第5章 基因組序列詮釋5 +1強(qiáng)伯勤

1、第五章 基因組序列詮釋問 題v基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？v基因組作為一個整體如何行使其功能？v用什么方法尋找基因，研究基因地功能呢？1. 尋找基因1.1 根據(jù)開放讀框預(yù)測基因 起始密碼子 ATGv第一個ATG的確定(依據(jù)Kozak規(guī)則); Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果. 所謂Kozak規(guī)則，即第一個ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計(jì)規(guī)律.Kozak規(guī)則: 若將第一個ATG中的堿基A，T，G分別標(biāo)為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1)第4位的偏好堿基為G；(2)ATG的5端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)

2、除-3，-6和-9位，在整個側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。 信號肽分析軟件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP ) 把預(yù)測過程中證實(shí)含完整mRNA 5端的序列翻譯為蛋白序列; 然后用SignalP軟件對前50個氨基酸序列(從第一個ATG對應(yīng)的甲硫氨酸Met開始)進(jìn)行評估，如果SignalP分析給出正面結(jié)果，則測試序列有可能為信號肽; 信號肽分析 終止密碼子 終止密碼子: TAA，TAG，TGA GC% = 50% 終止密碼子每 64 bp出現(xiàn)一次； GC% 50% 終止密碼子每100200 bp 出現(xiàn)一次； 由于多數(shù)基因 ORF 均多于50個

3、密碼子，因此最可能的選擇應(yīng)該是 ORF 不少于100 個密碼子。 3端的確認(rèn) 3端的確認(rèn)主要根據(jù)Poly(A)尾序列,若測試DNA片段不含Poly(A)序列，則根據(jù)加尾信號序列“AATAAA”和BLAST同源性比較結(jié)果共同判斷。 非編碼序列、內(nèi)含子高等真核生物ORF閱讀的復(fù)雜性：基因間存在大量的非編碼序列（人類基因組中是70%）絕大多數(shù)基因含有非編碼的內(nèi)含子。 高等真核生物多數(shù)外顯子長度少于100 個密碼子，有的不到50個密碼子甚至更少；不能根據(jù)ORF長度判斷讀框的準(zhǔn)確性。u編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。u不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異： 如

4、人類基因中， 丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA,GCC或GCT,而GCG很少 蘇氨酸（Thr）密碼子多為ACA,ACC或ACT,而ACG很少 密碼子偏愛性 密碼子偏愛性 高等植物207個基因u單子葉植物53個，6個單子葉種群，18種氨基酸有16種氨基酸的密碼子搖擺堿基為G+Cu雙子葉植物154個，35個雙子葉種群，只有7種氨基酸的搖擺堿基是G+C，其余均為A+Tu密碼子偏倚 codon bias，原因不明。 外顯子內(nèi)含子邊界外顯子內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征：p如:內(nèi)含子的5端或稱供體位（donor site）常見的順序?yàn)?5AGGTAAGT-3；p3端又稱受體位（accep

5、tor site), 多為5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；p但是由于邊界序列常有例外，僅適用于一定范圍。上游控制序列 幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達(dá)。 通過同源性比較來預(yù)測mRNA的5端，最常用的與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫是真核啟動子數(shù)據(jù)庫(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http:/www.epd.unil.ch/ )。 另外個別生物基因組的特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動物基因組許多基因的上游都有CpG島。 內(nèi)含子和外顯子

6、序列差異內(nèi)含子受選擇壓力小，突變多。由于堿基C 到A，內(nèi)含子A/T比例高內(nèi)含子A/T比例高，所以終止密碼子出現(xiàn)的頻率高。 軟件預(yù)測 采用NCBI的ORF預(yù)測軟件 ( ORF finder: /gorf/orfig.cgi )判斷ORF的可能范圍?；蜃⑨屲浖蜃⑨屲浖Genscan 重于信號指令：起始密碼、終止密重于信號指令：起始密碼、終止密碼、剪接受體位和供體位序列等碼、剪接受體位和供體位序列等vFgeneSH 重于內(nèi)容指令：密碼子使用偏好、重于內(nèi)容指令：密碼子使用偏好、內(nèi)含子外顯子的差異等內(nèi)含子外顯子的差異等vTWINSCAN和和SG

