轉(zhuǎn)基因小鼠技--術(shù)

1、 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù) -轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建2基因打靶的簡(jiǎn)易程序基因打靶的簡(jiǎn)易程序3優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高外源基因整合情況的可控性高可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)、定位、可預(yù)先在細(xì)胞水平檢測(cè)外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性外源基因?qū)胪庠椿驅(qū)隕SES細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便選方便缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：ESES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持維持ESES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個(gè)體為嵌合體所得個(gè)體為嵌合體胚胎干細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞（E

2、SES細(xì)胞）法細(xì)胞）法2022-6-1942022-6-195主要是利用反轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列主要是利用反轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)(LTR)區(qū)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的特點(diǎn)域具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子活性的特點(diǎn), ,將外源基因連接到將外源基因連接到LTRLTR下游進(jìn)行基因重組后下游進(jìn)行基因重組后, ,再包裝成為高滴度病毒顆再包裝成為高滴度病毒顆粒粒, ,去去直接感染受精卵或顯微注入囊胚腔直接感染受精卵或顯微注入囊胚腔中中, ,攜帶外攜帶外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒DNADNA可以可以整合到宿主染色體整合到宿主染色體上。上。3 3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法63 3、逆轉(zhuǎn)錄病毒

3、感染法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)由于反轉(zhuǎn)錄病毒的高效率感染和在宿主細(xì)胞由于反轉(zhuǎn)錄病毒的高效率感染和在宿主細(xì)胞DNADNA中的中的高度整合特性高度整合特性, , 大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率大大提高基因轉(zhuǎn)移的效率細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運(yùn)載至細(xì)菌中細(xì)菌質(zhì)粒和噬菌體載體只能將目的基因運(yùn)載至細(xì)菌中擴(kuò)增和表達(dá)。病毒載體是較理想的真核基因工程載體擴(kuò)增和表達(dá)。病毒載體是較理想的真核基因工程載體缺點(diǎn)缺點(diǎn)獲得純合體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的機(jī)會(huì)少獲得純合體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的機(jī)會(huì)少病毒載體構(gòu)建復(fù)雜病毒載體構(gòu)建復(fù)雜轉(zhuǎn)入的外源基因的大小受到限制轉(zhuǎn)入的外源基因的大小受到限制, 10kb, 300kb300kb。F F因子（因子（

4、F F質(zhì)粒）是一種質(zhì)粒）是一種“性質(zhì)粒性質(zhì)粒”，可轉(zhuǎn)移至，可轉(zhuǎn)移至F F- -宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞。100kb,100kb,近百個(gè)蛋白質(zhì)。近百個(gè)蛋白質(zhì)?？蓸?gòu)建可構(gòu)建BACBAC文庫(kù)；文庫(kù)；有單一的有單一的loxploxp位點(diǎn)，利于圖譜分析（借助標(biāo)記位點(diǎn)，利于圖譜分析（借助標(biāo)記loxploxp和和crecre 重組酶；重組酶； BACBAC載體兩端有載體兩端有Sp6Sp6和和T7 T7 引物序列利于測(cè)序，確定基因的引物序列利于測(cè)序，確定基因的 染色體定位；染色體定位；可穩(wěn)定遺傳，易于操作。可穩(wěn)定遺傳，易于操作。BAC文庫(kù)：基因組酶切后100300kbDNA+BAC大腸桿菌2022-6-1914方法

5、顯微注射核移植胚胎干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒基因敲除精子介導(dǎo)優(yōu)點(diǎn)外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長(zhǎng)度可達(dá)100Kb轉(zhuǎn)基因效率高；預(yù)測(cè)基因表達(dá)水平；可以使用定點(diǎn)整合技術(shù)外源DNA的整合率高； 整合在生殖細(xì)胞中的比例也很高。 可在整合點(diǎn)整合轉(zhuǎn)移基因的單個(gè)拷貝； 該方法簡(jiǎn)單、方便 缺點(diǎn)精密儀器， 技術(shù)操作較難，易造成宿主動(dòng)物基因組的插入突變供體細(xì)胞易衰老ES細(xì)胞株不易建立，長(zhǎng)期培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是嵌合體 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在動(dòng)物各種組織中的分布不均 應(yīng)用具有一定局限性有些結(jié)果不能重復(fù) 基因轉(zhuǎn)移方法的比較基因轉(zhuǎn)移方法的比較2022-6-1915Elec

