第2章 工業(yè)微生物的菌種選育

1、一、工業(yè)微生物的特點一、工業(yè)微生物的特點v個體小個體小v種類多種類多v繁殖快繁殖快v分布廣分布廣v代謝能力強代謝能力強v易變異改造易變異改造第一節(jié)第一節(jié) 概述概述二、發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求二、發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求v 1.生產(chǎn)力： 能在能在廉價的培養(yǎng)基廉價的培養(yǎng)基上迅速生長，代謝產(chǎn)物的上迅速生長，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量高產(chǎn)量高，其它代謝產(chǎn)，其它代謝產(chǎn)物少物少v 2.操作性： 發(fā)酵條件易控制，發(fā)酵條件易控制，菌種改造的可操作性要強（有關合成產(chǎn)物的途菌種改造的可操作性要強（有關合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單），徑盡可能地簡單），產(chǎn)品易分離產(chǎn)品易分離v 3.穩(wěn)定性： 抗雜菌和抗雜菌和抗噬菌體能力強抗噬菌體能力強，遺

2、傳性狀穩(wěn)定，菌種不易變異退化，遺傳性狀穩(wěn)定，菌種不易變異退化v 4.安全性： 是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素第一節(jié)第一節(jié) 概述概述三、菌種選育的目的三、菌種選育的目的v1、提高發(fā)酵產(chǎn)量、提高發(fā)酵產(chǎn)量v2、改進菌種的性能、改進菌種的性能v3、產(chǎn)生新的發(fā)酵產(chǎn)物、產(chǎn)生新的發(fā)酵產(chǎn)物v4、去除多余的組分、去除多余的組分第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v（一）菌種選育的理論基礎（一）菌種選育的理論基礎v（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程四、菌種選育的基本理論四、菌種選育的基本理論第一節(jié)第一節(jié) 概述概述（一）菌種選育的理論基礎（一）菌種選育的理論基礎v遺傳和變異遺傳

3、和變異 基因突變基因突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。生的遺傳性狀的變異。前突變：前突變：誘變劑所造成的誘變劑所造成的DNADNA分子的某一位置的結構改分子的某一位置的結構改變稱為前突變。變稱為前突變。影響前突變產(chǎn)影響前突變產(chǎn)生的的因素生的的因素細胞對誘變劑的透性細胞對誘變劑的透性細胞質(zhì)和酶的影響細胞質(zhì)和酶的影響基因所處的狀態(tài)基因所處的狀態(tài)1 1、前突變形成、前突變形成（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程1 1）光復活作用）光復活作用2 2）切補修復）切補修復3 3）重組修復）重組修復4 4）SOSSOS修復系統(tǒng)（多數(shù)誘變來源于此）

4、修復系統(tǒng)（多數(shù)誘變來源于此） 5 5）DNADNA多聚酶的校正作用多聚酶的校正作用2 2、DNADNA損傷的修復損傷的修復（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程SOS修復系統(tǒng)修復系統(tǒng) 它允許新生的它允許新生的DNA鏈越過胸腺嘧啶二聚體而生長。鏈越過胸腺嘧啶二聚體而生長。其代價是保真度的極大降低，這是一個錯誤潛伏的過程。其代價是保真度的極大降低，這是一個錯誤潛伏的過程。 （二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程校正差錯：校正差錯：光復活作用、切補修復光復活作用、切補修復引起差錯：引起差錯：重組修復、重組修復、SOS

5、SOS修復系統(tǒng)。修復系統(tǒng)。3 3、從前突變到突變、從前突變到突變（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程表型遲延：表型遲延：表型的改變落后于基因型的改變表型的改變落后于基因型的改變分離型遲延分離型遲延 ( (基因雜合基因雜合) ) 經(jīng)誘變處理后，細胞中的基因處于經(jīng)誘變處理后，細胞中的基因處于不純的狀態(tài)，突變型基因由于屬于隱不純的狀態(tài)，突變型基因由于屬于隱性基因而暫時得不到表達，需經(jīng)過復性基因而暫時得不到表達，需經(jīng)過復制、分離，在細胞中處于純的狀態(tài)時，制、分離，在細胞中處于純的狀態(tài)時，其性狀才得以表達。其性狀才得以表達。生理性遲延生理性遲延新的表型必須等到原有基因的產(chǎn)物新的表型必須等到原有基因的

