流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群

1、流式細(xì)胞術(shù)檢測T T細(xì)胞亞群組組 長：長： 杜建呈杜建呈小組成員：小組成員： 李李 姚姚 田田 呈（講解）呈（講解） 羅光珍羅光珍 范成芬范成芬 錢洪珍錢洪珍目的了解流式細(xì)胞術(shù)的基本發(fā)展過程了解流式細(xì)胞術(shù)的基本發(fā)展過程掌握流式細(xì)胞術(shù)的基本原理及應(yīng)用掌握流式細(xì)胞術(shù)的基本原理及應(yīng)用掌握分選掌握分選T T細(xì)胞亞群的原理與方法細(xì)胞亞群的原理與方法掌握掌握T T細(xì)胞亞群分選的意義細(xì)胞亞群分選的意義驗(yàn)實(shí)一Moldavan1首次提出了使懸浮的單個血紅細(xì)胞等首次提出了使懸浮的單個血紅細(xì)胞等流過玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計數(shù)，流過玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計數(shù)，并用光電記錄裝置計測的設(shè)想，在此之

2、前，人們并用光電記錄裝置計測的設(shè)想，在此之前，人們還習(xí)慣于測量靜止的細(xì)胞，因?yàn)橐箚蝹€細(xì)胞順還習(xí)慣于測量靜止的細(xì)胞，因?yàn)橐箚蝹€細(xì)胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊次流過狹窄管道容易造成較大的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊的淤阻的淤阻。Crosland Taylor根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的研究認(rèn)識到：管中軸線流過的鞘液中流動規(guī)律的研究認(rèn)識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強(qiáng)，并具有較強(qiáng)的流速越快，載物通過的能力越強(qiáng)，并具有較強(qiáng)的流體動力聚集作用。于是設(shè)計了一個流動室，使流體動力聚集作用。于是設(shè)計了一個流動室，使待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸線

3、附近流過，待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細(xì)胞懸浮液和鞘液都在作層液。外層包圍著鞘液；細(xì)胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。這就奠定了現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。二，流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展史19561956年，CoulterCoulter 在多年研究的基礎(chǔ)上利用 CoulterCoulter 效應(yīng)生產(chǎn)了效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter 計數(shù)器。其基本原理是：使細(xì)計數(shù)器。其基本原理是：使細(xì)胞通過一個小孔，只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存胞通過一個小孔，只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特在著導(dǎo)電性上的差異，便會影響小孔道

4、的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強(qiáng)度和性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強(qiáng)度和個數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目方面的信息。個數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年年 Holm等設(shè)計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染等設(shè)計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細(xì)胞，再由光電檢測設(shè)備計數(shù)的裝置。色的細(xì)胞，再由光電檢測設(shè)備計數(shù)的裝置。1973年年 Steinkamp設(shè)計了一種利用激光激發(fā)雙色設(shè)計了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞，既能分析計數(shù)，又能進(jìn)行熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞，既能分析計數(shù)，又能進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計數(shù)計數(shù)技術(shù)的主要?dú)v

5、程。技術(shù)的主要?dú)v程。現(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)是從組織化學(xué)發(fā)源的源的，其開拓者是其開拓者是Kamentsky。1965年，他在組織年，他在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個新設(shè)想化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個新設(shè)想1）細(xì)胞的組分是可以用光光度學(xué)來定量測定的，）細(xì)胞的組分是可以用光光度學(xué)來定量測定的，即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細(xì)胞組織化學(xué)即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細(xì)胞組織化學(xué)的重要信息。的重要信息。2）細(xì)胞的不同組分可以同時進(jìn)行多參數(shù)測量，從）細(xì)胞的不同組分可以同時進(jìn)行多參數(shù)測量，從而可以對細(xì)胞進(jìn)行分類。換句話說，對同一細(xì)胞而可以對細(xì)胞進(jìn)行分類。換句話說，對同一細(xì)胞可以同時獲得有關(guān)不同組分的多方面的

6、信息，用可以同時獲得有關(guān)不同組分的多方面的信息，用作鑒別細(xì)胞的依據(jù)。作鑒別細(xì)胞的依據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用的先驅(qū)者是Van Dilla和和美國的美國的Los Alamos小組。他們在小組。他們在1967年研制出流液束、年研制出流液束、照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細(xì)胞計的基照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細(xì)胞計的基礎(chǔ)上，首次用熒光礎(chǔ)上，首次用熒光Feulgen反應(yīng)對反應(yīng)對DNA染色顯示出染色顯示出DNA的活的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并在性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并在DNA的直方圖上清楚的直方圖上清楚地顯示出細(xì)胞周期的各個時相。地顯示出細(xì)胞周期的各個時相。Goh

