測工程：可鑒定由環(huán)境、原料及制成品別離出的菌種和藥敏試驗包括：腸桿菌、非發(fā)酵種和藥敏試驗包括：腸桿菌、非發(fā)酵G-桿菌、桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、酵母菌、厭氧菌。可鑒定葡萄球菌、鏈球菌、酵母菌、厭氧菌。可鑒定770種細(xì)菌和分析近種細(xì)菌和分析近80種抗生素藥敏實驗。種抗生素藥敏實驗。v 原理：鑒定試條包含風(fēng)干底物的反響孔，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)濁原理：鑒定試條包含風(fēng)干底物的反響孔，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)

13、濁度的菌液活化，于指定溫度培養(yǎng)度的菌液活化，于指定溫度培養(yǎng)4小時小時/24小時后小時后即可。計算機根據(jù)閱讀器檢測到的結(jié)果自動調(diào)用相即可。計算機根據(jù)閱讀器檢測到的結(jié)果自動調(diào)用相應(yīng)試劑條數(shù)據(jù)庫，得出生化應(yīng)試劑條數(shù)據(jù)庫，得出生化/同化結(jié)果和藥敏試驗同化結(jié)果和藥敏試驗結(jié)果。系統(tǒng)將所得編碼跟數(shù)據(jù)庫的典型菌株生化譜結(jié)果。系統(tǒng)將所得編碼跟數(shù)據(jù)庫的典型菌株生化譜比較，以客觀的比較，以客觀的2個參數(shù)鑒定百分率及個參數(shù)鑒定百分率及T-值計值計算鑒定結(jié)果算鑒定結(jié)果v 特點：特點：v 速度快捷速度快捷ATB Expression提供自動化接種，閱提供自動化接種，閱讀及分析試條結(jié)果。讀及分析試條結(jié)果。v 準(zhǔn)確可靠的結(jié)果

14、準(zhǔn)確可靠的結(jié)果ID 32及快速及快速ID 32 試條由金牌試條由金牌標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)API試條改進而成，配合自動化概念，結(jié)合成試條改進而成，配合自動化概念，結(jié)合成完整的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)完整的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)全自動細(xì)菌鑒定儀全自動細(xì)菌鑒定儀VITEK 2檢測工程：根據(jù)需要鑒定的微生物的種類的不同，設(shè)計檢測工程：根據(jù)需要鑒定的微生物的種類的不同，設(shè)計了不同的鑒定卡片，比方革蘭氏陰性菌卡，革蘭氏陽性了不同的鑒定卡片，比方革蘭氏陰性菌卡，革蘭氏陽性菌卡，酵母菌卡等?？设b定菌卡，酵母菌卡等?？设b定405種細(xì)菌，種細(xì)菌，70多種藥物多種藥物約約50多種藥物組合的藥敏卡。多種藥物組合的藥敏卡。v 原理：儀器的原理其實就是我

15、們進行細(xì)菌鑒定中使用原理：儀器的原理其實就是我們進行細(xì)菌鑒定中使用的生化反響。儀器把的生化反響。儀器把30個對細(xì)菌鑒定必需的生化反個對細(xì)菌鑒定必需的生化反響培養(yǎng)基固定到卡片上，然后通過培養(yǎng)后儀器對顯色響培養(yǎng)基固定到卡片上，然后通過培養(yǎng)后儀器對顯色反響進行判斷，利用數(shù)值法進行判定。反響進行判斷，利用數(shù)值法進行判定。v 特點：特點：v 快速：鑒定結(jié)果平均只需快速：鑒定結(jié)果平均只需4-6小時。對與快速生長細(xì)小時。對與快速生長細(xì)菌菌(大腸埃希氏、糞腸球菌、變形桿菌、克雷伯氏菌大腸埃希氏、糞腸球菌、變形桿菌、克雷伯氏菌等等)鑒定可提前到鑒定可提前到2小時。小時。v 操作簡便：全部操作自動化，簡單而方便操

16、作簡便：全部操作自動化，簡單而方便v 資料處理：資料處理：bioLIAISON軟件集中管理實驗室資料軟件集中管理實驗室資料v 獲得獲得AOAC 國際認(rèn)證：保證提供的微生物鑒定結(jié)果國際認(rèn)證：保證提供的微生物鑒定結(jié)果是公認(rèn)的是公認(rèn)的全自動熒光免疫分析儀全自動熒光免疫分析儀(mini-VIDAS) 檢測工程：食品及環(huán)境中最常見致病性細(xì)菌李斯特檢測工程：食品及環(huán)境中最常見致病性細(xì)菌李斯特菌屬、單核增生李斯特菌、彎曲菌屬、大腸桿菌菌屬、單核增生李斯特菌、彎曲菌屬、大腸桿菌O157、沙門氏菌屬、葡萄球菌腸毒素檢測的快速篩檢。沙門氏菌屬、葡萄球菌腸毒素檢測的快速篩檢。v 原理：原理： 以免疫技術(shù)捕獲目標(biāo)微生

17、物，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，以免疫技術(shù)捕獲目標(biāo)微生物，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，最后測藍(lán)色熒光最后測藍(lán)色熒光ELFA。包被針上有抗體包被，。包被針上有抗體包被，所測得的熒光與標(biāo)本中抗原的含量成正比。所測得的熒光與標(biāo)本中抗原的含量成正比。v 特點：特點：v 結(jié)果準(zhǔn)確：對每個標(biāo)本做兩次免疫反響，保證結(jié)果的結(jié)果準(zhǔn)確：對每個標(biāo)本做兩次免疫反響，保證結(jié)果的可靠。靈敏度比可見光方法高出可靠。靈敏度比可見光方法高出1000倍。已獲得美倍。已獲得美國國FDA、日本厚生省、日本厚生省、AOAC、USDA、中國進出口、中國進出口商品檢驗局等政府及權(quán)威機構(gòu)認(rèn)可。商品檢驗局等政府及權(quán)威機構(gòu)認(rèn)可。v 可同時進行可同時進行12個相同或不同