6、產(chǎn)物稀釋到某一程度后才能表現(xiàn)出來稀釋到某一程度后才能表現(xiàn)出來。4 4、從突變到突變型、從突變到突變型（二）突變誘發(fā)的過程（二）突變誘發(fā)的過程v從菌種保藏中心購買從菌種保藏中心購買v育種育種 從自然界中篩選從自然界中篩選 誘變誘變 雜交育種雜交育種 基因工程育種基因工程育種 四、菌種來源四、菌種來源第一節(jié)第一節(jié) 概述概述CGMCCv 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center）成立于）成立于1979年，是以提供專業(yè)年，是以提供專業(yè)技術服務為主的

7、公益性機構，技術服務為主的公益性機構，1995年獲得布達佩斯條約年獲得布達佩斯條約國際保藏中心的資格，是我國唯一同時提供一般菌種資國際保藏中心的資格，是我國唯一同時提供一般菌種資源服務和專利生物材料保存的國家級保藏中心。中心設源服務和專利生物材料保存的國家級保藏中心。中心設立在中國科學院微生物研究所。立在中國科學院微生物研究所。v一、定義一、定義v二、方法二、方法v三、特點及應用三、特點及應用第二節(jié)第二節(jié) 自然選育自然選育自然選育：自然選育：在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，根據(jù)菌種的根據(jù)菌種的自發(fā)突變自發(fā)突變而進行菌種篩選的過程。而進行菌種篩選的過程。自發(fā)突

8、變：自發(fā)突變：就是指某些微生物在沒有人工參與下就是指某些微生物在沒有人工參與下所發(fā)生的那些突變。所發(fā)生的那些突變。一、定義一、定義多因素低劑量的誘變效應多因素低劑量的誘變效應互變異構效應互變異構效應第二節(jié)第二節(jié) 自然選育自然選育二、菌種自然選育方法二、菌種自然選育方法單菌落分離法單菌落分離法菌種菌種單細胞懸液單細胞懸液瓊脂板分離瓊脂板分離挑取單菌落挑取單菌落測定生產(chǎn)能力測定生產(chǎn)能力細菌：轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌：轉(zhuǎn)種到新鮮肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)放線菌、霉菌：石英砂震蕩打散孢子，棉花或濾紙過濾放線菌、霉菌：石英砂震蕩打散孢子，棉花或濾紙過濾第二節(jié)第二節(jié) 自然選育自然選育v三、特點及應用三、特點及

9、應用 簡單易行、自發(fā)突變的效率低。簡單易行、自發(fā)突變的效率低。 純化菌種，防止純化菌種，防止菌種衰退菌種衰退、穩(wěn)定產(chǎn)量和提高產(chǎn)、穩(wěn)定產(chǎn)量和提高產(chǎn)量量第二節(jié)第二節(jié) 自然選育自然選育1、目前生產(chǎn)用菌種的特點、目前生產(chǎn)用菌種的特點 多為人工誘變而來。多為人工誘變而來。 代謝調(diào)控系統(tǒng)失控。代謝調(diào)控系統(tǒng)失控。 生活力比野生菌株弱。生活力比野生菌株弱。 容易發(fā)生變異。容易發(fā)生變異。菌種衰退原因的分析菌種衰退原因的分析2、菌種遺傳特性的改變、菌種遺傳特性的改變1 1）異核現(xiàn)象）異核現(xiàn)象-導致菌種這一微生物群體發(fā)生變異導致菌種這一微生物群體發(fā)生變異2 2）自發(fā)突變）自發(fā)突變3 3）回復突變或產(chǎn)生分離子）回復突