7、de 和和Dittrich接著把這接著把這項(xiàng)技術(shù)推向?qū)嵱?，他們用流式?xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期借以研項(xiàng)技術(shù)推向?qū)嵱?，他們用流式?xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期借以研究細(xì)胞藥代動力學(xué)問題。究細(xì)胞藥代動力學(xué)問題。FCM用于免疫組織化學(xué)中的關(guān)鍵用于免疫組織化學(xué)中的關(guān)鍵是對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其它和在細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用并是對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其它和在細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用并沒有多大差異。沒有多大差異。流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。三，流式細(xì)胞術(shù)的基本原理及應(yīng)用一一） 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)

8、（FCMFCM）是一種可以對細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)）是一種可以對細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速測量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。進(jìn)行快速測量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。1 1，其基本原理是將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特，其基本原理是將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放入樣品管。異熒光染料染色后，放入樣品管。2 2，在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品中的單細(xì)胞懸液形成，在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動室，沿流動室的軸心向樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動，流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞下流動，流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形

9、成包繞細(xì)胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓細(xì)胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交相交點(diǎn)稱為測量區(qū)。相交相交點(diǎn)稱為測量區(qū)。3 3，染色的細(xì)胞經(jīng)照射發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別，染色的細(xì)胞經(jīng)照射發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被呈被呈90900 0角方向放置的光電倍增管熒光檢測器和前向角放置的光電角方向放置的光電倍增管熒光檢測器和前向角放置的光電二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電子信號后，經(jīng)膜二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電子信號后，經(jīng)

10、膜/ /數(shù)轉(zhuǎn)換輸入計算機(jī)。數(shù)轉(zhuǎn)換輸入計算機(jī)。4 4，計算機(jī)通過相應(yīng)的軟件儲存，計算，分析這些數(shù)字化信息，就，計算機(jī)通過相應(yīng)的軟件儲存，計算，分析這些數(shù)字化信息，就可以得到細(xì)胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性質(zhì)等物理和可以得到細(xì)胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。生化指標(biāo)。二）三）流式細(xì)胞儀的工作原理流式細(xì)胞儀的工作原理n參數(shù)測量原理：流式細(xì)胞儀可以同時進(jìn)行參數(shù)測量原理：流式細(xì)胞儀可以同時進(jìn)行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號和非熒光散射信號。和非熒光散射信號。n樣品分選原理：流式細(xì)胞儀的分選功能是樣品分選原理：流式細(xì)胞儀的分選

11、功能是由細(xì)胞分選器來完成的。由細(xì)胞分選器來完成的。n數(shù)據(jù)處理原理：數(shù)據(jù)處理原理：FCMFCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖（histogram)histogram)，二維點(diǎn)圖，二維點(diǎn)圖（dotplotdotplot），二維高等圖（），二維高等圖（contourcontour），假三），假三維圖（維圖（pseudo 3Dpseudo 3D）和列表模式（）和列表模式（list modelist mode）等。等。四，T T細(xì)胞亞群的檢測1，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+，CD8+T細(xì)胞。2，實(shí)驗(yàn)原理，實(shí)驗(yàn)原理（1 1）：T淋巴細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性，根據(jù)

12、其表面的標(biāo)志和功能特征，可分為若干個亞群，各亞群之間相互調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮其免疫學(xué)功能。因此，對淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的檢測能反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+,CD8+T細(xì)胞。（流式細(xì)胞術(shù)原理見前面流式細(xì)胞術(shù)的基本原理及應(yīng)用）實(shí)驗(yàn)原理（2 2） T淋巴細(xì)胞表面的淋巴細(xì)胞表面的CD分子與相應(yīng)熒光素直分子與相應(yīng)熒光素直接標(biāo)記的抗人接標(biāo)記的抗人CD分子分子McAb結(jié)合后，細(xì)胞表結(jié)合后，細(xì)胞表面形成帶有熒光色素的抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)面形成帶有熒光色素的抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出與熒光素相對應(yīng)的特定波長激光激發(fā)后發(fā)出與熒光素相對應(yīng)的特定波長的熒光，其熒光強(qiáng)度與被測的熒光，其熒光強(qiáng)度與被