18、的測試。每天進行約個相同或不同的測試。每天進行約6080項測試項測試v 特異性強：標(biāo)本不需別離出目標(biāo)微生物即可上機檢測。特異性強：標(biāo)本不需別離出目標(biāo)微生物即可上機檢測。v 防止交叉污染：沒有采樣針，防止標(biāo)本之間交叉污染；防止交叉污染：沒有采樣針，防止標(biāo)本之間交叉污染；樣品不與儀器接觸，儀器內(nèi)沒有抽吸樣品的管路，杜樣品不與儀器接觸，儀器內(nèi)沒有抽吸樣品的管路，杜絕了標(biāo)本對環(huán)境的污染絕了標(biāo)本對環(huán)境的污染v 全自動化、操作簡便全自動化、操作簡便熒光定量熒光定量PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒错懠夹g(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒错懠夹g(shù)PCR是分子生物學(xué)技術(shù)最具有是分子生物學(xué)技術(shù)最具有代表性的技術(shù)。它是一種能在體外將微量生物代表性的技術(shù)

19、。它是一種能在體外將微量生物DNA分子分子進行數(shù)百萬倍放大的新型檢測技術(shù)。進行數(shù)百萬倍放大的新型檢測技術(shù)。熒光定量熒光定量PCR技術(shù)在普通技術(shù)在普通PCR技術(shù)根底上，通過熒光染技術(shù)根底上，通過熒光染料的結(jié)合，將檢測信號進一步放大，其靈敏度是普通料的結(jié)合，將檢測信號進一步放大，其靈敏度是普通PCR的幾百倍，并且整個擴增和檢測過程由儀器自動完的幾百倍，并且整個擴增和檢測過程由儀器自動完成，檢測同量高，速度快，減少了人為誤差和環(huán)境干擾成，檢測同量高，速度快，減少了人為誤差和環(huán)境干擾因素，克服了普通因素，克服了普通PCR易污染的問題，除去樣品前增菌易污染的問題，除去樣品前增菌時間，時間，5小時內(nèi)可得到

20、檢測結(jié)果。小時內(nèi)可得到檢測結(jié)果。微生物檢測限可能到微生物檢測限可能到達(dá)達(dá)1 CFU/mL以下，以下，而且抗雜菌干擾能力而且抗雜菌干擾能力強強DNA測序技術(shù)測序技術(shù)u DNA測序技術(shù)可以將生物的遺傳信息完整的破譯測序技術(shù)可以將生物的遺傳信息完整的破譯出來，通過直接比較不同類群個體同源核酸的核出來，通過直接比較不同類群個體同源核酸的核苷酸排列順序，獲得生物進化、變異的詳細(xì)信息苷酸排列順序，獲得生物進化、變異的詳細(xì)信息u 如細(xì)菌的如細(xì)菌的16S r DNA和真菌的和真菌的ITS序列，已經(jīng)被廣序列，已經(jīng)被廣泛測定應(yīng)用于菌種鑒定研究之中。由于泛測定應(yīng)用于菌種鑒定研究之中。由于DNA測序測序方法耗時短，準(zhǔn)

21、確度高，在細(xì)菌、真菌、植物、方法耗時短，準(zhǔn)確度高，在細(xì)菌、真菌、植物、動物的種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究方面得到了越來動物的種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究方面得到了越來越廣泛的應(yīng)用越廣泛的應(yīng)用a) 微生物污染溯源分析微生物污染溯源分析目前微生物分型技術(shù)常用于流行病學(xué)調(diào)查和毒力分析目前微生物分型技術(shù)常用于流行病學(xué)調(diào)查和毒力分析國際上普遍認(rèn)同脈沖凝膠電泳技術(shù)作為微生物分型的標(biāo)國際上普遍認(rèn)同脈沖凝膠電泳技術(shù)作為微生物分型的標(biāo)準(zhǔn)方法準(zhǔn)方法現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可用來區(qū)別近緣種，并在研究微生現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可用來區(qū)別近緣種，并在研究微生物種內(nèi)或種組間不同的污染來源及地理親緣關(guān)系的研物種內(nèi)或種組間不同的污染來源及地理親緣

22、關(guān)系的研究中顯示出廣泛的應(yīng)用前景究中顯示出廣泛的應(yīng)用前景 b) 相似微生物相似微生物DNA序列比對和微生物進化分析序列比對和微生物進化分析根據(jù)生物根據(jù)生物DNA序列的特異性分析，可檢測生物基因的微序列的特異性分析，可檢測生物基因的微小變化，監(jiān)控和預(yù)測微生物污染的爆發(fā)小變化，監(jiān)控和預(yù)測微生物污染的爆發(fā)16S rDNA分型已被廣泛認(rèn)可，微生物分型已被廣泛認(rèn)可，微生物16S rDNA進化樹進化樹對目標(biāo)微生物進行詳細(xì)的基因分型，同時還可了解不對目標(biāo)微生物進行詳細(xì)的基因分型，同時還可了解不同來源微生物的進化關(guān)系和親緣關(guān)系。該技術(shù)應(yīng)用范同來源微生物的進化關(guān)系和親緣關(guān)系。該技術(shù)應(yīng)用范圍寬，開展前景廣，開展?jié)?/p>