7、P2根據(jù)相似性和一致性根據(jù)相似性和一致性基因注釋軟件缺點(diǎn)基因注釋軟件缺點(diǎn)v外顯子注釋的準(zhǔn)確率外顯子注釋的準(zhǔn)確率 25%v同源性：homology起源于同一祖先但序列已經(jīng)發(fā)生變異的序列，分布在不同物種間的同源基因，只有是與非的區(qū)別。v一致性：identity同源DNA序列的同一堿基位置上相同的堿基成員，或者蛋白質(zhì)中同一氨基酸位置相同的氨基酸成員的比例，用%表示。v相似性：similarity 同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例。比較比較氨基酸和基因的同源性？氨基酸和基因的同源性？分子雜交分子雜交可確定可確定DNA片段是否含有表達(dá)順序片段是否含有表達(dá)順序Northern

8、blot：指將待測指將待測DNA樣品標(biāo)記后與樣品標(biāo)記后與RNA雜交，以判斷雜交，以判斷RNA中是否含有中是否含有DNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。但在操作中存在一些問題產(chǎn)物。但在操作中存在一些問題1.3 試驗(yàn)確認(rèn)基因試驗(yàn)確認(rèn)基因1977年年J.C.Alwin首創(chuàng)首創(chuàng)Northern blotting 問題問題解決方案解決方案A 某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行可可變剪接變剪接或該基因?yàn)槟骋换蛟摶驗(yàn)槟骋欢嗷嗷蚣易逡蚣易宓某蓡T時，會出現(xiàn)多的成員時，會出現(xiàn)多個雜交帶個雜交帶設(shè)計(jì)其他實(shí)驗(yàn)區(qū)分設(shè)計(jì)其他實(shí)驗(yàn)區(qū)分心肌特異性蛋白問題問題解決方案解決方案B 基因的表達(dá)具有組織特異性基因的表達(dá)具有組織特異

9、性及發(fā)育階段的差別，而選擇及發(fā)育階段的差別，而選擇的的RNA樣品中不一定含有該樣品中不一定含有該基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物盡可能多地收集各種不盡可能多地收集各種不同發(fā)育時期及不同組織同發(fā)育時期及不同組織器官的器官的RNA問題問題解決方案解決方案C 某些基因產(chǎn)物豐度極低或某些基因產(chǎn)物豐度極低或不易提取不易提取適當(dāng)適當(dāng)提高提高RNA上樣量上樣量，或先以已知的或先以已知的DNA序列序列設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物從從mRNA中中擴(kuò)擴(kuò)增增基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物C 基因表達(dá)產(chǎn)物豐度的問題擬擬Northern 雜交雜交 根據(jù)已知的DNA順序設(shè)計(jì)引物，從mRNA群體中擴(kuò)增基因產(chǎn)物，再以DNA為探針與之雜交。動物園雜交動物園雜交 根據(jù)親

10、緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。vDNA順序中基因位置的確定順序中基因位置的確定 cDNA測序受兩個方面的影響：測序受兩個方面的影響：一是相關(guān)一是相關(guān)cDNA在在cDNA文庫中出現(xiàn)的頻率；文庫中出現(xiàn)的頻率；二是二是cDNA的完整性的完整性如何獲取基因全長如何獲取基因全長cDNAcDNA序列？序列？A cDNA A cDNA 文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建B RACE B RACE 技術(shù)技術(shù)干擾cDNA篩選基因的因素：v目標(biāo)cDNA所占比例很低分成亞群進(jìn)行篩選cDNA均一化 v影響cDNA測序的因素與mRNA的反轉(zhuǎn)錄有關(guān)cDNA文庫構(gòu)建(CLONTECH)cDNA文庫

11、構(gòu)建(CLONTECH)5RACE(CLONTECH)3RACE(CLONTECH)確定DNA順序中基因的位置A 通過對全長cDNA序列的測序、對比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B 通過物種已建立遺傳圖和物理圖來確定基因的位置；利用計(jì)算機(jī)分析基因功能利用計(jì)算機(jī)分析基因功能2、基因功能的預(yù)測、基因功能的預(yù)測2.1 2.1 同源性確定基因功能同源性確定基因功能2.2 2.2 同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用2.1 2.1 同源性確定基因功能同源性確定基因功能 種間同源種間同源基因或基因或直系基因直系基因（orthologous gene）：）：

12、指不同物種之間的同源基因，它們來自物種分化指不同物種之間的同源基因，它們來自物種分化以前的共同祖先以前的共同祖先 種內(nèi)同源種內(nèi)同源基因或基因或平行平行基因（基因（paralogous gene） 同同一物種內(nèi)的同源基因，它們常常是多基因家族的一物種內(nèi)的同源基因，它們常常是多基因家族的不同成員不同成員同源基因一般不會有同源基因一般不會有完全一致完全一致的核苷酸序列，因?yàn)椴煌牡暮塑账嵝蛄?，因?yàn)椴煌幕蚧虿煌纳锒紩?dú)立地發(fā)生隨機(jī)突變，但它們有相似的基因或不同的生物都會獨(dú)立地發(fā)生隨機(jī)突變，但它們有相似的序列，大部分未突變的核苷酸序列，大部分未突變的核苷酸位置位置是是相同相同的的 同源性分析可以

