放射免疫技術(shù)

1、人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社免疫學(xué)檢驗免疫學(xué)檢驗人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第十九章第十九章 放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社1.放射免疫技術(shù)的基本概念及類型放射免疫技術(shù)的基本概念及類型2.放射標(biāo)記物的鑒定與純化。放射標(biāo)記物的鑒定與純化。3.RIA和和IRMA的測定原理及關(guān)鍵技術(shù)。的測定原理及關(guān)鍵技術(shù)。4.RIA和和IRMA的臨床應(yīng)用與評價的臨床應(yīng)用與評價本章要點本章要點人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社目錄目錄 放射性核素和放射性標(biāo)記物的制備放射性核素和放射性標(biāo)記物的制備1放射免疫分析性放射免疫分析性2免疫放射分析免疫放射分析3人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 放射免疫技術(shù)放射免疫

2、技術(shù)是將放射性核素高敏感的示蹤特點是將放射性核素高敏感的示蹤特點和抗原抗體反應(yīng)的高特異性特點相結(jié)合的一種體和抗原抗體反應(yīng)的高特異性特點相結(jié)合的一種體外測定超微量物質(zhì)的新技術(shù)。外測定超微量物質(zhì)的新技術(shù)。 其基本模式是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，其基本模式是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，通過免疫反應(yīng)進行定量測定。通過免疫反應(yīng)進行定量測定。 具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好、樣品及試具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，在醫(yī)劑用量少、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用。學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用。 放射免疫技術(shù)根據(jù)其方法學(xué)原理的不同主要有兩

3、放射免疫技術(shù)根據(jù)其方法學(xué)原理的不同主要有兩種類型：種類型：RIARIA和和IRMAIRMA。 前前 言言人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第一節(jié)第一節(jié) 放射性核素和放射性標(biāo)記物的制備放射性核素和放射性標(biāo)記物的制備 放射性核素作為放射性免疫技術(shù)的標(biāo)記物，放射性核素作為放射性免疫技術(shù)的標(biāo)記物，選擇何種放射性核素以及如何制備放射標(biāo)選擇何種放射性核素以及如何制備放射標(biāo)記物（將放射性核素與抗原或抗體連接），記物（將放射性核素與抗原或抗體連接），是建立放射免疫技術(shù)的基礎(chǔ)。是建立放射免疫技術(shù)的基礎(chǔ)。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社一、一、放射性核素的基本知識放射性核素的基本知識 基本概念基本概念指在自然條件下可發(fā)生自

4、發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種放射性核素轉(zhuǎn)變成另一種放射性核素，并同時放射性核素轉(zhuǎn)變成另一種放射性核素，并同時釋放射線（釋放射線（、），又稱為放射性衰變。），又稱為放射性衰變。 基本類型基本類型 依據(jù)其衰變方式依據(jù)其衰變方式 衰變、衰變、衰變、衰變、衰變衰變 最常用的放射性核素是最常用的放射性核素是125125I I 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社125125I I的優(yōu)點的優(yōu)點 化學(xué)性質(zhì)比較活潑，標(biāo)記方法簡單，且容易獲得化學(xué)性質(zhì)比較活潑，標(biāo)記方法簡單，且容易獲得 高比活性的標(biāo)記物；高比活性的標(biāo)記物； 在衰變過程中產(chǎn)生在衰變過程中產(chǎn)生射線，便于測量且效率高；射線，便于測

5、量且效率高； 半衰期適中（半衰期適中（6060天左右），且廢棄物較容易處理。天左右），且廢棄物較容易處理。125125I I的缺點的缺點 用用125125I I取代取代H H，可能使原物質(zhì)免疫活性受到影響；，可能使原物質(zhì)免疫活性受到影響； 易因發(fā)生輻射損傷而使標(biāo)記抗原變性；易因發(fā)生輻射損傷而使標(biāo)記抗原變性； 作為商品化試劑的產(chǎn)品貨架期較短。作為商品化試劑的產(chǎn)品貨架期較短。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社放射性核素放射活性的檢測放射性核素放射活性的檢測利用射線照射閃爍體（利用射線照射閃爍體（NaINaI晶體），導(dǎo)致晶體晶體），導(dǎo)致晶體分子激發(fā)，在退激發(fā)時，閃爍體發(fā)出一定波長分子激發(fā)，在退激發(fā)時，閃爍