23、力巨大圍寬，開展前景廣，開展?jié)摿薮笾讣y圖譜技術(shù)指紋圖譜技術(shù)分子雜交技術(shù)首先用限制性內(nèi)切酶對細(xì)菌分子雜交技術(shù)首先用限制性內(nèi)切酶對細(xì)菌基因組基因組DNA進行酶消化，通過特異性探進行酶消化，通過特異性探針與目標(biāo)針與目標(biāo)DNA序列的雜交結(jié)合，經(jīng)過轉(zhuǎn)序列的雜交結(jié)合，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜技術(shù)和顯色技術(shù)形成該細(xì)菌特有的雜交膜技術(shù)和顯色技術(shù)形成該細(xì)菌特有的雜交圖譜。現(xiàn)有成熟的基于圖譜?，F(xiàn)有成熟的基于16S r DNA的分子的分子雜技圖譜庫涵蓋了雜技圖譜庫涵蓋了200個屬的個屬的1200多種多種6950株微生物，為各研究和實驗機構(gòu)提株微生物，為各研究和實驗機構(gòu)提供了一個統(tǒng)一的微生物分型標(biāo)準(zhǔn)。為環(huán)境供了一個統(tǒng)一的微生物分型

24、標(biāo)準(zhǔn)。為環(huán)境別離物、致病菌、有害生物體、質(zhì)控菌株、別離物、致病菌、有害生物體、質(zhì)控菌株、有益生物體和任何細(xì)菌建立了一個全自動有益生物體和任何細(xì)菌建立了一個全自動的基因指紋圖庫。這一精確到菌株水平的的基因指紋圖庫。這一精確到菌株水平的鑒定系統(tǒng)能夠追溯細(xì)菌污染源，并且具有鑒定系統(tǒng)能夠追溯細(xì)菌污染源，并且具有對所有微生物環(huán)境進行控制及流行病學(xué)調(diào)對所有微生物環(huán)境進行控制及流行病學(xué)調(diào)查等強大功能。查等強大功能。近紅外傅立葉光譜分析近紅外傅立葉光譜分析色譜分析色譜分析物質(zhì)成分分析物質(zhì)成分分析紅外傅立葉光譜分析紅外傅立葉光譜分析 FT-IR技術(shù)以未損傷細(xì)胞的技術(shù)以未損傷細(xì)胞的FT-IR光譜的特殊指紋區(qū)為根光

25、譜的特殊指紋區(qū)為根底，光譜反映的是整個細(xì)胞組成分子的振動特征，也就底，光譜反映的是整個細(xì)胞組成分子的振動特征，也就是蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的特征是蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的特征 由于這些細(xì)胞組分與基因表達(dá)有關(guān)，反響了全細(xì)胞組分由于這些細(xì)胞組分與基因表達(dá)有關(guān)，反響了全細(xì)胞組分的綜合信息所得圖譜有效地反映了細(xì)胞表型和基因型信的綜合信息所得圖譜有效地反映了細(xì)胞表型和基因型信息，從而區(qū)分生化信息上的差異息，從而區(qū)分生化信息上的差異德國德國Bruker公司微生物公司微生物FT-IR分析分析用戶手冊主要采用用戶手冊主要采用1200-900-1，3000-2800-1，1500-1400-1譜段組合進行微生物判別分析

26、，譜段組合進行微生物判別分析，這這3個譜段分別主要代表了微生物個譜段分別主要代表了微生物細(xì)胞壁多聚糖、細(xì)胞膜脂肪酸以細(xì)胞壁多聚糖、細(xì)胞膜脂肪酸以及細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)和類脂成分的及細(xì)胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)和類脂成分的信息。信息。色譜分析色譜分析 微生物中含有的一些稱為生物標(biāo)志物的化學(xué)物質(zhì)微生物中含有的一些稱為生物標(biāo)志物的化學(xué)物質(zhì)，其含量或結(jié)構(gòu)具其含量或結(jié)構(gòu)具有種屬特征或與其分類位置密切相關(guān)有種屬特征或與其分類位置密切相關(guān) 通過分析微生物的化學(xué)組成鑒定微生物，開辟了一個微生物檢測和通過分析微生物的化學(xué)組成鑒定微生物，開辟了一個微生物檢測和鑒定的新途徑鑒定的新途徑 高效液相色譜高效液相色譜(High - perf

27、ormance liquid chromatography，HPLC) 氣相色譜氣相色譜(Gas chromatography，GC) 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS) 液相色譜液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)建立各種生物標(biāo)志物在微生物中分布情況建立各種生物標(biāo)志物在微生物中分布情況的數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)分析程序，仍然是的數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)分析程序，仍然是色譜分析微生物的主要方向色譜分析微生物的主要方向2.1 技術(shù)手段技術(shù)手段2.2 方法比較方法比較各種鑒定方法的比較各種鑒定方法的比較我所抗生

28、素室通過比較分析近百我所抗生素室通過比較分析近百種微生物的生化鑒定方法種微生物的生化鑒定方法API和和VITEK 2鑒定和分子生物學(xué)鑒定和分子生物學(xué)方法鑒定方法，客觀準(zhǔn)確的多方方法鑒定方法，客觀準(zhǔn)確的多方面評價各種方法的優(yōu)劣面評價各種方法的優(yōu)劣微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二二樣品微生物的鑒定及同源性分析樣品微生物的鑒定及同源性分析三三微生物實驗室能力建設(shè)微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用微生物新技術(shù)的應(yīng)用四四微生物污染監(jiān)管方式的思考微生物污染監(jiān)管方式的思考五五背景介紹背景介紹一一3.1 細(xì)菌鑒定細(xì)菌鑒定3.2 溯源分析溯源分析3.1 細(xì)菌鑒定細(xì)菌鑒定3.2 溯源分析溯源

29、分析3.1 細(xì)菌鑒定細(xì)菌鑒定3.2 溯源分析溯源分析微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二二樣品微生物的鑒定及同源性分析樣品微生物的鑒定及同源性分析三三微生物實驗室能力建設(shè)微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用微生物新技術(shù)的應(yīng)用四四微生物污染監(jiān)管方式的思考微生物污染監(jiān)管方式的思考五五背景介紹背景介紹一一四、四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用 增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔政府檢測實驗室、藥廠微生物檢

30、測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力檢測結(jié)果公信力與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4四、四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用 增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)