6、troporation2022-6-19162022-6-19172022-6-19182022-6-19192022-6-19201234562022-6-19211256432022-6-19222022-6-19232022-6-19242022-6-1925 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)-轉(zhuǎn)基因小鼠在科研中的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠在科研中的應(yīng)用2022-6-19261.1. 7500萬(wàn)萬(wàn)1.25億年前億年前 - 人鼠始祖人鼠始祖小鼠的歷史小鼠的歷史2.2. 19世紀(jì)世紀(jì) - 寵物鼠寵物鼠-實(shí)驗(yàn)鼠的實(shí)驗(yàn)鼠的“先驅(qū)先驅(qū)”3.3. 1897年年 - 重組表型重組表型 2022-6-19274. 19

7、00年年 - 從寵物鼠到實(shí)驗(yàn)鼠從寵物鼠到實(shí)驗(yàn)鼠Abbie Lathrop-飼養(yǎng)寵物鼠飼養(yǎng)寵物鼠1902年，年，William Ernest Castle購(gòu)買老鼠，用于遺傳購(gòu)買老鼠，用于遺傳學(xué)研究。哈佛大學(xué)學(xué)研究。哈佛大學(xué)-老鼠的毛色進(jìn)行觀察，以檢測(cè)老鼠的毛色進(jìn)行觀察，以檢測(cè)孟德爾法則的正確性。孟德爾法則的正確性。小鼠的歷史小鼠的歷史5. 1905年年 - 孟德爾老鼠孟德爾老鼠 通過對(duì)黃白相間的雜色鼠進(jìn)行研究，法國(guó)遺傳學(xué)家通過對(duì)黃白相間的雜色鼠進(jìn)行研究，法國(guó)遺傳學(xué)家Lucien Claude Cuno 發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)攜帶黃色皮毛基因發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)攜帶黃色皮毛基因的老鼠之間交配，其子代老鼠中黃色老鼠和白色

8、老的老鼠之間交配，其子代老鼠中黃色老鼠和白色老鼠的數(shù)量比總是鼠的數(shù)量比總是2:1。-這是報(bào)道的第一個(gè)等位純合這是報(bào)道的第一個(gè)等位純合致死的基因。致死的基因。 2022-6-1928Clarence Cook Little是一個(gè)來自于是一個(gè)來自于William Castle 實(shí)驗(yàn)室的哈佛大學(xué)生物學(xué)家，他培育實(shí)驗(yàn)室的哈佛大學(xué)生物學(xué)家，他培育出了第一個(gè)近親繁殖的小鼠株系出了第一個(gè)近親繁殖的小鼠株系DBA。 小鼠的歷史小鼠的歷史6. 1909年年 - 實(shí)驗(yàn)鼠的誕生實(shí)驗(yàn)鼠的誕生Clarence Little 和和 Ernest Tyzzer 發(fā)現(xiàn)在同一株系小鼠間進(jìn)行腫瘤移植不發(fā)現(xiàn)在同一株系小鼠間進(jìn)行腫瘤

9、移植不會(huì)產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，但不同株系間的移植則會(huì)發(fā)生排斥反應(yīng)。會(huì)產(chǎn)生排斥現(xiàn)象，但不同株系間的移植則會(huì)發(fā)生排斥反應(yīng)。 7. 1916年年 - 腫瘤易受性和組織相容性腫瘤易受性和組織相容性 Jackson實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)室的George Snell在在1940年代發(fā)現(xiàn)了組織相容性基因年代發(fā)現(xiàn)了組織相容性基因-榮榮獲了獲了1980年的年的諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng) 2022-6-19298. 1921年年 - C57BL株系株系 基因組基因組測(cè)序在測(cè)序在2002年完成年完成 小鼠的歷史小鼠的歷史9. 1929年年 - Jackson 實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室 -世界上最重要的小鼠遺傳學(xué)研究中心世界上最重要的小鼠遺傳學(xué)研究中心 在

