Q10第十章聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)20161013

1、第十章第十章 聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)Chapter 10 Technology of Chapter 10 Technology of Polymerase Chain Reaction, (PCR)Polymerase Chain Reaction, (PCR)內(nèi)容PCR的概念及技術(shù)的創(chuàng)建PCR的基本原理及特點PCR的反應(yīng)體系和條件優(yōu)化PCR產(chǎn)物分析PCR常用技術(shù)和應(yīng)用Kary B Mullis (1944-)l 1983 年年發(fā)明了發(fā)明了PCRPCR技術(shù)技術(shù)l 19931993年度獲得諾貝爾化學(xué)獎年度獲得諾貝爾化學(xué)獎DNA的體內(nèi)復(fù)制：的體內(nèi)復(fù)制：原料：原料： template DNA（geno

2、mic DNA ），），RNA primer，dNTPs酶：酶： 解旋酶，引物酶，解旋酶，引物酶， DNA聚合酶，聚合酶，連接酶連接酶反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，胞液環(huán)境，37 反應(yīng)過程：反應(yīng)過程： 起始（模板起始（模板DNA解鏈、形成引發(fā)體）、解鏈、形成引發(fā)體）、延長、終止延長、終止（三階段）（三階段）產(chǎn)物：產(chǎn)物：模板模板DNA （基因組基因組DNA）拷貝數(shù)增加拷貝數(shù)增加一倍一倍PCR：template DNA（genomic DNA ，cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPsDNA polymerasebuffer，三種

3、，三種變化的溫度變化的溫度（94，50-70，72 ），），cycles（25-35）denaturation、 annealing 、extension （三階段，（三階段，多循環(huán)多循環(huán)）目的目的DNA（特異性）（特異性）拷貝數(shù)增加拷貝數(shù)增加 倍倍PCRPCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理屬于無細胞的分子克隆，屬于無細胞的分子克隆，在微量離心管中在微量離心管中, ,加入適量的加入適量的緩沖液緩沖液, , 微量的微量的模板模板DNA,DNA,四種脫氧單核苷酸四種脫氧單核苷酸, ,耐熱性多聚耐熱性多聚酶酶, , 一對合成一對合成DNADNA的的引物引物, ,通過高溫通過高溫變性變性、低溫、低溫退火

4、退火和中溫和中溫延伸延伸三個階段為一三個階段為一個循環(huán)個循環(huán), ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍倍, ,一般樣品是經(jīng)過一般樣品是經(jīng)過3030次循環(huán)次循環(huán), ,最終使基因放大了數(shù)最終使基因放大了數(shù)百萬倍百萬倍; ; 擴增了特異區(qū)段的擴增了特異區(qū)段的DNADNA帶。帶。 Denaturing95CAnnealingTm-5CExtension72CPCR的原理的原理PCR的過程的過程（1）第一步）第一步 變性（變性（denature）94-95 oC下下5分鐘，模板分鐘，模板DNA雙鏈雙鏈完全變性成單鏈。完全變性成單鏈。（2）第二步）第二步 復(fù)性（復(fù)

5、性（anneal）50-60 oC下下1分鐘，引物與模板復(fù)性。分鐘，引物與模板復(fù)性。 引物的濃度高，引物的濃度高， 引物的鏈短。引物的鏈短。94 oC下下1分鐘，新合成的分鐘，新合成的DNA雙雙鏈又變性成單鏈模板。鏈又變性成單鏈模板。（4）第四步）第四步 變性（變性（denature）72 oC下下1-2分鐘，分鐘，Taq DNA聚合酶聚合酶在引物的在引物的3端上加上核苷酸。端上加上核苷酸。（3）第三步）第三步 延伸（延伸（extend）（5）第五步）第五步 重復(fù)（重復(fù)（repeat）PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件變性變性 95 5min變性變性 95 1min退火退火 55 1min延伸延伸 72