13、給出整個基因或其中某一區(qū)段功能的有關(guān)同源性分析可以給出整個基因或其中某一區(qū)段功能的有關(guān)信息信息2.2 2.2 同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用v酵母基因組大約含有酵母基因組大約含有6000個基因個基因v30是通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到的是通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析得到的v另外另外70是用同源性分析獲得是用同源性分析獲得3.1 3.1 基因基因失活失活在基因功能分析的作用在基因功能分析的作用3.2 3.2 基因的基因的超表達(dá)超表達(dá)用于功能檢測用于功能檢測3、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能、實(shí)驗(yàn)確認(rèn)基因功能3.1.1 基因剔除(knock-out) 最簡便的基因失活的方法. 主要原理:

14、在一段無關(guān)DNA 片段的兩側(cè)連接與代換基因兩兩側(cè)側(cè)相同的順序，將這一構(gòu)建導(dǎo)入目的細(xì)胞，由于同同源片段之間的重組源片段之間的重組，可使無關(guān)片段取代靶基因無關(guān)片段取代靶基因,整合到染色體中。為了便于篩選，用于取代的外源DNA中含有報告基因含有報告基因。3.1 基因失活在基因功能分析的作用基因失活在基因功能分析的作用tk 胸苷激酶標(biāo)記基因 gangcyclovirneor 新霉素抗性基因G4183.1.2反義反義RNA 反義RNA是由基因的負(fù)鏈編碼，可與正義RNA (sense RNA)或DNA 編碼順序結(jié)合，干擾mRNA 的轉(zhuǎn)錄，加工和轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控基因的表達(dá)。v構(gòu)建反義RNA 表達(dá)載體: 將全目的基

15、因或部分目的基因反向插入表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化目標(biāo)生物 獲得轉(zhuǎn)基因個體或品系 分析轉(zhuǎn)基因植株在生理、生化、形態(tài)等方面的變異 判別目的基因的功能p3301-HbF(11030bp)300bpHbF35S proNco ISpe I Bst EIIp3301-HbR(11030bp)300bpHbR35S proNco IBst EII正義表達(dá)載體反義表達(dá)載體v反義反義RNA 作用機(jī)理：作用機(jī)理： A 干擾翻譯的起始與延伸干擾翻譯的起始與延伸，可與翻譯起始順序及，可與翻譯起始順序及編碼序列結(jié)合形成雙鏈編碼序列結(jié)合形成雙鏈RNA，隨之被細(xì)胞降解。，隨之被細(xì)胞降解。 B 與與mRNA 的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖

16、體的附的引導(dǎo)順序結(jié)合，阻止核糖體的附著，使著，使翻譯無法啟動翻譯無法啟動。 C 反義反義RNA與與mRNA形成雙鏈分子后，使形成雙鏈分子后，使RNA多聚酶脫離模板，多聚酶脫離模板，轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止。3.1.3 RNA干涉 RNAi是通過是通過雙鏈雙鏈RNA的介導(dǎo)的介導(dǎo),特異性地降特異性地降解相應(yīng)序列的解相應(yīng)序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制.RNAi 作用機(jī)理A dsRNA核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶Dicer被激活，它把被激活，它把dsRNA加工加工成成2125 個核苷酸長的個核苷酸長的RNA鏈；鏈；B 這些小片段這些小片段R

17、NA(siRNA)作為另一個核糖核酸復(fù)合作為另一個核糖核酸復(fù)合體體RISC(RNA-induce silencing complex,RNA誘誘導(dǎo)沉默復(fù)合體導(dǎo)沉默復(fù)合體)的指引物，結(jié)合到的指引物，結(jié)合到RISC上，使之識上，使之識別并降解別并降解mRNA，從而導(dǎo)致與雙鏈，從而導(dǎo)致與雙鏈RNA同源的基因同源的基因沉默；沉默；vRNAi設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用A Fraser 合成合成與開放讀碼框相對應(yīng)的雙鏈與開放讀碼框相對應(yīng)的雙鏈RNA或利用或利用細(xì)菌克隆表達(dá)細(xì)菌克隆表達(dá)這些雙鏈這些雙鏈RNA微量注微量注射和喂食射和喂食干擾同源基因的表達(dá)干擾同源基因的表達(dá)B Chuang B Chuang