6、體發(fā)出一定波長的熒光；再由光電倍增管將極微弱的熒光轉(zhuǎn)換的熒光；再由光電倍增管將極微弱的熒光轉(zhuǎn)換成光電子并放大成光電子并放大107107倍；從光電倍增管輸出的倍；從光電倍增管輸出的電信號經(jīng)過放大器放大，經(jīng)單道分析器甄別處電信號經(jīng)過放大器放大，經(jīng)單道分析器甄別處理，并在定標(biāo)器上顯示。理，并在定標(biāo)器上顯示。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社二、二、放射性核素標(biāo)記抗原抗體方法放射性核素標(biāo)記抗原抗體方法 主要包括主要包括間接標(biāo)記法間接標(biāo)記法直接標(biāo)記法（氯胺直接標(biāo)記法（氯胺T法）法）人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社125125I I- -125125I I或或125125I I+ +125125I-I-標(biāo)記物標(biāo)記

7、物（混合物）（混合物）Ch-TCh-T、LPOLPO氧化氧化取代反應(yīng)取代反應(yīng)（一）直接標(biāo)記法（一）直接標(biāo)記法氯胺氯胺T T法（法（C Ch-Th-T） 氯胺氯胺T T將將125125I I的的I I氧化氧化為為I I+ +，I I+ +取代蛋白質(zhì)取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形酪氨酸苯環(huán)的氫，形成穩(wěn)定的放射標(biāo)記物成穩(wěn)定的放射標(biāo)記物（二碘酪氨酸），最（二碘酪氨酸），最后加入偏重亞硫酸鈉后加入偏重亞硫酸鈉（還原劑）終止反應(yīng)。（還原劑）終止反應(yīng)。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社使用無還原劑的使用無還原劑的高比放射性碘源高比放射性碘源被標(biāo)記物用量要被標(biāo)記物用量要少少C Ch-Th-T用量要低用量要低控制總反應(yīng)

8、體積控制總反應(yīng)體積200l200l反應(yīng)時間反應(yīng)時間1 1分鐘分鐘2 2分鐘分鐘弱堿性反應(yīng)條件弱堿性反應(yīng)條件 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社（二）間接標(biāo)記法（二）間接標(biāo)記法預(yù)先將預(yù)先將125125I I用用C Ch-Th-T法標(biāo)法標(biāo)記琥珀酰胺酯，制成的記琥珀酰胺酯，制成的125125I I 化脂功能基團可與化脂功能基團可與蛋白分子上的氨基酸殘蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng)，從而使待標(biāo)記基反應(yīng)，從而使待標(biāo)記物被碘化。物被碘化。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社三、三、放射標(biāo)記物的純化與鑒定放射標(biāo)記物的純化與鑒定 （一）放射標(biāo)記物的純化（一）放射標(biāo)記物的純化因游離的因游離的125125I I與與125125I

9、 I標(biāo)記抗原（抗標(biāo)記抗原（抗體）分子的大小體）分子的大小相差懸殊，故采相差懸殊，故采用凝膠層析即可用凝膠層析即可進行分離純化進行分離純化 聚合、聚合、損傷物損傷物 標(biāo)記蛋白標(biāo)記蛋白游離游離125125I I人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社比放射活性比放射活性 高比放射性高比放射性高純度高純度完整免疫活性完整免疫活性放射化學(xué)純度放射化學(xué)純度單位標(biāo)記物單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射記物上的放射性占總放射性性占總放射性的百分率的百分率應(yīng)大于應(yīng)大于95% 95% 免疫活性免疫活性標(biāo)記物與抗體標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力結(jié)合的能力標(biāo)記物與過量標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比抗體反應(yīng)百分比該值越大該值越大