6、1min延伸延伸72 1min35 cycles變性變性95 延伸延伸72 退火退火Tm-5PCRPCR PrinciplePrincipletemplate denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR反應(yīng)的特點反應(yīng)的特點 特異性強特異性強 引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性 靈敏度高靈敏度高 指數(shù)增長指數(shù)增長，從從pg (10pg (10-12-12) )可擴增至可擴增至 mg (10mg (10-6-6) )水平水平 簡便、快速簡便、快速 2 24 4 小時完成擴增小時完成擴增 對標本的純度要

7、求低對標本的純度要求低不需要純化，甚至可以直接用細菌。已固定不需要純化，甚至可以直接用細菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。PCR儀儀PCR反應(yīng)標準的標準的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 10擴增緩沖液擴增緩沖液 10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul自從自從H.A. Erilish分離出耐高溫的分離出耐高溫的Taq DNA聚合聚合酶，代替大腸桿菌酶，代替大

8、腸桿菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片斷片斷（37 oC )，PCR技術(shù)才進入實用階段。技術(shù)才進入實用階段。（1）Taq DNA聚合酶聚合酶 PCR體系組成體系組成Taq DNA聚合酶的最大特點是熱穩(wěn)定性，耐高聚合酶的最大特點是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合溫，非常適合PCR過程的反復(fù)高溫變性要求。過程的反復(fù)高溫變性要求。 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性最適溫度：最適溫度： 72-78 oC 延伸速度：延伸速度： 約約1000nt/min酶分子酶分子 最長延伸長度：最長延伸長度：6.7kb 最適溫度高最適溫度高 Taq酶的功能與缺點酶的功能與缺點具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活外切酶活性，但沒有

9、性，但沒有3 5外切酶活性。外切酶活性。 合成超過合成超過600bp長度的長度的DNA就有可能出現(xiàn)就有可能出現(xiàn)錯配，用于克隆基因時必須測序。錯配，用于克隆基因時必須測序。金屬離子敏感（尤其是金屬離子敏感（尤其是Mg2+ ）。）。 當(dāng)當(dāng)dNTP（能結(jié)合（能結(jié)合Mg2+）的濃度為）的濃度為0.7-0.8mmol/L時，時，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。 Taq DNA聚合酶的激活劑聚合酶的激活劑 50mmol/L KCl也能激活也能激活Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。與待擴增的模板與待擴增的模板DNA區(qū)段的兩區(qū)段的兩3端端序列互補（序列互補（ 5端相同）的短端

10、相同）的短DNA。（2）引物（）引物（primer) 位置位置3 3 即即2.75 1011 bp的基因組中有一次的基因組中有一次完全與完全與19個核苷酸的序列相同的個核苷酸的序列相同的機會（或機會是約機會（或機會是約210- -11）。）。引物的長度引物的長度理論計算：理論計算：419=2.75 1011。一般引物設(shè)計為長一般引物設(shè)計為長15-30bp。引物的堿基序列引物的堿基序列 5端根據(jù)需要可設(shè)計成某個內(nèi)切酶的切點端根據(jù)需要可設(shè)計成某個內(nèi)切酶的切點順序、順序、RNA聚合酶識別序列、突變位點或聚合酶識別序列、突變位點或生物素標記等，方便與以后操作。生物素標記等，方便與以后操作。5ATGCA

11、GAAACTGATCGATCGATCGAT3 3GCTAGCTACTTAAG5 3端必須與模板正確配對，端必須與模板正確配對，5端可以不配對。端可以不配對。templateprimer盡可能提高盡可能提高G+C含量，以提高引物含量，以提高引物與模板的結(jié)合力與模板的結(jié)合力引物的堿基組成引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列. 5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3 CTGCCAGTCTAC3 GACGG5 T發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)1）2）3）避免形成引物二聚體（避免形成引物二聚體（dimer）兩個引物之間不能有兩個以上的兩個引物之間不能有兩個以上的連續(xù)堿基

