基因工程原理-第一章緒論

1、基因工程原理Principle of Gene Engineering 第一章第一章第一節(jié)第一節(jié)基因工程原理基因工程原理第一章 基因研究的發(fā)展階段：基因研究的發(fā)展階段：染色體遺傳學分子生物學反向生物學50s70s染色體水平DNA水平DNA重組1909年，丹麥年，丹麥W. Johannsen，Gene專業(yè)名詞誕生，專業(yè)名詞誕生，“給予生命給予生命”18571864：孟德爾碗豆雜交試驗（遺傳因子的獨立分配規(guī)律）1910年：摩爾根果蠅遺傳學研究（遺傳的染色體理論）1944年：Avery細菌轉(zhuǎn)化實驗（基因的化學本質(zhì)是DNA）1953年：Watson-Crick DNA雙螺旋模型學習內(nèi)容 概論 DNA重

2、組（限制性內(nèi)切酶） 運輸工具基因克隆載體 目的基因的制備 目的基因?qū)胧荏w細胞 外源基因的表達 基因工程的應用第一章第一章第一節(jié)第一節(jié)基因工程原理基因工程原理基本要求 掌握基因克隆的基本工具，特別是不同的載體。 克隆基因的基本方法。 怎樣利用基因重組技術研究基因的結構、表達和調(diào)控。 利用基因工程生產(chǎn)重組蛋白，基因工程在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的應用。 能夠設計一個基因克隆的程序。 PCR技術基本原理和應用 能夠根據(jù)酶切結果判讀酶切圖譜，以及判讀DNA序列的能力。 第一章第一章第一節(jié)第一節(jié)基因工程原理基因工程原理基因工程，龍敏南 等著，科學出版社，普通高等教育“十一五”國家級規(guī)劃教材參考書 Gene clo

3、ning, T.A. Brown. Third edition. 基因工程原理，吳乃虎編著，科學出版社 基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學出版社。 植物基因工程原理與技術，王關林，方宏筠主編，科學出版社。 分子克隆實驗指南，J. Sambtook, EF Frish, T Maniatis, 金冬雁，黎孟楓等譯，科學出版社。第一章第一章第一節(jié)第一節(jié)基因工程原理基因工程原理第一章第一章 緒論緒論基因工程概況基因工程概況1.11.1引言引言1.1.11.1.1基因工程含義基因工程含義 指在體外將核酸分子插入插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構成構成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入摻入到原先沒有這類分子

4、的寄主細胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。 基因工程英文： genetic engineering, gene manipulation, recombinant DNA technique, gene cloning, molecular cloning 目的基因的制備DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運輸工具基因克隆載體目的基因?qū)胧荏w細胞外源基因的表達基因工程基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。關鍵要素：關鍵要素：1.1.2 1.1.2 基因工程理論依據(jù)基因工程理論依據(jù) 基因具有相同的物質(zhì)基礎：DNA 基

5、因可切割 基因可轉(zhuǎn)移 多肽基因 遺傳密碼通用性：三聯(lián)密碼 基因遺傳1.1.3 1.1.3 基因工程研究的基本路線基因工程研究的基本路線基因工程基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質(zhì)的新組合，并使其摻入到原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定繁殖。1.1.41.1.4基因工程發(fā)展史基因工程發(fā)展史（1 1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：）理論上的三大發(fā)現(xiàn)： 1944, Avery的肺炎雙球菌實驗的肺炎雙球菌實驗,確定了確定了遺傳的物質(zhì)基礎是遺傳的物質(zhì)基礎是DNA。 DNA的分子結構及復制機理：的分子結構及復制機理：50年代，年代，Watson和和Crick提出提出DNA的雙螺

6、旋結構模型和半保留復制的機理的雙螺旋結構模型和半保留復制的機理。 1958，Crick提出提出“中心法則中心法則”；1961年，年，Jacob和和Monod “操縱子操縱子學說學說” DNARNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達問題。闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達問題。1.1.41.1.4基因工程發(fā)展史基因工程發(fā)展史（1 1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)：）理論上的三大發(fā)現(xiàn)： 1944, Avery的肺炎雙球菌實驗的肺炎雙球菌實驗,確定了確定了遺傳的物質(zhì)基礎遺傳的物質(zhì)基礎是是DNA。 DNA的分子結構及復制機理：的分子結構及復制機理：50年代，年代，Watson和和Crick提出提出DNA的雙螺旋結