10、, , 標(biāo)標(biāo)記物免疫活性好記物免疫活性好 （二）放射標(biāo)記物的鑒定（二）放射標(biāo)記物的鑒定人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社計算法計算法自身置換法自身置換法 比放射活性比放射活性單位化學(xué)量標(biāo)記單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性物中所含的放射性強度強度單位：單位：Ci/g Ci/g mCi/mg mCi/mg Ci/mmol Ci/mmol 比放射性過高，比放射性過高，將影響標(biāo)記物免疫將影響標(biāo)記物免疫活性活性 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社比放射性計算法比放射性計算法 結(jié)果欠準(zhǔn)，計算簡便結(jié)果欠準(zhǔn)，計算簡便依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標(biāo)記率）依據(jù)標(biāo)記反應(yīng)中放射性核素的利用率（標(biāo)記率）來計算標(biāo)記物的比放射性來

11、計算標(biāo)記物的比放射性. .人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社比放射性自身置換法比放射性自身置換法比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來測定比較標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原的免疫活性來測定標(biāo)記物的比放射性。標(biāo)記物的比放射性。作一條常規(guī)的作一條常規(guī)的RIARIA標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)體系包括定標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)體系包括定量標(biāo)記抗原、不同濃度的非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品抗原、量標(biāo)記抗原、不同濃度的非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品抗原、限量抗體；同時另作一條不加非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品、限量抗體；同時另作一條不加非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品、只加抗體和不同劑量的標(biāo)記抗原的自身置換曲只加抗體和不同劑量的標(biāo)記抗原的自身置換曲線。線。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 自身置換曲線自身置換曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線

12、標(biāo)準(zhǔn)曲線 反應(yīng)平衡后，測定反應(yīng)平衡后，測定B/T%B/T%。若從兩條曲線上取一點相同的若從兩條曲線上取一點相同的B/T%B/T%，則（標(biāo)記物則（標(biāo)記物+ +標(biāo)準(zhǔn)品）標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品）標(biāo)準(zhǔn)曲線= =（標(biāo)記物）（標(biāo)記物）自身置換曲線。由此便可直接計算自身置換曲線。由此便可直接計算標(biāo)記抗原的含量，并進一步求得比標(biāo)記抗原的含量，并進一步求得比放射活性放射活性 。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 自身置換法測定標(biāo)記化合物的比放射活性，只自身置換法測定標(biāo)記化合物的比放射活性，只適用于適用于RIARIA的標(biāo)記抗原。使用時應(yīng)注意：的標(biāo)記抗原。使用時應(yīng)注意： 標(biāo)記物與未標(biāo)記物對抗體（受體）的親和力標(biāo)記物與未標(biāo)記物對抗

13、體（受體）的親和力 應(yīng)相同；應(yīng)相同； 非特異性結(jié)合應(yīng)較小，且計算時應(yīng)扣除；非特異性結(jié)合應(yīng)較小，且計算時應(yīng)扣除； 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線時，操作步驟制備標(biāo)準(zhǔn)曲線與自身置換曲線時，操作步驟 應(yīng)相同，特別是應(yīng)相同，特別是B B與與F F分離的條件要一致分離的條件要一致。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第二節(jié)第二節(jié) 放射免疫分析放射免疫分析 放射免疫分析（放射免疫分析（RIARIA）是以放射性核素標(biāo)）是以放射性核素標(biāo)記的抗原（記的抗原（AgAg* *）與未標(biāo)記抗原（）與未標(biāo)記抗原（AgAg）競爭）競爭結(jié)合特異抗體（結(jié)合特異抗體（AbAb）來對待檢樣品中的抗）來對待檢樣品中的抗原進行定量測定的一種技術(shù)。

14、原進行定量測定的一種技術(shù)。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社一、檢測原理一、檢測原理 RIARIA屬于競爭性分析，屬于競爭性分析，其基本原理是由于其基本原理是由于AgAg* *和和AgAg（待測物（待測物Ag)Ag)對特對特異性抗體具有相同的結(jié)異性抗體具有相同的結(jié)合力，當(dāng)三者同時存在合力，當(dāng)三者同時存在于同一反應(yīng)體系時，于同一反應(yīng)體系時，AgAg* *和和AgAg相互競爭結(jié)合相互競爭結(jié)合特異性抗體。特異性抗體。 AgAg* *和和AgAg具有等同的具有等同的與與AbAb結(jié)合能力結(jié)合能力人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社AbAb限量，限量，AgAg* *定量定量, ,AgAg* *和和AgAg的量大于的量大

