流式細胞術檢測T細胞亞群

1、流式細胞術檢測T T細胞亞群組組 長：長： 杜建呈杜建呈小組成員：小組成員： 李李 姚姚 田田 呈（講解）呈（講解） 羅光珍羅光珍 范成芬范成芬 錢洪珍錢洪珍目的了解流式細胞術的基本發(fā)展過程了解流式細胞術的基本發(fā)展過程掌握流式細胞術的基本原理及應用掌握流式細胞術的基本原理及應用掌握分選掌握分選T T細胞亞群的原理與方法細胞亞群的原理與方法掌握掌握T T細胞亞群分選的意義細胞亞群分選的意義驗實一Moldavan1首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數(shù)，流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數(shù)，并用光電記錄裝置計測的設想，在此之

2、前，人們并用光電記錄裝置計測的設想，在此之前，人們還習慣于測量靜止的細胞，因為要使單個細胞順還習慣于測量靜止的細胞，因為要使單個細胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細胞和細胞團塊次流過狹窄管道容易造成較大的細胞和細胞團塊的淤阻的淤阻。Crosland Taylor根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的研究認識到：管中軸線流過的鞘液中流動規(guī)律的研究認識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體動力聚集作用。于是設計了一個流動室，使流體動力聚集作用。于是設計了一個流動室，使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線

3、附近流過，待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在作層液。外層包圍著鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細胞術中的液流技術基礎。這就奠定了現(xiàn)代流式細胞術中的液流技術基礎。二，流式細胞術的發(fā)展史19561956年，CoulterCoulter 在多年研究的基礎上利用 CoulterCoulter 效應生產(chǎn)了效應生產(chǎn)了Coulter 計數(shù)器。其基本原理是：使細計數(shù)器。其基本原理是：使細胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質(zhì)之間存胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特在著導電性上的差異，便會影響小孔道

4、的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強度和性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強度和個數(shù)則可獲得有關細胞大小和數(shù)目方面的信息。個數(shù)則可獲得有關細胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年年 Holm等設計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染等設計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細胞，再由光電檢測設備計數(shù)的裝置。色的細胞，再由光電檢測設備計數(shù)的裝置。1973年年 Steinkamp設計了一種利用激光激發(fā)雙色設計了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標記的細胞，既能分析計數(shù)，又能進行熒光色素標記的細胞，既能分析計數(shù)，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計數(shù)計數(shù)技術的主要歷

5、程。技術的主要歷程?，F(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術是從組織化學發(fā)源的源的，其開拓者是其開拓者是Kamentsky。1965年，他在組織年，他在組織化學的基礎上提出了兩個新設想化學的基礎上提出了兩個新設想1）細胞的組分是可以用光光度學來定量測定的，）細胞的組分是可以用光光度學來定量測定的，即分光光度術可以定量地獲得有關細胞組織化學即分光光度術可以定量地獲得有關細胞組織化學的重要信息。的重要信息。2）細胞的不同組分可以同時進行多參數(shù)測量，從）細胞的不同組分可以同時進行多參數(shù)測量，從而可以對細胞進行分類。換句話說，對同一細胞而可以對細胞進行分類。換句話說，對同一細胞可以同時獲得有關不同組分的多方面的

6、信息，用可以同時獲得有關不同組分的多方面的信息，用作鑒別細胞的依據(jù)。作鑒別細胞的依據(jù)。流式細胞術在細胞化學中的應用的先驅(qū)者是Van Dilla和和美國的美國的Los Alamos小組。他們在小組。他們在1967年研制出流液束、年研制出流液束、照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細胞計的基照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細胞計的基礎上，首次用熒光礎上，首次用熒光Feulgen反應對反應對DNA染色顯示出染色顯示出DNA的活的活性與熒光之間存在著線性關系，并在性與熒光之間存在著線性關系，并在DNA的直方圖上清楚的直方圖上清楚地顯示出細胞周期的各個時相。地顯示出細胞周期的各個時相。Goh