10、變或產(chǎn)生分離子-形成具有不同基因型的形成具有不同基因型的個體個體異核體異核體孢子遺傳特性和孢子遺傳特性和生長速度不同生長速度不同菌種遺傳特性發(fā)生改變菌種遺傳特性發(fā)生改變相鄰菌絲細胞吻合相鄰菌絲細胞吻合回復突變：回復突變：突變基因再次發(fā)生突變又恢復原來的基因，這類突變稱為回突變基因再次發(fā)生突變又恢復原來的基因，這類突變稱為回復突變。復突變。1 1）一個菌種不是純一的群體。）一個菌種不是純一的群體。3、菌種生理狀態(tài)的改變、菌種生理狀態(tài)的改變2 2）培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的影響）培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的影響3 3）某些）某些培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件下，某些基因所處的狀態(tài)不同，下，某些基因所處的狀態(tài)不同，使得菌種的生理狀態(tài)不

11、同。使得菌種的生理狀態(tài)不同。主要是因為培養(yǎng)條件不適當。主要是因為培養(yǎng)條件不適當。v一、定義及特點一、定義及特點v二、誘變劑二、誘變劑v三、誘變育種的主要環(huán)節(jié)三、誘變育種的主要環(huán)節(jié)第三節(jié)誘第三節(jié)誘 變變 育育 種種第三節(jié)誘第三節(jié)誘 變變 育育 種種v誘變育種：誘變育種： 通過通過誘變劑處理誘變劑處理提高菌種的突變頻率，擴大變異幅度，提高菌種的突變頻率，擴大變異幅度，然后采用簡便、高效的篩選方法，從中選出具有優(yōu)良然后采用簡便、高效的篩選方法，從中選出具有優(yōu)良特性的變異菌株的方法。特性的變異菌株的方法。v特點：特點： 速度快、收效大、方法簡便，但缺乏定向性。速度快、收效大、方法簡便，但缺乏定向性。第

12、三節(jié)誘第三節(jié)誘 變變 育育 種種v物理誘變劑：射線如紫外線、物理誘變劑：射線如紫外線、X-射線、射線、-射線，射線，快中子；快中子；v化學誘變劑：氮芥、化學因子如堿基類似物、化學誘變劑：氮芥、化學因子如堿基類似物、 5-氟尿嘧啶、亞硝酸、亞硝基胍等。氟尿嘧啶、亞硝酸、亞硝基胍等。v生物誘變劑：溶原性噬菌體，人工構建的質(zhì)粒、生物誘變劑：溶原性噬菌體，人工構建的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子第三節(jié)誘第三節(jié)誘 變變 育育 種種突變的誘發(fā)突變的誘發(fā)突變株的篩選突變株的篩選突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn)v1.1.出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇v2.2.誘變處理誘變處理v3.3.篩選篩選v4.4.突變菌株高產(chǎn)基因

13、的表達突變菌株高產(chǎn)基因的表達第三節(jié)誘第三節(jié)誘 變變 育育 種種v選擇純種菌株（排除異核體）選擇純種菌株（排除異核體）v優(yōu)良性狀的菌株（產(chǎn)生孢子、生長速度）優(yōu)良性狀的菌株（產(chǎn)生孢子、生長速度）v對誘變劑敏感的菌株對誘變劑敏感的菌株v同時選擇幾株不同的優(yōu)良菌株同時選擇幾株不同的優(yōu)良菌株1.出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇v1）2.誘變處理誘變處理v高劑量：致死率高劑量：致死率90%-99.9% 變異幅度大，但負變株多v低劑量：致死率低劑量：致死率75%-80% 負變株少，且突變菌株穩(wěn)定3.篩選篩選v 根據(jù)步驟可以分為初篩和復篩根據(jù)步驟可以分為初篩和復篩v 初篩初篩 菌株的量要大，發(fā)酵和測試的條件都可粗