31、政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力檢測結(jié)果公信力與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4v微生物檢測實驗室應(yīng)首先確保實驗室的設(shè)施和微生物檢測實驗室應(yīng)首先確保實驗室的設(shè)施和環(huán)境不會對檢驗過程帶來微生物污染環(huán)境不會對檢驗過程帶來微生物污染v只有

32、排除檢測過程中的微生物污染，才能保證只有排除檢測過程中的微生物污染，才能保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，才能有足夠的理由相信，檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，才能有足夠的理由相信，樣品污染來自藥品本身，而不在檢驗過程中被樣品污染來自藥品本身，而不在檢驗過程中被污染的污染的v對檢測機構(gòu)而言，自身檢測環(huán)境的控制要比樣對檢測機構(gòu)而言，自身檢測環(huán)境的控制要比樣品檢測更加重要品檢測更加重要四、四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用 公正公正準(zhǔn)確準(zhǔn)確科學(xué)科學(xué)高效高效v加強檢測的“過程控制v建立實驗室環(huán)境微生物信息庫、動態(tài)監(jiān)控環(huán)境微生物的變化、建立環(huán)境微生物污染趨勢分析圖，預(yù)測微生物污染方向，從被

33、動的排查污染措施上升到主動的預(yù)防、預(yù)警。v如果樣品檢驗過程中不合格，別離鑒定樣品中的微生物，與環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫比較、分析微生物污染來源，出具客觀的檢測報告，杜絕實驗結(jié)果假陽性和假陰性的發(fā)生樣品接收樣品接收樣品擺放樣品擺放樣品分發(fā)樣品分發(fā)環(huán)境環(huán)境設(shè)施設(shè)施儀器儀器實驗過程實驗過程結(jié)果報告結(jié)果報告登記樣品名稱，檢查是否具有唯一性登記樣品名稱，檢查是否具有唯一性標(biāo)識，并檢查是否與運轉(zhuǎn)表內(nèi)容一致標(biāo)識，并檢查是否與運轉(zhuǎn)表內(nèi)容一致看樣品外包裝是否完整、密封看樣品外包裝是否完整、密封,是否能是否能保持無菌狀態(tài)符合檢驗要求保持無菌狀態(tài)符合檢驗要求樣品數(shù)量是否符合檢驗要求樣品數(shù)量是否符合檢驗要求樣品接收樣品接收原

34、始記錄原始記錄原始記錄審核原始記錄審核檢測過程控制檢測過程控制樣品分發(fā)樣品分發(fā)環(huán)境環(huán)境設(shè)施設(shè)施儀器儀器實驗過程實驗過程結(jié)果報告結(jié)果報告 根據(jù)樣品的貯存條件進行冷藏、冷凍根據(jù)樣品的貯存條件進行冷藏、冷凍或常溫放置或常溫放置 將樣品分區(qū)域在檢、待檢、檢畢將樣品分區(qū)域在檢、待檢、檢畢擺置擺置冰箱和冰柜的溫度記錄冰箱和冰柜的溫度記錄樣品擺放樣品擺放樣品擺放樣品接收樣品接收原始記錄原始記錄原始記錄審核原始記錄審核檢測過程控制檢測過程控制環(huán)境環(huán)境設(shè)施設(shè)施儀器儀器實驗過程實驗過程結(jié)果報告結(jié)果報告環(huán)境和設(shè)施等的質(zhì)量管理環(huán)境和設(shè)施等的質(zhì)量管理儀器狀態(tài)是否正常是否在計量標(biāo)志儀器狀態(tài)是否正常是否在計量標(biāo)志的有效期內(nèi)

35、的有效期內(nèi)做好儀器使用記錄做好儀器使用記錄儀器設(shè)施環(huán)境樣品接收樣品接收樣品擺放樣品擺放樣品分發(fā)樣品分發(fā)原始記錄原始記錄原始記錄審核原始記錄審核檢測過程控制檢測過程控制樣品分發(fā)樣品分發(fā)環(huán)境環(huán)境設(shè)施設(shè)施儀器儀器實驗過程實驗過程結(jié)果報告結(jié)果報告 核對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是否現(xiàn)行有效核對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是否現(xiàn)行有效 培養(yǎng)基的質(zhì)量評估工作的審查培養(yǎng)基的質(zhì)量評估工作的審查 關(guān)鍵步驟用試劑的質(zhì)量控制關(guān)鍵步驟用試劑的質(zhì)量控制 陽性對照菌的管理陽性對照菌的管理 留樣管理留樣管理 廢棄物管理廢棄物管理 對滅菌效果評價的審查對滅菌效果評價的審查 實驗過程質(zhì)量控制管理人員技術(shù)能力，方法比對實驗過程質(zhì)量控制管理人員技術(shù)能力，方法比對實驗，

36、人員比對實驗，制備質(zhì)控樣品加菌隨行檢查實驗，人員比對實驗，制備質(zhì)控樣品加菌隨行檢查 應(yīng)急事件處理程序應(yīng)急事件處理程序?qū)嶒炦^程樣品接收樣品接收樣品擺放樣品擺放原始記錄原始記錄原始記錄審核原始記錄審核檢測過程控制檢測過程控制樣品分發(fā)樣品分發(fā)環(huán)境環(huán)境設(shè)施設(shè)施儀器儀器實驗過程實驗過程結(jié)果報告結(jié)果報告完全按完全按SOP書寫，所寫即所做的內(nèi)容書寫，所寫即所做的內(nèi)容統(tǒng)一原始記錄的格式和內(nèi)容統(tǒng)一原始記錄的格式和內(nèi)容按既定期限完成原始記錄的書寫按既定期限完成原始記錄的書寫按不同來源分別輸入結(jié)果按不同來源分別輸入結(jié)果原始記錄樣品接收樣品接收樣品擺放樣品擺放原始記錄原始記錄原始記錄審核原始記錄審核檢測過程控制檢測過