7、de 和和Dittrich接著把這接著把這項技術推向?qū)嵱?，他們用流式細胞術測定細胞周期借以研項技術推向?qū)嵱茫麄冇昧魇郊毎g測定細胞周期借以研究細胞藥代動力學問題。究細胞藥代動力學問題。FCM用于免疫組織化學中的關鍵用于免疫組織化學中的關鍵是對細胞進行免疫熒光染色，其它和在細胞化學的應用并是對細胞進行免疫熒光染色，其它和在細胞化學的應用并沒有多大差異。沒有多大差異。流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計數(shù)技術，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術等。數(shù)技術，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術等。三，流式細胞術的基本原理及應用一一） 流式細胞術（流式細胞術

8、（FCMFCM）是一種可以對細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)）是一種可以對細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)進行快速測量的新型分析技術和分選技術。進行快速測量的新型分析技術和分選技術。1 1，其基本原理是將懸浮分散的單細胞懸液，經(jīng)特，其基本原理是將懸浮分散的單細胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放入樣品管。異熒光染料染色后，放入樣品管。2 2，在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品中的單細胞懸液形成，在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品中的單細胞懸液形成樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，沿流動室的軸心向樣品流垂直進入流式細胞儀的流動室，沿流動室的軸心向下流動，流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形成包繞下流動，流動室軸心至外壁的鞘液也向下流動，形

9、成包繞細胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓細胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交相交點稱為測量區(qū)。相交相交點稱為測量區(qū)。3 3，染色的細胞經(jīng)照射發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別，染色的細胞經(jīng)照射發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生光散射。這些信號分別被呈被呈90900 0角方向放置的光電倍增管熒光檢測器和前向角放置的光電角方向放置的光電倍增管熒光檢測器和前向角放置的光電二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電子信號后，經(jīng)膜二極管散射光檢測器接收，經(jīng)過轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電子信號后，經(jīng)

10、膜/ /數(shù)轉(zhuǎn)換輸入計算機。數(shù)轉(zhuǎn)換輸入計算機。4 4，計算機通過相應的軟件儲存，計算，分析這些數(shù)字化信息，就，計算機通過相應的軟件儲存，計算，分析這些數(shù)字化信息，就可以得到細胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性質(zhì)等物理和可以得到細胞的大小和活性，核酸含量，酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標。生化指標。二）三）流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的工作原理n參數(shù)測量原理：流式細胞儀可以同時進行參數(shù)測量原理：流式細胞儀可以同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號和非熒光散射信號。和非熒光散射信號。n樣品分選原理：流式細胞儀的分選功能是樣品分選原理：流式細胞儀的分選

11、功能是由細胞分選器來完成的。由細胞分選器來完成的。n數(shù)據(jù)處理原理：數(shù)據(jù)處理原理：FCMFCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖（histogram)histogram)，二維點圖，二維點圖（dotplotdotplot），二維高等圖（），二維高等圖（contourcontour），假三），假三維圖（維圖（pseudo 3Dpseudo 3D）和列表模式（）和列表模式（list modelist mode）等。等。四，T T細胞亞群的檢測1，實驗內(nèi)容，實驗內(nèi)容：流式細胞術檢測CD4+，CD8+T細胞。2，實驗原理，實驗原理（1 1）：T淋巴細胞具有高度的異質(zhì)性，根據(jù)

12、其表面的標志和功能特征，可分為若干個亞群，各亞群之間相互調(diào)節(jié)，共同發(fā)揮其免疫學功能。因此，對淋巴細胞亞群數(shù)量的檢測能反映機體的免疫功能狀態(tài)。本次實驗用流式細胞術檢測CD4+,CD8+T細胞。（流式細胞術原理見前面流式細胞術的基本原理及應用）實驗原理（2 2） T淋巴細胞表面的淋巴細胞表面的CD分子與相應熒光素直分子與相應熒光素直接標記的抗人接標記的抗人CD分子分子McAb結(jié)合后，細胞表結(jié)合后，細胞表面形成帶有熒光色素的抗原抗體復合物。經(jīng)面形成帶有熒光色素的抗原抗體復合物。經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出與熒光素相對應的特定波長激光激發(fā)后發(fā)出與熒光素相對應的特定波長的熒光，其熒光強度與被測的熒光，其熒光強度與被