14、放些，采用一個菌種菌株的量要大，發(fā)酵和測試的條件都可粗放些，采用一個菌種進一個搖瓶的方法進行初篩進一個搖瓶的方法進行初篩v 復篩復篩 對發(fā)酵和測試條件要求應逐步提高，復篩一般每個菌株進對發(fā)酵和測試條件要求應逐步提高，復篩一般每個菌株進35個搖瓶，如果生產(chǎn)能力繼續(xù)保持優(yōu)異，再重復篩選幾次。個搖瓶，如果生產(chǎn)能力繼續(xù)保持優(yōu)異，再重復篩選幾次。v 初篩和復篩均要有親株作對照比較生產(chǎn)能力是否優(yōu)良。初篩和復篩均要有親株作對照比較生產(chǎn)能力是否優(yōu)良。v 復篩后的優(yōu)良菌株要考查其穩(wěn)定性、菌種特性和最適培復篩后的優(yōu)良菌株要考查其穩(wěn)定性、菌種特性和最適培養(yǎng)條件養(yǎng)條件v根據(jù)操作方法可分為隨機篩選和理性化篩選根據(jù)操作方

15、法可分為隨機篩選和理性化篩選q 隨機篩選隨機篩選q 理性化篩選理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進行有的放矢的篩選。如營養(yǎng)缺陷型、行有的放矢的篩選。如營養(yǎng)缺陷型、抗性突變株等?？剐酝蛔冎甑取＝?jīng)過誘變處理后，進行平板分離，隨經(jīng)過誘變處理后，進行平板分離，隨機挑選單菌落，篩選高產(chǎn)菌株機挑選單菌落，篩選高產(chǎn)菌株1 1）搖瓶篩選法）搖瓶篩選法單菌落單菌落傳種斜面?zhèn)鞣N斜面模擬發(fā)酵瓶模擬發(fā)酵瓶測定發(fā)酵能力測定發(fā)酵能力2 2）瓊脂塊篩選法）瓊脂塊篩選法打孔取塊打孔取塊 鑒定平板測定發(fā)酵能力鑒定平板測定發(fā)酵能力 ( (須經(jīng)搖瓶復篩須經(jīng)搖瓶復篩) )隨機篩選隨機篩選3 3）

16、篩選自動化和篩選工具微型化）篩選自動化和篩選工具微型化96孔板高通量孵育篩選孔板高通量孵育篩選營養(yǎng)缺陷型菌株篩選理性化篩選理性化篩選 所謂所謂營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生的一種生化突變體生化突變體。由于基因突變，它。由于基因突變，它失去了合成某失去了合成某種物質(zhì)種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基本培養(yǎng)基上本培養(yǎng)基上不能生長不能生長，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。1 ）篩選用培養(yǎng)基）篩選用培養(yǎng)基2

17、）營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法）營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法 v 將突變菌株放到完全致死的環(huán)境中，一次性篩出抗性將突變菌株放到完全致死的環(huán)境中，一次性篩出抗性突變株。突變株。v 包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體包括：抗生素、金屬離子、溫度、噬菌體 抗生素抗性突變：抗生素抗性突變：提高產(chǎn)量；提高產(chǎn)量； 抗噬菌體突變：抗噬菌體突變：消除噬菌體污染；消除噬菌體污染； 條件抗性突變：條件抗性突變：如溫度，可提高產(chǎn)量；如溫度，可提高產(chǎn)量；抗性突變株篩選抗性突變株篩選v培養(yǎng)基培養(yǎng)基v發(fā)酵條件發(fā)酵條件4.突變菌株高產(chǎn)基因的表達突變菌株高產(chǎn)基因的表達v 制備菌懸液制備菌懸液 細菌要處于對數(shù)生長期，此時，生