37、程控制樣品分發(fā)樣品分發(fā)環(huán)境環(huán)境設(shè)施設(shè)施儀器儀器實驗過程實驗過程結(jié)果報告結(jié)果報告原始記錄的完整性原始記錄的完整性檢驗數(shù)據(jù)的正確性檢驗數(shù)據(jù)的正確性結(jié)果判斷的合理性結(jié)果判斷的合理性原始記錄審核樣品接收樣品接收樣品擺放樣品擺放原始記錄審核原始記錄審核原始記錄原始記錄檢測過程控制檢測過程控制樣品分發(fā)樣品分發(fā)環(huán)境環(huán)境設(shè)施設(shè)施儀器儀器實驗過程實驗過程結(jié)果報告結(jié)果報告 陰性結(jié)果直接報告陰性結(jié)果直接報告 陽性結(jié)果陽性結(jié)果鑒定鑒定結(jié)果報告結(jié)果報告樣品接收樣品接收樣品擺放樣品擺放原始記錄原始記錄原始記錄審核原始記錄審核檢測過程控制檢測過程控制 建立環(huán)境微生物菌株信息庫建立環(huán)境微生物菌株信息庫 實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)

38、控實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控頭狀葡萄球菌頭狀葡萄球菌Staphylococcus capitis溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌Staphylococcus haemolyticus緩癥鏈球菌緩癥鏈球菌Streptococcus mitis科氏葡萄球菌科氏葡萄球菌Staphylococcus cohnii藤黃微球菌藤黃微球菌Micrococcus luteus常見潔凈環(huán)境微生物污染常見潔凈環(huán)境微生物污染 實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控v 建立實驗室潔凈區(qū)采樣方案建立實驗室潔凈區(qū)采樣方案v ?醫(yī)藥工業(yè)潔凈室區(qū)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法醫(yī)藥工業(yè)潔凈室區(qū)懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試

39、方法?GB/T 16292162941996v ?藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)?1998v 以一個月為周期，連續(xù)監(jiān)測實驗室環(huán)境以一個月為周期，連續(xù)監(jiān)測實驗室環(huán)境v 不定期對無菌室潔凈環(huán)境進行抽樣調(diào)查，積累潔凈環(huán)境微生物種不定期對無菌室潔凈環(huán)境進行抽樣調(diào)查，積累潔凈環(huán)境微生物種群和分布數(shù)據(jù)群和分布數(shù)據(jù)檢查內(nèi)容包括沉降菌檢測、浮游菌檢測、檢查內(nèi)容包括沉降菌檢測、浮游菌檢測、表面微生物檢測和操作人員衛(wèi)生檢測等表面微生物檢測和操作人員衛(wèi)生檢測等v 在實驗環(huán)境中以葡萄球菌屬在實驗環(huán)境中以葡萄球菌屬Staphylococcus別離數(shù)目最多別離數(shù)目最多為為34%v 微球菌屬微球菌屬Microco

40、ccus和芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬Bacillus次之，次之，分別為分別為19.15%和和17.04%v 假單胞菌屬假單胞菌屬Micrococcus、莫拉菌群、莫拉菌群Moraxella、短、短波單胞菌屬波單胞菌屬Brevundimonas占占4.26%v 短桿菌屬短桿菌屬Brevibacterium、不動桿菌屬、不動桿菌屬Acinetobacter、鞘氨醇單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、泛菌屬泛菌屬Pantoea等所占比例歸于其他項中等所占比例歸于其他項中v 收集的環(huán)境微生物中酵母菌占收集的環(huán)境微生物中酵母菌占8.51%，主要為近平滑假絲酵母，主要為近平滑假絲酵母Candid

41、a parapsilosis和粘紅酵母和粘紅酵母Rhodotorula mucilaginosav 霉菌等絲狀真菌占霉菌等絲狀真菌占4.26%，主要為青霉菌屬，主要為青霉菌屬 我所實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控我所實驗室潔凈環(huán)境微生物監(jiān)控 我所環(huán)境微生物菌株信息庫的建立我所環(huán)境微生物菌株信息庫的建立我們連續(xù)三個月對實驗室潔凈環(huán)境中我們連續(xù)三個月對實驗室潔凈環(huán)境中局部環(huán)境微生物進行追蹤，并進行同局部環(huán)境微生物進行追蹤，并進行同源性分析源性分析以葡萄球菌屬為例，本實驗室共收集到以葡萄球菌屬為例，本實驗室共收集到16株葡萄球球菌屬細(xì)菌。株葡萄球球菌屬細(xì)菌。7、8月分別收集到的細(xì)菌月分別收集到的細(xì)菌239與

42、與250和和232與與246之間同源性較高，之間同源性較高，歸在一個子類中，屬于同源污染。歸在一個子類中，屬于同源污染。說明說明7月和月和8月之間的消毒滅菌過程不徹底，存在消毒漏洞。月之間的消毒滅菌過程不徹底，存在消毒漏洞。經(jīng)過消毒，在經(jīng)過消毒，在9月份監(jiān)測過程中收集到的葡萄球菌中未發(fā)現(xiàn)有和前兩月份監(jiān)測過程中收集到的葡萄球菌中未發(fā)現(xiàn)有和前兩月同源的菌株，說明前期的污染已經(jīng)消除，月同源的菌株，說明前期的污染已經(jīng)消除，9月份收集到的局部葡月份收集到的局部葡萄球菌為新進入環(huán)境的微生物。萄球菌為新進入環(huán)境的微生物。同一株菌反復(fù)污染潔凈環(huán)境要引起檢驗人員高度重視僅靠潔凈室內(nèi)部消毒措施很可能起不到排除污染