13、測CD分子表達密度分子表達密度成正比例關系，由此通過流式細胞儀課檢測成正比例關系，由此通過流式細胞儀課檢測結(jié)合含有相應熒光素標記抗體的陽性細胞百結(jié)合含有相應熒光素標記抗體的陽性細胞百分率。分率。 3實驗材料：實驗材料：（1）,肝素抗凝人全血肝素抗凝人全血（2）,熒光標記單克隆抗體：抗人熒光標記單克隆抗體：抗人CD4-FITC,抗人抗人CD8-PE(美國美國BD公司產(chǎn)公司產(chǎn) 品）品）（3）,細胞洗液（含細胞洗液（含1%FCS的的PBS)（4）,紅細胞裂解液紅細胞裂解液（5）,細胞固定液細胞固定液 （25%戊二醛戊二醛3.2ml， 葡萄糖葡萄糖2.0g加無血清細胞洗液至加無血清細胞洗液至 100m

14、l）。）。 . .（6）,FACS緩沖液緩沖液 1 PBS 950ML FCS 40ml 10%疊氮鈉溶液疊氮鈉溶液 10ml .（7）,儀器緩沖液（儀器緩沖液（FACS-flow),FACS清潔液（清潔液（FACS clean)和和FACS洗凈液洗凈液（FACS rinse)由儀器廠家提供。由儀器廠家提供。（8）,流式細胞儀。流式細胞儀。（9）離心機，吸管，試管等。）離心機，吸管，試管等。4，實驗步驟n 混勻抗凝全血，加混勻抗凝全血，加100ul全血于試管中，分別加入抗人全血于試管中，分別加入抗人CD4-FITC,CD8-PE單克隆熒光抗體各單克隆熒光抗體各10ul，用振蕩器混勻，用振蕩器混

15、勻，避光放置避光放置1530min（室溫（室溫200C250C)n 加入溶血素加入溶血素2ml溶解紅細胞，與振蕩器上混勻，室溫避溶解紅細胞，與振蕩器上混勻，室溫避光放置光放置10min，1000rpm離心離心10min，棄上清液。，棄上清液。n 加入加入PBS緩沖液（有緩沖液（有0.1%的的NaN3）1ml洗細胞，洗細胞，1000rpm離心離心10min，傾去上清液，加入固定液，傾去上清液，加入固定液300ul重懸細胞，重懸細胞，BD-FACBCalibur流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測。n 細胞的吸入，將裝有細胞的細胞的吸入，將裝有細胞的FACS測定管放置到機器吸管測定管放置到機器吸管孔處，

16、先預檢測樣品，然后進行實際檢測。課根據(jù)細胞孔處，先預檢測樣品，然后進行實際檢測。課根據(jù)細胞的濃度選擇測定的速度（低，中或高）。所有的數(shù)據(jù)將的濃度選擇測定的速度（低，中或高）。所有的數(shù)據(jù)將自動存入微機。自動存入微機。5使用后的清洗n 將裝將裝FACS清潔液的清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入管放置機器吸管孔，高速吸入1minn 將裝將裝FACS洗凈液的洗凈液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入管放置機器吸管孔，高速吸入1minn 再將裝再將裝FACS清潔液的清潔液的FACS管放置機器吸管孔，高速吸入管放置機器吸管孔，高速吸入5minn 同樣再將裝同樣再將裝FACS洗凈液的洗凈液的FACS

17、管放置機器吸管孔，高速管放置機器吸管孔，高速吸入吸入5minn 最后將一裝有雙蒸水的最后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機器吸管孔，關閉機管放置機器吸管孔，關閉機器。器。n 將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。6 6，F(xiàn)CMFCM分析n 7 7，結(jié)果判斷：n如上圖所示，CD3+T細胞占細胞總數(shù)的66.82%，其中CD4+T細胞占51.59%，CD8+T T細胞占14.83% 。8 8，注意事項：確保細胞懸液上機檢測前濃度為1 110105 5/ /mlml, ,細胞濃度過低直接影響檢測結(jié)果。使用蛋白封閉劑，封閉非特異結(jié)合實際位點，常用的蛋白封閉劑為0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。設置對照樣品，采用與抗體來源同型匹配的