18、長狀態(tài)同步，生細菌要處于對數(shù)生長期，此時，生長狀態(tài)同步，生理活性一致，細胞濃度較高。霉菌、放線菌要用孢子。理活性一致，細胞濃度較高。霉菌、放線菌要用孢子。v 保證菌懸液均勻保證菌懸液均勻 用玻璃珠振蕩，使細胞均勻分散。用玻璃珠振蕩，使細胞均勻分散。v 維持一定的細胞濃度維持一定的細胞濃度 真菌和酵母一般是真菌和酵母一般是106-107個個/毫升，放線菌和細毫升，放線菌和細菌是菌是10 8個個/毫升。毫升。舉例（紫外線育種）舉例（紫外線育種）v 誘變誘變 單細胞懸液放置于培養(yǎng)皿中，放入無菌攪拌子。將培單細胞懸液放置于培養(yǎng)皿中，放入無菌攪拌子。將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器和培養(yǎng)皿蓋，養(yǎng)

19、皿置于磁力攪拌器上，打開磁力攪拌器和培養(yǎng)皿蓋，打開紫外燈，計時。打開紫外燈，計時。v 培養(yǎng)培養(yǎng) 達到要求時間后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，在紅外燈下稀釋分達到要求時間后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，在紅外燈下稀釋分離，涂平板，用黑布包扎，在適當溫度下培養(yǎng)。離，涂平板，用黑布包扎，在適當溫度下培養(yǎng)。誘變最有效的波長是波長是260 nm左右（左右（253265nm ），），紫外燈的功率為紫外燈的功率為15W，距離固定在距離固定在30 cm左右。左右。v一、定義和特點一、定義和特點v二、原理二、原理v三、常規(guī)的雜交育種：準性生殖方式雜交三、常規(guī)的雜交育種：準性生殖方式雜交v四、原生質(zhì)體融合技術四、原生質(zhì)體融合技術第四節(jié)第四節(jié)

20、雜雜 交交 育育 種種 技技 術術雜交育種雜交育種 一般是指兩個不同基因型的菌株通過接合或原生質(zhì)體一般是指兩個不同基因型的菌株通過接合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。狀的菌株。一、定義和特點一、定義和特點v 定向定向v 雜交后對誘變劑敏感雜交后對誘變劑敏感消除誘變效應飽和消除誘變效應飽和v 改變產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量改變產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量v 操作復雜，技術要求高，推廣和應用受限操作復雜，技術要求高，推廣和應用受限特點特點二、原理二、原理1.理論基礎理論基礎2.重組與雜交的關系重組與雜交的關系v 重組重組分子水平，雜交分

21、子水平，雜交細胞水平細胞水平v 雜交中必然包含著重組；雜交中必然包含著重組；v 重組則不限于雜交這一形式。重組則不限于雜交這一形式。(一一)遺傳標記遺傳標記 所謂所謂營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)缺陷型菌株是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)是微生物經(jīng)誘變劑處理后產(chǎn)生的一種生的一種生化突變體生化突變體。由于基因突變，它。由于基因突變，它失去了合成某失去了合成某種物質(zhì)種物質(zhì)（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基（氨基酸、維生素或核苷酸堿基）的能力，在基本培養(yǎng)基上本培養(yǎng)基上不能生長不能生長，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加，大多數(shù)營養(yǎng)缺陷型菌株需要補加一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。一定種類的有機物質(zhì)后才能生長。 營養(yǎng)標記

22、菌株（營養(yǎng)標記菌株（營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)缺陷型菌株）是最常用的）是最常用的遺傳標記之一。遺傳標記之一。三、常規(guī)的雜交育種三、常規(guī)的雜交育種( (二二) )異核體形成異核體形成( (三三) )雜合二倍體的形成雜合二倍體的形成* *提高異核二倍體的培養(yǎng)溫度提高異核二倍體的培養(yǎng)溫度* *用紫外線照射異核體用紫外線照射異核體特點：特點：體積、體積、DNADNA含量明顯大于直接含量明顯大于直接親本；具有較高的酶活性，生長速率親本；具有較高的酶活性，生長速率和糖的利用率較快。和糖的利用率較快。提高異核體形成雜合二倍體的常用方法：提高異核體形成雜合二倍體的常用方法：（四）重組（四）重組 v1染色體交換染色體交