13、測CD分子表達(dá)密度分子表達(dá)密度成正比例關(guān)系，由此通過流式細(xì)胞儀課檢測成正比例關(guān)系，由此通過流式細(xì)胞儀課檢測結(jié)合含有相應(yīng)熒光素標(biāo)記抗體的陽性細(xì)胞百結(jié)合含有相應(yīng)熒光素標(biāo)記抗體的陽性細(xì)胞百分率。分率。 3實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：（1）,肝素抗凝人全血肝素抗凝人全血（2）,熒光標(biāo)記單克隆抗體：抗人熒光標(biāo)記單克隆抗體：抗人CD4-FITC,抗人抗人CD8-PE(美國美國BD公司產(chǎn)公司產(chǎn) 品）品）（3）,細(xì)胞洗液（含細(xì)胞洗液（含1%FCS的的PBS)（4）,紅細(xì)胞裂解液紅細(xì)胞裂解液（5）,細(xì)胞固定液細(xì)胞固定液 （25%戊二醛戊二醛3.2ml， 葡萄糖葡萄糖2.0g加無血清細(xì)胞洗液至加無血清細(xì)胞洗液至 100m

14、l）。）。 . .（6）,FACS緩沖液緩沖液 1 PBS 950ML FCS 40ml 10%疊氮鈉溶液疊氮鈉溶液 10ml .（7）,儀器緩沖液（儀器緩沖液（FACS-flow),FACS清潔液（清潔液（FACS clean)和和FACS洗凈液洗凈液（FACS rinse)由儀器廠家提供。由儀器廠家提供。（8）,流式細(xì)胞儀。流式細(xì)胞儀。（9）離心機(jī)，吸管，試管等。）離心機(jī)，吸管，試管等。4，實(shí)驗(yàn)步驟n 混勻抗凝全血，加混勻抗凝全血，加100ul全血于試管中，分別加入抗人全血于試管中，分別加入抗人CD4-FITC,CD8-PE單克隆熒光抗體各單克隆熒光抗體各10ul，用振蕩器混勻，用振蕩器混

15、勻，避光放置避光放置1530min（室溫（室溫200C250C)n 加入溶血素加入溶血素2ml溶解紅細(xì)胞，與振蕩器上混勻，室溫避溶解紅細(xì)胞，與振蕩器上混勻，室溫避光放置光放置10min，1000rpm離心離心10min，棄上清液。，棄上清液。n 加入加入PBS緩沖液（有緩沖液（有0.1%的的NaN3）1ml洗細(xì)胞，洗細(xì)胞，1000rpm離心離心10min，傾去上清液，加入固定液，傾去上清液，加入固定液300ul重懸細(xì)胞，重懸細(xì)胞，BD-FACBCalibur流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀檢測。n 細(xì)胞的吸入，將裝有細(xì)胞的細(xì)胞的吸入，將裝有細(xì)胞的FACS測定管放置到機(jī)器吸管測定管放置到機(jī)器吸管孔處，

16、先預(yù)檢測樣品，然后進(jìn)行實(shí)際檢測。課根據(jù)細(xì)胞孔處，先預(yù)檢測樣品，然后進(jìn)行實(shí)際檢測。課根據(jù)細(xì)胞的濃度選擇測定的速度（低，中或高）。所有的數(shù)據(jù)將的濃度選擇測定的速度（低，中或高）。所有的數(shù)據(jù)將自動存入微機(jī)。自動存入微機(jī)。5使用后的清洗n 將裝將裝FACS清潔液的清潔液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入1minn 將裝將裝FACS洗凈液的洗凈液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入1minn 再將裝再將裝FACS清潔液的清潔液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入5minn 同樣再將裝同樣再將裝FACS洗凈液的洗凈液的FACS

17、管放置機(jī)器吸管孔，高速管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入吸入5minn 最后將一裝有雙蒸水的最后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機(jī)器吸管孔，關(guān)閉機(jī)管放置機(jī)器吸管孔，關(guān)閉機(jī)器。器。n 將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。6 6，F(xiàn)CMFCM分析n 7 7，結(jié)果判斷：n如上圖所示，CD3+T細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的66.82%，其中CD4+T細(xì)胞占51.59%，CD8+T T細(xì)胞占14.83% 。8 8，注意事項(xiàng)：確保細(xì)胞懸液上機(jī)檢測前濃度為1 110105 5/ /mlml, ,細(xì)胞濃度過低直接影響檢測結(jié)果。使用蛋白封閉劑，封閉非特異結(jié)合實(shí)際位點(diǎn)，常用的蛋白封閉劑為0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。設(shè)置對照樣品，采用與抗體來源同型匹配的