12、序列互補。連續(xù)堿基序列互補。5GGTCTGCCAGTCTAC3 3CAGGACTTAGTCACT5 primer1primer2Upstream primer vs Downstream primerSense primer vs Antisense primerPrimer1 vs Primer2Forward primer vs Reverse primer引物的引物的Tm值值Tm=（G+C) 4 + (A+T) 2當(dāng)引物中的（當(dāng)引物中的（G+C）含量低于）含量低于50%時，復(fù)性溫度低于時，復(fù)性溫度低于55 oC。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的

13、特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。實際復(fù)性溫度選擇實際復(fù)性溫度選擇低于低于Tm值值5 oC。手工計算：手工計算：一般估計：一般估計：引物的濃度引物的濃度一般使用終濃度各一般使用終濃度各0.2 mol/L。簡并引物簡并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸氨基酸序列反推序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。出來的，就必須考慮密碼的簡并性。 需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。設(shè)計多組引物，結(jié)合位點依次位

14、于前一組設(shè)計多組引物，結(jié)合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產(chǎn)物的特異性。引物之間。增加擴增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計現(xiàn)在多用專業(yè)軟件引物設(shè)計現(xiàn)在多用專業(yè)軟件 套嵌引物（套嵌引物（nested primers)1324如如Primer6.0等等dNTP呈顆粒狀， 保存不當(dāng)易變性分解dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)小量分裝，-20冰凍保存，多次凍融會使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性（3） dNTP（4）模模板板DNA但不能有蛋白質(zhì)變性劑、但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA

15、酶、酶、Mg2+的的螯合劑等影響螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 模板的量：模板的量： 不能太多，不能太多，100 l反應(yīng)體系中反應(yīng)體系中100ng足夠。足夠。 純度：純度：PCR對模板對模板DNA的純度要求不高。的純度要求不高。（5） PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化 反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時間（變性、退火、延伸）反應(yīng)時間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（循環(huán)次數(shù)（PCRPCR效率及產(chǎn)物量）效率及產(chǎn)物量）1 1、溫度、溫度 變性溫度：變性溫度：9494- -97 97 退火溫度：低于引物退火溫度：低于引物TmTm 5 5 左右，一般左右，一

16、般55-60 溫度過高：降低擴增效率；溫度過高：降低擴增效率； 溫度過低：增加非特異性擴增溫度過低：增加非特異性擴增延伸溫度：延伸溫度：72 72 ，此時，此時TaqTaq酶具有較高的酶促活性酶具有較高的酶促活性2 2、時間、時間 第一次變性應(yīng)給予足夠時間（第一次變性應(yīng)給予足夠時間（5 5- -7 7分鐘）分鐘） 每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為復(fù)性時間：復(fù)性時間：303060sec60sec 延伸時間：延伸時間：1Kb1Kb以內(nèi)的以內(nèi)的DNADNA片段，延伸時間片段，延伸時間1min1min 3-4Kb 3-4Kb的的DNADNA片

17、段，延伸時間片段，延伸時間3-4min3-4min 10Kb 10Kb的的DNADNA片段，延伸時間片段，延伸時間15min15min3 3、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù) 重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25253535個循環(huán)個循環(huán) 擴增反應(yīng)的平臺效應(yīng)：擴增反應(yīng)的平臺效應(yīng)： 理論上，理論上，PCRPCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增長反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長，但這種增長形式在擴增形式在擴增25-2525-25個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到個循環(huán)以后便放慢直至停止，達到反應(yīng)平臺，此時擴增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而反應(yīng)平臺，此時擴增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長呈指數(shù)增長PCR反應(yīng)曲線PCR 產(chǎn)物分析

18、產(chǎn)物分析Analysis of PCR productsGel analysis (瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳/聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 ) : PCR 產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物電泳，EB（溴乙錠）染色，（溴乙錠）染色， 紫外儀下觀察，紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。初步判斷產(chǎn)物的特異性。Restriction-endonuclease digestion analysis：酶切、電泳分離。酶切、電泳分離。產(chǎn)物的鑒定，基因分型，研究變異性。產(chǎn)物的鑒定，基因分型，研究變異性。Hybridization ： (Southern blot/dot blot )Sequence analysi