15、于AbAb結(jié)合位點，二者結(jié)合位點，二者通過競爭方式與通過競爭方式與AbAb結(jié)合；隨著結(jié)合；隨著AgAg增加，增加，AgAg* *與與AbAb結(jié)合形成結(jié)合形成AgAg* *AbAb復(fù)合物的放復(fù)合物的放射量降低射量降低, ,二者變化二者變化成函數(shù)關(guān)系。成函數(shù)關(guān)系。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社( (標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)Ag/Ag/樣品樣品Ag)Ag)二、方法與類型二、方法與類型 非平衡法，即標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣非平衡法，即標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣本）和特異性抗體，優(yōu)先使非標(biāo)記抗本）和特異性抗體，優(yōu)先使非標(biāo)記抗原與特異性抗體達到平衡，然后再加原與特異性抗體達到平衡，然后再加入標(biāo)記抗原競爭與抗體結(jié)合。入標(biāo)記抗原競爭與

16、抗體結(jié)合。兩種類型兩種類型平衡法，即標(biāo)記抗原、標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或平衡法，即標(biāo)記抗原、標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣本）、特異性抗體同時加入反應(yīng)待檢樣本）、特異性抗體同時加入反應(yīng)體系中。體系中。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社三、關(guān)鍵技術(shù)三、關(guān)鍵技術(shù) 抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)分離結(jié)合標(biāo)記物（分離技術(shù)）分離結(jié)合標(biāo)記物（分離技術(shù)）放射性測定放射性測定數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社AgAg* *AgAg反應(yīng)條件反應(yīng)條件體積體積溫度溫度時間時間pHpHAbAb( (標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)Ag/Ag/樣品樣品Ag)Ag)（一）抗原抗體反應(yīng)（一）抗原抗體反應(yīng) 牢固牢固的抗的抗原抗原抗體復(fù)體復(fù)合物合物人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版

17、社二抗體沉淀法二抗體沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 試劑法試劑法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分離徹底，迅速分離徹底，迅速分離試劑和過程不分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響影響 操作應(yīng)簡單、重復(fù)操作應(yīng)簡單、重復(fù)性好性好經(jīng)濟經(jīng)濟 （二）分離結(jié)合標(biāo)記物（二）分離結(jié)合標(biāo)記物 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社晶體閃爍計數(shù)器晶體閃爍計數(shù)器 包括了包括了NaINaI閃爍晶閃爍晶 體、光電倍增管體、光電倍增管 以及計數(shù)器以及計數(shù)器測量的放射性信測量的放射性信 號是儀器輸出的號是儀器輸出的 電脈沖數(shù)：每分電脈沖數(shù)：每分 鐘計數(shù)鐘計數(shù)(cpm)(cpm) 參

18、數(shù)參數(shù)cpmcpmB/T (%)B/T (%)F/T (%)F/T (%)B/F (%)B/F (%)B/BB/B0 0 (%)(%)注：注：T T即是即是B B與與F F的總和的總和（三）數(shù)據(jù)處理（三）數(shù)據(jù)處理 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社RIARIA由于具有敏感度高、特異性強、精密度高、由于具有敏感度高、特異性強、精密度高、重復(fù)性好、用血量少、可測定小分子量和大分子重復(fù)性好、用血量少、可測定小分子量和大分子量物質(zhì)等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)檢驗中應(yīng)用極為廣泛，常量物質(zhì)等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)檢驗中應(yīng)用極為廣泛，常用于各種激素和藥物等的測定。用于各種激素和藥物等的測定。但由于放射性核素的放射性對人體