23、換 發(fā)生在體細胞的有絲分裂過程中。發(fā)生在體細胞的有絲分裂過程中。 特點：形成的兩個子細胞仍為雙倍體細胞，但基因型特點：形成的兩個子細胞仍為雙倍體細胞，但基因型不同。不同。v2染色體單倍化染色體單倍化基因重組基因重組甲甲生長快、產(chǎn)量低乙生長慢、產(chǎn)量高生長慢、產(chǎn)量高生長快、產(chǎn)量高生長快、產(chǎn)量高應用應用 面包面包酵母酵母: :對麥芽糖及葡萄糖的發(fā)酵力強，產(chǎn)生對麥芽糖及葡萄糖的發(fā)酵力強，產(chǎn)生 COCO2 2 多，生長快；多，生長快； 酒精酒精酵母酵母: :產(chǎn)酒率高而對麥芽糖、葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)酒率高而對麥芽糖、葡萄糖的發(fā)酵力弱力弱 雜交雜交: :就得到了既能生產(chǎn)酒精，又能將其殘余菌就得到了既能生產(chǎn)酒精，又

24、能將其殘余菌體用作面包廠和家用發(fā)面酵母的優(yōu)良菌種。體用作面包廠和家用發(fā)面酵母的優(yōu)良菌種。四、原生質(zhì)體融合四、原生質(zhì)體融合 用脫壁酶處理，將微生物細胞壁除去，用脫壁酶處理，將微生物細胞壁除去，制成原生質(zhì)體，再用聚乙二醇（制成原生質(zhì)體，再用聚乙二醇（PEGPEG）促進）促進原生質(zhì)體融合，從而獲得異核體或重組子，原生質(zhì)體融合，從而獲得異核體或重組子，這一技術叫這一技術叫原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合。（一）原生質(zhì)體融合育種步驟（一）原生質(zhì)體融合育種步驟1.1.標記菌種的選擇標記菌種的選擇 一般以營養(yǎng)缺陷型和抗藥性等遺傳形狀作為標，且標一般以營養(yǎng)缺陷型和抗藥性等遺傳形狀作為標，且標記必須穩(wěn)定。記必須穩(wěn)定。

25、2.2.原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 在在放線菌和細菌放線菌和細菌中，制備原生質(zhì)體主要采用中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶溶菌酶；酵母和霉菌酵母和霉菌一般可用一般可用蝸牛酶或纖維素酶蝸牛酶或纖維素酶等。等。1 1）菌體的前處理（）菌體的前處理（EDTAEDTA、青霉素）、青霉素）2 2）菌體的培養(yǎng)時間）菌體的培養(yǎng)時間4 4）酶處理溫度）酶處理溫度3 3）酶濃度）酶濃度6 6）滲透壓穩(wěn)定劑（甘露醇、蔗糖、）滲透壓穩(wěn)定劑（甘露醇、蔗糖、KClKCl）5 5）酶解時間）酶解時間 3.3.原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合在融合劑在融合劑PEGPEG和和CaCa2+2+作用下，發(fā)生原生質(zhì)體融合。作用下，發(fā)生原生質(zhì)體融合。 4.4.原生質(zhì)體的再生原生質(zhì)體的再生再生培養(yǎng)基再生培養(yǎng)基- -由滲透壓穩(wěn)定劑和各種營養(yǎng)成分組成。由滲透壓穩(wěn)定劑和各種營養(yǎng)成分組成。 5.5.融合子的選擇融合子的選擇要獲得真正融合子，必須在融合體再生后，進行要獲得真正融合子，必須在融合體再生后，進行幾代自然分離、選擇，才能確定。幾代自然分離、選擇，才能確定。1.單一親