19、s：是檢測是檢測PCR產(chǎn)物特異性的產(chǎn)物特異性的 最可靠方法。最可靠方法。常用常用PCR技術(shù)技術(shù)原位原位PCR (in situ PCR)多重多重PCR（multiplex PCR）長距離長距離PCR (Long-range PCR)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）熒光定量熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）巢式巢式PCR（nesting PCR）-4條引物條引物 原位聚合酶鏈式反應(yīng)（原位聚合酶鏈式反應(yīng)（In situIn situ PCR PCR）是由）是由HaaseHaase等于等于19901990年

20、首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段, ,在不破壞細胞的前提下在不破壞細胞的前提下, ,利用一些特定的檢測手利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。 直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行擴增?？蛇M行細胞內(nèi)定位。細胞中進行擴增?？蛇M行細胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列 12341234RT-PCRRT-PCR（reverse transcription-PCR）T

21、emin,H.發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶，發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶， 1975諾貝爾獎諾貝爾獎技術(shù)關(guān)鍵：技術(shù)關(guān)鍵：利用利用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶，把，把mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以再以cDNA為模板進行為模板進行PCR擴增。擴增。RNA template3 5 下游引物下游引物cDNA first strand3 5 上游引物上游引物cDNA first strandcDNA second strand3 5 3 5 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶Taq酶酶PCRReverse transcription (RT)下游引物下游引物上游引物上游引物Taq酶酶PCR-RFLP(Restriction Fragment Len

22、gth Polymorphism，RFLP)限制性限制性 片段長度多態(tài)性片段長度多態(tài)性 1. 分析已知突變分析已知突變 。 2. 突變堿基涉及酶切位點的變化。突變堿基涉及酶切位點的變化。 PCR- 酶切酶切- 電泳電泳PCR-RFLP5 CCACGG 33 GGTGCC 5*5 CCATGG 33 GGTACC 5*Resistance to NcoI DigestionSusceptible to NcoI DigestionHomozygous Homozygous MutantMutantHomozygous Homozygous Wild-typeWild-typeHeterozygo

23、teHeterozygoteDirection of ElectrophoresisPCR-RFLPSSCPPCRPCRATCGWildWildAmplify region of interestedDenature samples in Formamide or HeatATCGMutantMutantDenature samples in Formamide and HeatATCGATCGDNA molecules conformation depends on their sequenceRun on a Non-denaturing gel and look for mobility

24、 differencesWildWildMutanMutantSSCP點突變點突變 位于酶切位點上的點突變：位于酶切位點上的點突變：限制性酶切片段分析法限制性酶切片段分析法 不在酶切位點上的點突變：不在酶切位點上的點突變：單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP) 致病基因上的未知點突變：致病基因上的未知點突變： PCR-SSCP （單核苷酸多態(tài)性，（單核苷酸多態(tài)性，SNP）實時熒光定量PCR (Real-time PCR)常規(guī)定量PCR技術(shù)： 對PCRPCR擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行定量 重復(fù)性差 半定量實時定量PCR技術(shù)： 對PCRPCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進行 定量 實

25、時熒光定量PCR原理l在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。Ct 值是熒光定量PCR技術(shù)的一個很重要的概念 C代表Cycle，t代表threshold(熒光域值)。含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 熒光化學(xué) 熒光定量熒光定量PCRPCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：所使用的熒光化學(xué)可分為兩種： 熒光探針熒光探針 熒光染料熒光染料TaqMan熒光探針l與目標序列互補的與目標序列互補的寡核苷酸探針寡核苷酸探針l兩端分別標記一個兩端分別標記一個報告熒光基團報告熒光基團( (熒光素?zé)晒馑? )和一個和一個淬滅熒光淬滅熒光基團基團( (淬滅劑淬滅劑) )。l探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；lPCRPCR擴增時，擴增時，TaqTaq酶的酶的5 53 3外切酶外切酶活性將探針酶切降解，活