7、構模型和半保留復制的機理的雙螺旋結構模型和半保留復制的機理。 1958，Crick提出提出“中心法則中心法則”；1961年，年，Jacob和和Monod “操縱子學說操縱子學說” DNARNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達問題。闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達問題。1.1.41.1.4基因工程發(fā)展史基因工程發(fā)展史（1）理論上的三大發(fā)現(xiàn)： 1944, Avery的肺炎雙球菌實驗,確定了遺傳的物質(zhì)基礎是DNA。 DNA的分子結構及復制機理：50年代，Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結構模型和半保留復制的機理。 1958，Crick提出“中心法則”；1961年，Jacob和Monod

8、 “操縱子學說” DNARNA-蛋白質(zhì) 闡明了遺傳物質(zhì)的流向和表達問題。1.DNA分子的體外切割與連接技術分子的體外切割與連接技術1970年，Smith等在流感嗜血桿菌中分離純化了核酸限制性內(nèi)切酶Hind；1972年，EcoR 。2.DNA分子的核苷酸序列分析技術分子的核苷酸序列分析技術3.基因工程載體基因工程載體pBR322和pUC13等載體。Cohen發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pSC101，并作為基因工程的載體使用.（2 2）技術上的三大發(fā)明：）技術上的三大發(fā)明：（3 3）基因工程的誕生）基因工程的誕生猿猴病毒SV40DNA 噬菌體DNAEcoR I切割T4 DNA連接酶重組DNA分子1972年,美國斯坦福

9、大學的 P.Berg 第一次實現(xiàn)了DNA 體外重組。1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer，標志著基因工程的誕生：Tetracycline pSC101EcoR IDNA 連接酶Kanamycin R6-5Kanr 和 Tetr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 CohenCohen體外重組實驗的意義：體外重組實驗的意義：1. pSC101質(zhì)?？梢宰鳛榛蚩寺〉妮d體質(zhì)?？梢宰鳛榛蚩寺〉妮d體.2. 能夠?qū)⑼庠茨軌驅(qū)⑼庠碊NA導入寄主細胞導入寄主細胞.3. 質(zhì)粒質(zhì)粒-大腸桿菌是一種成功的基因克隆大腸桿菌是一種成功的基因克隆體系體系.1977年，E. coli中合成了人生長激素基因

10、。1978-1979胰島素基因在大腸桿菌中表達。 1982年，培育出了超級鼠。1985年Horsch發(fā)明了植物基因工程的基本方法：葉圓盤法，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。1990年，患有遺傳免疫疾病的4歲女孩接受了基因療法。1990年，Perlak 將B.T.基因?qū)朊藁ǐ@得抗蟲棉 。1991年，美國開始人類基因組計劃。1997年，“多利”綿羊誕生。（4 4） 發(fā)展過程中的重大事件發(fā)展過程中的重大事件轉(zhuǎn)移大鼠生長素基因的小鼠轉(zhuǎn)移大鼠生長素基因的小鼠 1.2 1.2 基因工程研究內(nèi)容基因工程研究內(nèi)容 目的基因分離 制備重組DNA分子 重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞 篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克

11、隆 提取已擴增的目的基因 目的基因克隆到表達載體上，表達，產(chǎn)生目標產(chǎn)物第一次課結束瓊脂糖凝膠電泳(0.2-50kb DNA)聚丙烯酰胺凝膠電泳(1-1000bp DNA)1.3 1.3 基因操作的基本技術基因操作的基本技術（1 1）凝膠電泳）凝膠電泳：一種分子放置在電場中,會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。凝膠的分辨能力: 凝膠的類型和凝膠的濃度有關凝膠電泳的作用: 分析,制備和純化溴化乙錠:簡稱EB.EB的工作原理：溴化乙啶插入的插入的EB-+電電泳泳方方向向EB分辨率：分辨率：0.05g/帶帶原理原理: :帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合，互補區(qū)段會退火形成雙鏈結構。（2 2）

12、核酸的分子雜交）核酸的分子雜交 1968年華盛頓卡內(nèi)基學院 Roy Britten等常見的分子雜交：Southern blotting： DNA， DNA/RNA Northern blotting： RNA， DNA/RNADot/slot blotting：DNA芯片in situ hybridization：組織原位雜交Western blotting：蛋白質(zhì)/抗原、抗體待測分子探針Southern Blotting雜交雜交:總總DNA分子分子酶切酶切DNA片段片段電泳電泳變性、變性、轉(zhuǎn)移到濾膜上轉(zhuǎn)移到濾膜上用用32P標記的標記的DNA探針雜交探針雜交洗脫洗脫放射放射自顯影自顯影（核酸印