43、的作用要對潔凈室送風(fēng)系統(tǒng)和檢驗人員攜帶污染進行全面調(diào)查建立環(huán)境微生物污染趨勢分析圖，預(yù)測微生物污染方向，從被動的排查污染措施上升到主動的預(yù)防、預(yù)警。將污染信息并與歷史污染物比對，回憶調(diào)查，幫助質(zhì)量體系的改進。微生物進行鑒定菌株來源微生物進行鑒定菌株來源共241株四、四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用 增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰Γ龅綌?shù)據(jù)可信，國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高凈環(huán)境

44、監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力檢測結(jié)果公信力與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4 在藥品微生物檢驗中的應(yīng)用在藥品微生物檢驗中的應(yīng)用v 在嚴(yán)格依據(jù)法定方法進行檢驗的同時，結(jié)合微生物在嚴(yán)格依據(jù)法定方法進行檢驗的同時，結(jié)合微生物鑒定技術(shù)平臺，對檢驗過程和檢驗結(jié)果進行雙重復(fù)鑒定技術(shù)平臺，對檢驗過程和檢驗結(jié)果進行雙重復(fù)合和監(jiān)控。通過比照環(huán)境監(jiān)測的微生物種群類別

45、和合和監(jiān)控。通過比照環(huán)境監(jiān)測的微生物種群類別和樣品微生物種群情況，客觀準(zhǔn)確的評價檢驗質(zhì)量，樣品微生物種群情況，客觀準(zhǔn)確的評價檢驗質(zhì)量，增菌檢驗報告的含金量。增菌檢驗報告的含金量。 在細(xì)菌污染檢查中的應(yīng)用在細(xì)菌污染檢查中的應(yīng)用分離純化得到單菌落菌落形態(tài)檢驗DNA提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)鑒定通用引物擴增細(xì)菌16S rDNA 序列16S rDNA序列分析鑒定結(jié)論樣品接收革蘭氏染色API鑒定形態(tài)鑒定生化鑒定VITEK鑒定細(xì)菌的鑒定流程圖細(xì)菌的鑒定流程圖 在真菌污染檢查中的應(yīng)用在真菌污染檢查中的應(yīng)用 在真菌污染檢查中的應(yīng)用在真菌污染檢查中的應(yīng)用v 現(xiàn)行國標(biāo)僅能夠?qū)η箤?，青霉屬，鐮刀菌屬等少?shù)現(xiàn)行國

46、標(biāo)僅能夠?qū)η箤?，青霉屬，鐮刀菌屬等少?shù)幾個種屬的霉菌進行鑒定。幾個種屬的霉菌進行鑒定。v 我國的食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)中，對于青霉我國的食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)中，對于青霉菌的鑒定需要在別離純化后培養(yǎng)菌的鑒定需要在別離純化后培養(yǎng)12-14天，再對其孢天，再對其孢子及菌絲進行形態(tài)學(xué)觀察。子及菌絲進行形態(tài)學(xué)觀察。v 真菌孢子易于在空氣中飄散，難以殺滅，對實驗室環(huán)真菌孢子易于在空氣中飄散，難以殺滅，對實驗室環(huán)境和檢驗人員平安具有潛在污染風(fēng)險。境和檢驗人員平安具有潛在污染風(fēng)險。分子生物學(xué)鑒定技術(shù)有效的解決了區(qū)分污染來源的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)有效的解決了區(qū)分污染來源的問題。該方法不需要使用選擇

47、性培養(yǎng)基，純化后即問題。該方法不需要使用選擇性培養(yǎng)基，純化后即可進行菌種鑒定。對真菌的菌絲體和孢子均能夠進可進行菌種鑒定。對真菌的菌絲體和孢子均能夠進行行DNA的提取，避免霉菌產(chǎn)生的大量孢子對實驗的提取，避免霉菌產(chǎn)生的大量孢子對實驗室工作環(huán)境帶來的潛在污染危害室工作環(huán)境帶來的潛在污染危害真菌的鑒定流程圖真菌的鑒定流程圖分離純化得到真菌樣品的單菌落真菌菌落形態(tài)觀察真菌DNA的提取構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分子生物學(xué)評價通用引物擴增真菌ITS 序列ITS序列在GenBank中進行Blast分析鑒定結(jié)論四、四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用 增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)

48、據(jù)可信，增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力檢測結(jié)果公信力與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.4美國美國FDA在要求藥廠將微生物鑒定到在要求

49、藥廠將微生物鑒定到“種一級，并種一級，并建議在微生物形態(tài)和生化反響鑒定之外采用基因分型建議在微生物形態(tài)和生化反響鑒定之外采用基因分型技術(shù)進行分析，以便對生產(chǎn)環(huán)境的微生物污染進行監(jiān)技術(shù)進行分析，以便對生產(chǎn)環(huán)境的微生物污染進行監(jiān)控控對藥廠生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)管和風(fēng)險評估上應(yīng)用對藥廠生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)管和風(fēng)險評估上應(yīng)用 上海某藥業(yè)產(chǎn)品受微生物潛在污染風(fēng)險上海某藥業(yè)產(chǎn)品受微生物潛在污染風(fēng)險 上海某藥業(yè)無菌產(chǎn)品微生物污染溯源上海某藥業(yè)無菌產(chǎn)品微生物污染溯源 某醫(yī)療器材滅菌方法研究某醫(yī)療器材滅菌方法研究對藥廠生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)管和風(fēng)險評估上應(yīng)用對藥廠生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)管和風(fēng)險評估上應(yīng)用某制藥廠沉降菌同源性分析某制藥廠沉降菌同源性分析檢測實

50、驗室檢測實驗室微生物信息庫微生物信息庫制藥企業(yè)制藥企業(yè)微生物信息庫微生物信息庫同同源源性性分分析析比比對對污染源污染源是是否否微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用 鑒鑒 定定四、四、微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用微生物鑒定技術(shù)平臺建設(shè)的意義及運用 增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，增強藥品中微生物檢驗?zāi)芰?，做到?shù)據(jù)可信，國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)國際認(rèn)可，為執(zhí)法、仲裁提供依據(jù)政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔政府檢測實驗室、藥廠微生物檢測實驗室潔凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高凈環(huán)境監(jiān)控，構(gòu)建環(huán)境微生物分布圖，提高檢測結(jié)果公信力檢測結(jié)果公