18、等設(shè)計(jì)出嵌合體結(jié)構(gòu)等設(shè)計(jì)出嵌合體結(jié)構(gòu) 連接強(qiáng)啟動連接強(qiáng)啟動子大量表達(dá)雙鏈子大量表達(dá)雙鏈mRNAmRNA干擾同源基因的表達(dá)干擾同源基因的表達(dá)HbF基因的基因的RNAi載體構(gòu)建載體構(gòu)建RNAi技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)vRNAi最根本的特點(diǎn)是特異性最根本的特點(diǎn)是特異性vRNAi具有特殊的具有特殊的穿越能力穿越能力，而且干擾作用會，而且干擾作用會傳給傳給后代后代；vRNAi對一些低水平表達(dá)的基因的對一些低水平表達(dá)的基因的RNAi現(xiàn)象并不明現(xiàn)象并不明顯，而且?guī)讉€有相同或相似序列的基因，顯，而且?guī)讉€有相同或相似序列的基因，RNAi也也會同時作用與它們。會同時作用與它們。3.2 基因超表達(dá)基因超表達(dá)v增加基因的增加基因

19、的拷貝數(shù)拷貝數(shù)v采用采用強(qiáng)啟動子強(qiáng)啟動子促使基因促使基因超表達(dá)超表達(dá)構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變庫構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變庫酵母雙雜交（酵母雙雜交（yeast two-hybridization）3.3 其他方法其他方法3.3.1 轉(zhuǎn)座子插入突變轉(zhuǎn)座子插入突變 上世紀(jì)三十年代，上世紀(jì)三十年代，玉米遺傳學(xué)家玉米遺傳學(xué)家 Barbara McClintock在研究中在研究中發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了玉米籽粒色斑玉米籽粒色斑不穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象，不穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象，可能是一種可轉(zhuǎn)移的可能是一種可轉(zhuǎn)移的遺傳因子。遺傳因子。1944：美國國家科：美國國家科學(xué)院院士學(xué)院院士1945：美國遺傳學(xué)：美國遺傳學(xué)會主席會主席1983：Nobel Prize

20、 ，35年后將年后將轉(zhuǎn)位因轉(zhuǎn)位因子的重大發(fā)現(xiàn)歸功子的重大發(fā)現(xiàn)歸功于她于她McClintock（1902-1992） Ac和和Ds這兩個因子都位于玉米的第九號染色體短臂，這兩個因子都位于玉米的第九號染色體短臂，在在色素基因色素基因C的附近。的附近。Ac因子因子全長全長4.5kb，有，有5個外顯子，其產(chǎn)物是個外顯子，其產(chǎn)物是轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)座酶。Ac因子兩端是長因子兩端是長11bp的反向重復(fù)序列的反向重復(fù)序列(IR)； Ds因子因子長長0.4-4kb，它的中間，它的中間(在在轉(zhuǎn)座酶基因中轉(zhuǎn)座酶基因中)有許多有許多種長度不等的缺失種長度不等的缺失, Ds的兩端也都有的兩端也都有11bp的反向重復(fù)序列。的反向

21、重復(fù)序列。 Ac-Ds轉(zhuǎn)座元件結(jié)構(gòu)示意圖。右邊示Ac及Ds元件的單鏈DNA末端反向重復(fù)配對所形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可能對轉(zhuǎn)座有意義玉米轉(zhuǎn)座因子對胚乳顏色的影響玉米轉(zhuǎn)座因子對胚乳顏色的影響 35S Ac轉(zhuǎn)座酶 NPTII IAAHAc GUS NPTII IAAHDsE IAAHDsG GUS NPTII IAAH 吲哚乙酸水解酶，NAM（ 萘乙酰胺）敏感35S Ac轉(zhuǎn)座酶 NPTII IAAHAc GUS NPTII IAAHDsE IAAHDsG GUS NPTII 增強(qiáng)子捕獲 GUS NPTII E E E 外顯子 GUS NPTII 內(nèi)含子 基因捕獲外顯子 GUS NPTII 外顯子外顯子突變體庫構(gòu)建載體策略A、插入突變隱性、插入突變隱性突變體庫構(gòu)建存在問題B、冗余基因的存在、冗余基因的存在3.3.2酵母雙雜交（酵母雙雜交（yeast two-hybridization）轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNA binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activation domain) 1