13、跡）（核酸印跡）（印跡雜交）（印跡雜交）1975年，英國人Southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術。Southern印跡雜交顯色圖片 用途：確定DNA 大小，鑒定DNA轉(zhuǎn)化結果。Northern Blotting雜交雜交:1979年，J.C.Alwine等，應用于特定性狀基因在mRNA水平上的動態(tài)表達研究。流程流程：RNA混合物進行瓊脂糖凝膠電泳分離得到的RNA轉(zhuǎn)膜與放射性標記的探針雜交 結果分析（3 3）細菌的轉(zhuǎn)化（）細菌的轉(zhuǎn)化（TransformationTransformation）一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。雙脫氧鏈

14、終止法（雙脫氧鏈終止法（Sanger法法）：英國生物化學家Frederick Sanger于1977年發(fā)明（4）DNA核苷酸序列分析核苷酸序列分析模板標記的引物DNA聚合酶dNTP雙脫氧鏈終止物ddNTP反應組成檢測方法：電泳放射自顯影讀出DNA序列長度：250bpSanger法基本過程：*CGTACCTCGTTCATGACAAGCGTCTCAddGAGTddCGCAGAGTddTGTTCGCAGAGTddACTGTTCGCAGAGT*DNA Sequencing via the Sanger Method模板標記的引物DNA聚合酶dNTP雙脫氧鏈終止物ddNTPFrederick Sange

15、r 1918年8月13日2013年11月19日，英國生物化學家。是第四位兩度獲得諾貝爾獎，以及唯一獲得兩次化學獎的人。1958年：確定胰島素結構，獲得諾貝爾化學獎1980年：發(fā)明Sanger測序法，再諾貝爾化學獎 化學降解法化學降解法(Maxam-Gilbert法）：法）：250bp 1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert建立的DNA片段序列的測定方法DNA分子末端放射性標記分子末端放射性標記電泳電泳四個獨立的降解體系四個獨立的降解體系放射自顯影放射自顯影G反應：反應：G甲基化（硫酸二甲酯）甲基化（硫酸二甲酯）G+A反應：反應：A和和G質(zhì)子化（甲酸）質(zhì)子化（甲酸）T+C反應：反應：

16、T和和C嘧啶環(huán)斷裂（肼）嘧啶環(huán)斷裂（肼）C反應：反應：C嘧啶環(huán)斷裂（高鹽、肼）嘧啶環(huán)斷裂（高鹽、肼） DNADNA序列分析儀序列分析儀聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR ）1985年，美國，Mullis：體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。成果發(fā)表在Science上。（5）基因擴增（）基因擴增（gene amplification）1993年因發(fā)明PCR技術，與邁克爾史密斯分享諾貝爾化學獎Kary Banks Mullis，1944年12月28日“我感謝諾貝爾評獎委員會,在我還能夠盡情享受生活的年齡及時地把諾貝爾獎授予給我.”“Fish

17、 dont know much about water, and people didnt know much about air.” “Play! Experiment! Discover!”基本原理：基本原理： 高溫變性低溫退火中溫延伸1.4 1.4 基因克隆需要特殊的工具和技術基因克隆需要特殊的工具和技術 運輸工具運輸工具：細菌質(zhì)粒病毒染色體 DNA操作技術操作技術純化DNA剪切DNA分子分析DNA片段大小連接DNA分子將DNA轉(zhuǎn)入受體細胞重組子的鑒定1.5 1.5 基因工程的意義基因工程的意義 大規(guī)模的生產(chǎn)生物分子 設計構建新物種 搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息。 醫(yī)藥醫(yī)藥 重組藥物 基因治療 檢測遺傳疾病、病原 農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè) 抗病蟲 提高品質(zhì) 提高花卉的觀賞價值 抗逆性 家畜：瘦肉比；飼料利用率；加快生長 主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間產(chǎn)品產(chǎn)品時間時間國家國家用途用途上市時間上市時間國家國家人生長激素釋放抑制素人生長激素釋放抑制素(SRM)(SRM)19771977日本日本巨人癥巨人癥人胰島素人胰島素19781978美國美國糖尿病糖尿病19821982歐洲歐洲人生長激素（人生長激素（HGHHGH）19791979美國美國侏儒癥侏儒癥19851985美國美國人人- -干擾素（干