51、信力與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，監(jiān)控藥品生產(chǎn)環(huán)境，構(gòu)建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系建藥品生產(chǎn)微生物風(fēng)險評估體系應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，醫(yī)療器械、食品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用品、醫(yī)院等領(lǐng)域廣泛運用4.14.24.34.44.4 應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，可進行產(chǎn)應(yīng)用范圍廣，擴展能力強，可進行產(chǎn)品真?zhèn)舞b別和致敏原檢測品真?zhèn)舞b別和致敏原檢測v 國際上普遍加強了有關(guān)食品標(biāo)簽的法律法規(guī)，對相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)不斷國際上普遍加強了有關(guān)食品標(biāo)簽的法律法規(guī)，對相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)不斷細(xì)化。越來越多國家和地區(qū)開始全面實施對食品致敏原成分加細(xì)化。越來越多國家和地區(qū)開始全面實施對食品致敏

52、原成分加以標(biāo)識的規(guī)定以標(biāo)識的規(guī)定 酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù) PCR技術(shù)等技術(shù)等v 動植物產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定動植物產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定 追蹤產(chǎn)品產(chǎn)地追蹤產(chǎn)品產(chǎn)地 鑒別產(chǎn)品主要組成成分鑒別產(chǎn)品主要組成成分微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)微生物鑒定技術(shù)平臺的建設(shè)二二樣品微生物的鑒定及同源性分析樣品微生物的鑒定及同源性分析三三微生物實驗室能力建設(shè)微生物實驗室能力建設(shè)微生物新技術(shù)的應(yīng)用微生物新技術(shù)的應(yīng)用四四微生物污染監(jiān)管方式的思考微生物污染監(jiān)管方式的思考五五背景介紹背景介紹一一企業(yè)自查企業(yè)自查政府監(jiān)管政府監(jiān)管微生物樣本的采集微生物樣本的采集微生物菌株鑒定微生物菌株鑒定企業(yè)環(huán)境控制及污企業(yè)環(huán)境控制及污染溯源能力染溯源能力新

53、型監(jiān)管模式的建立新型監(jiān)管模式的建立構(gòu)建微生物分布圖構(gòu)建微生物分布圖建立菌種信息庫建立菌種信息庫A類企業(yè)：分子水平類企業(yè)：分子水平B類企業(yè)：生化水平類企業(yè)：生化水平C類企業(yè)：境檢、類企業(yè)：境檢、API水平水平 企業(yè)微生物鑒定到企業(yè)微生物鑒定到“屬屬 藥檢所鑒定到藥檢所鑒定到“種種 “菌珠菌珠五、上海醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的監(jiān)督、管理和風(fēng)險評估新模五、上海醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的監(jiān)督、管理和風(fēng)險評估新模式的建立新的監(jiān)管模式流程圖式的建立新的監(jiān)管模式流程圖 新的監(jiān)管模式流程圖新的監(jiān)管模式流程圖食品藥品監(jiān)督管理局科學(xué)規(guī)劃食品藥品監(jiān)督管理局科學(xué)規(guī)劃企業(yè)內(nèi)部自查企業(yè)內(nèi)部自查局各職能部門外部督察局各職能部門外部督察

54、藥檢所強大的技術(shù)支撐藥檢所強大的技術(shù)支撐 上海醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的信息庫上海醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的信息庫監(jiān)督、管理和風(fēng)險評估監(jiān)督、管理和風(fēng)險評估完善對制藥企業(yè)的風(fēng)險分級監(jiān)管完善對制藥企業(yè)的風(fēng)險分級監(jiān)管建立和健全日常監(jiān)督檢查方法建立和健全日常監(jiān)督檢查方法強化企業(yè)微生物風(fēng)險管理意識強化企業(yè)微生物風(fēng)險管理意識建立藥品污染源通報、追蹤平臺，完善藥品召回機制建立藥品污染源通報、追蹤平臺，完善藥品召回機制5.15.25.35.4幫助企業(yè)改進產(chǎn)品質(zhì)量，打造醫(yī)藥平安公共研發(fā)平臺幫助企業(yè)改進產(chǎn)品質(zhì)量，打造醫(yī)藥平安公共研發(fā)平臺5.5五、五、上海上海醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的監(jiān)督、管理和風(fēng)醫(yī)藥企業(yè)微生物污染的監(jiān)督、管理和風(fēng)

55、險評估新模式的建立險評估新模式的建立5.1 完善對制藥企業(yè)的風(fēng)險分級監(jiān)管完善對制藥企業(yè)的風(fēng)險分級監(jiān)管v 對制藥企業(yè)分級管理往往依據(jù)藥品對制藥企業(yè)分級管理往往依據(jù)藥品的產(chǎn)量、使用頻次及以往的污染事的產(chǎn)量、使用頻次及以往的污染事件嚴(yán)重性，對生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)環(huán)境件嚴(yán)重性，對生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)環(huán)境缺乏有效的數(shù)據(jù)監(jiān)測，容易忽略潛缺乏有效的數(shù)據(jù)監(jiān)測，容易忽略潛在的微生物污染危害在的微生物污染危害v 要是對文件資料的審查和經(jīng)驗性的要是對文件資料的審查和經(jīng)驗性的對加工條件和過程的評判，缺乏對對加工條件和過程的評判，缺乏對微生物污染進行監(jiān)控和調(diào)查的手段，微生物污染進行監(jiān)控和調(diào)查的手段，僅能對生產(chǎn)環(huán)境和終產(chǎn)品的細(xì)菌總僅