19、會產(chǎn)生一定但由于放射性核素的放射性對人體會產(chǎn)生一定的危害性，且其廢物的儲存和銷毀會對環(huán)境造成的危害性，且其廢物的儲存和銷毀會對環(huán)境造成污染，因此操作時必須加以注意。污染，因此操作時必須加以注意。四、評價與應(yīng)用四、評價與應(yīng)用 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第三節(jié)第三節(jié) 免疫放射分析免疫放射分析 免疫放射分析（免疫放射分析（IRMAIRMA）是從放射免疫分析是從放射免疫分析（RIARIA）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核素標(biāo)記免疫）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核素標(biāo)記免疫測定，其特點為用核素標(biāo)記的抗體直接與測定，其特點為用核素標(biāo)記的抗體直接與待檢抗原反應(yīng)，并用固相免疫吸附劑作為待檢抗原反應(yīng)，并用固相免疫吸附劑作為B B或

20、或F F的分離手段。的分離手段。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社一、檢測原理一、檢測原理 IRMA屬于非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)，其基本檢測屬于非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)，其基本檢測 原理是將放射性核素（原理是將放射性核素（125I）標(biāo)記在抗體上，并）標(biāo)記在抗體上，并 用過量的標(biāo)記抗體與待測抗原進行非競爭性結(jié)合用過量的標(biāo)記抗體與待測抗原進行非競爭性結(jié)合 反應(yīng)，并采用固相免疫吸附方式對反應(yīng)，并采用固相免疫吸附方式對B和和F進行分離。進行分離。檢測免疫復(fù)合物的放射性，從而得到待檢樣本的檢測免疫復(fù)合物的放射性，從而得到待檢樣本的 濃度。濃度。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社二、方法與類型二、方法與類型 （一）單位點（一

21、）單位點 IRMAIRMA人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社（二）雙位點（二）雙位點 IRMAIRMA人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社三、關(guān)鍵技術(shù)三、關(guān)鍵技術(shù) 抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)分離技術(shù)分離技術(shù)放射性測定放射性測定數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社AbAb* *AgAgAbAb( (待檢待檢Ag)Ag)（一）抗原抗體反應(yīng)（一）抗原抗體反應(yīng) 固相固相抗原抗原抗體抗體復(fù)合復(fù)合物物*牢固牢固的抗的抗原抗原抗體復(fù)體復(fù)合物合物人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社固相固相吸附吸附分離技術(shù)分離技術(shù) （二）分離技術(shù)（二）分離技術(shù) 一般采用物理吸附法：用碳酸鹽緩沖液將預(yù)一般采用物理吸附法：用碳酸鹽緩沖液將預(yù)包被抗

22、體稀釋到包被抗體稀釋到3g/ml10g/ml，室溫過夜，室溫過夜，棄包被緩沖液（含有未結(jié)合物質(zhì)和過剩標(biāo)記棄包被緩沖液（含有未結(jié)合物質(zhì)和過剩標(biāo)記物），并洗滌去掉結(jié)合不牢固抗體，從而達物），并洗滌去掉結(jié)合不牢固抗體，從而達到分離的目的；然后，再加入到分離的目的；然后，再加入1%牛血清白牛血清白蛋白溶液，封閉、保存?zhèn)溆?。蛋白溶液，封閉、保存?zhèn)溆?。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社晶體閃爍計數(shù)器晶體閃爍計數(shù)器 包括了包括了NaINaI閃爍晶閃爍晶 體、光電倍增管體、光電倍增管 以及計數(shù)器以及計數(shù)器測量的放射性信測量的放射性信 號是儀器輸出的號是儀器輸出的 電脈沖數(shù)：每分電脈沖數(shù)：每分 鐘計數(shù)鐘計數(shù)(cpm)(cpm) 參數(shù)參數(shù)cpmcpmB/T (%)B/T (%)F/T (%)F/T (%)B/F (%)B/F (%)B/BB/B0 0 (%)(%)注：注：T T即是即是B B與與F F的總和的總和（三）數(shù)據(jù)處理（三）數(shù)據(jù)處理 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社IRMA的優(yōu)點的優(yōu)點 效率高、操作簡效率高、操作簡便便 靈敏度高靈敏度高