56、能對生產(chǎn)環(huán)境和終產(chǎn)品的細(xì)菌總數(shù)和控制菌進行檢查，缺乏量化的數(shù)和控制菌進行檢查，缺乏量化的評價指標(biāo)評價指標(biāo)v 檢測機構(gòu)對微生物檢測和追蹤識別檢測機構(gòu)對微生物檢測和追蹤識別能力大幅提高能力大幅提高v 通過采用微生物鑒定和分型技術(shù)對通過采用微生物鑒定和分型技術(shù)對藥品加工全過程的監(jiān)控，能對微生藥品加工全過程的監(jiān)控，能對微生物污染來源進行詳細(xì)的分析，繪制物污染來源進行詳細(xì)的分析，繪制工廠微生物分布圖，了解工廠生產(chǎn)工廠微生物分布圖，了解工廠生產(chǎn)過程中的污染重災(zāi)區(qū)和引起污染的過程中的污染重災(zāi)區(qū)和引起污染的工藝步驟工藝步驟v 為建立更全面的藥品質(zhì)量體系和風(fēng)為建立更全面的藥品質(zhì)量體系和風(fēng)險管理體系提供了有效的分

57、析手段。險管理體系提供了有效的分析手段。增強了監(jiān)管部門對制藥企業(yè)的監(jiān)管增強了監(jiān)管部門對制藥企業(yè)的監(jiān)管力度和檢查能力力度和檢查能力傳統(tǒng)監(jiān)管方法傳統(tǒng)監(jiān)管方法新新監(jiān)管方法監(jiān)管方法v 上海共有制藥企業(yè)約上海共有制藥企業(yè)約200家家v 上海地區(qū)被列為重點監(jiān)控對象的注射劑、生物制品和特殊藥品上海地區(qū)被列為重點監(jiān)控對象的注射劑、生物制品和特殊藥品三類高風(fēng)險品種的三類高風(fēng)險品種的生產(chǎn)企業(yè)僅有生產(chǎn)企業(yè)僅有58家家將臨時性的整頓深化為常態(tài)性的管理，可以使監(jiān)管將臨時性的整頓深化為常態(tài)性的管理，可以使監(jiān)管部門快速應(yīng)對微生物性污染突發(fā)事件，為有效評估部門快速應(yīng)對微生物性污染突發(fā)事件，為有效評估污染源的危害和范圍提供詳盡

58、的第一手分析資料污染源的危害和范圍提供詳盡的第一手分析資料這些品種涉及范這些品種涉及范圍廣、產(chǎn)品使用圍廣、產(chǎn)品使用頻繁，且容易發(fā)頻繁，且容易發(fā)生微生物性藥品生微生物性藥品污染事件。污染事件。逐步提高上海地逐步提高上海地區(qū)制藥企業(yè)的微區(qū)制藥企業(yè)的微生物性污染的風(fēng)生物性污染的風(fēng)險管理水平。險管理水平。上海地區(qū)高危企業(yè)上海地區(qū)高危企業(yè)微生物污染監(jiān)管方式的思考微生物污染監(jiān)管方式的思考 1、 調(diào)研：掌握企業(yè)生產(chǎn)管理水平和微生物風(fēng)險管理調(diào)研：掌握企業(yè)生產(chǎn)管理水平和微生物風(fēng)險管理能力能力 企業(yè)根本情況調(diào)查企業(yè)根本情況調(diào)查 微生物污染情況現(xiàn)場調(diào)查微生物污染情況現(xiàn)場調(diào)查 企業(yè)微生物風(fēng)險管理水平等級劃分企業(yè)微生物

59、風(fēng)險管理水平等級劃分 制訂適合處于不同風(fēng)險理水平制藥企業(yè)管理措施和制訂適合處于不同風(fēng)險理水平制藥企業(yè)管理措施和改進意見改進意見 2 、完善藥品微生物污染風(fēng)險管理體系，制定切實可、完善藥品微生物污染風(fēng)險管理體系，制定切實可行的日常微生物監(jiān)控網(wǎng)和風(fēng)險防范、預(yù)警機制。行的日常微生物監(jiān)控網(wǎng)和風(fēng)險防范、預(yù)警機制。 對制藥企業(yè)微生物污染的控制相關(guān)從業(yè)人員進行有方對制藥企業(yè)微生物污染的控制相關(guān)從業(yè)人員進行有方案的指導(dǎo)和培訓(xùn)案的指導(dǎo)和培訓(xùn) 為各類企業(yè)設(shè)定微生物風(fēng)險控制水平目標(biāo)，幫助企業(yè)為各類企業(yè)設(shè)定微生物風(fēng)險控制水平目標(biāo)，幫助企業(yè)建立微生物自查、預(yù)警和防護體系建立微生物自查、預(yù)警和防護體系 建設(shè)微生物污染監(jiān)控

60、數(shù)據(jù)庫，為藥品監(jiān)管部門提供監(jiān)建設(shè)微生物污染監(jiān)控數(shù)據(jù)庫，為藥品監(jiān)管部門提供監(jiān)管依據(jù)，建立藥品平安監(jiān)管長效機制管依據(jù)，建立藥品平安監(jiān)管長效機制對有條件的對有條件的A類企業(yè)：要具備一定的分子生物學(xué)鑒定方法和類企業(yè)：要具備一定的分子生物學(xué)鑒定方法和完備的生化鑒定手段，能對環(huán)境微生物給出根本準(zhǔn)確度鑒完備的生化鑒定手段，能對環(huán)境微生物給出根本準(zhǔn)確度鑒定結(jié)果；定結(jié)果；對對B類企業(yè)：要具備完善的生化鑒定體系，要能給出可靠的類企業(yè)：要具備完善的生化鑒定體系，要能給出可靠的微生物生化譜；微生物生化譜；對對C類企業(yè)：根本要具有類企業(yè)：根本要具有API試劑條鑒定條件和形態(tài)分析能試劑條鑒定條件和形態(tài)分析能力。力。 逐步