10、在Hudson 汽車公司的頭目汽車公司的頭目Edsel Ford和和Roscoe Jackson兩位大財(cái)主的資助下，兩位大財(cái)主的資助下，Charence Little 在美國(guó)緬因州在美國(guó)緬因州Bar Harbor 建立了建立了Jackson 實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室 2022-6-193010. 1953年年 - DNA雙螺旋雙螺旋Crick，Watson和和Wilkins三人因?yàn)檫@項(xiàng)三人因?yàn)檫@項(xiàng)杰出的成就榮獲了杰出的成就榮獲了1962年的年的諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)。 11. 1966年年 - 遺傳密碼破譯遺傳密碼破譯 Robert Holly，Har Gobind Khorana 和和 Marshall Ni

11、renberg 破破譯了遺傳密碼譯了遺傳密碼-1968年的年的諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng) 小鼠的歷史小鼠的歷史2022-6-193112. 1972年年 - 小鼠遺傳學(xué)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)小鼠遺傳學(xué)的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù) Jackson 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了第一個(gè)哺乳動(dòng)物遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了第一個(gè)哺乳動(dòng)物遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù) 13. 1977年年 - Sanger 測(cè)序法測(cè)序法 和同事和同事Walter Gilbert分享了分享了1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)-人類和小鼠人類和小鼠基因基因組組測(cè)序過程中的主要技術(shù)測(cè)序過程中的主要技術(shù) 14. 1982年年 - 轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因小鼠小鼠 小鼠的歷史小鼠的歷史202

12、2-6-193216. 1987-89年年 - 第一只基因敲除小鼠第一只基因敲除小鼠 Martin Evans，Oliver Smithies 和和 Mario Capecch 領(lǐng)導(dǎo)的幾領(lǐng)導(dǎo)的幾個(gè)研究小組個(gè)研究小組- 2001獲得了獲得了Lasker獎(jiǎng)獎(jiǎng) 17. 1996年年 - “百慕大法則百慕大法則” 公共公共基因組基因組序列數(shù)據(jù)序列數(shù)據(jù) 18. 1998年年 - 克隆鼠克隆鼠 1997年克隆羊年克隆羊“多莉多莉”誕生之后，夏威夷的一個(gè)小組培育出了誕生之后，夏威夷的一個(gè)小組培育出了第一批克隆鼠第一批克隆鼠“Cumulina”和她的姐妹們。和她的姐妹們。 15. 1983年年 - PCR K

13、ary Mullis -1993年的年的諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng) 小鼠的歷史小鼠的歷史2022-6-193319. 1999年年 - 小鼠小鼠基因組基因組測(cè)序協(xié)會(huì)測(cè)序協(xié)會(huì)人類人類基因組基因組三個(gè)主要測(cè)序中心（三個(gè)主要測(cè)序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute, The Whitehead Center for Genome Research 和和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一個(gè)相互協(xié)作的小鼠）成立了一個(gè)相互協(xié)作的小鼠基因基因組組測(cè)序機(jī)構(gòu)，取名為小鼠測(cè)序機(jī)構(gòu)，取名為小鼠基因組基因組測(cè)序協(xié)會(huì)（測(cè)

14、序協(xié)會(huì)（Mouse Genome Sequencing Consortium ,MGSC) 20. 2001年年2月月 - 人類人類基因組基因組 21. 2001年年6月月 - 散彈法散彈法美國(guó)公司美國(guó)公司Celera Genomics 使用散彈法測(cè)得了使用散彈法測(cè)得了用于銷售的小鼠序列草圖。散彈法是一種一用于銷售的小鼠序列草圖。散彈法是一種一次性測(cè)得次性測(cè)得基因組基因組全序列的技術(shù)。全序列的技術(shù)。 小鼠的歷史小鼠的歷史2022-6-193422. 2002年年5月月 - 16號(hào)染色體與已被分析的人類號(hào)染色體與已被分析的人類 21號(hào)染色體序列高度相似號(hào)染色體序列高度相似23. 2002年年8月

15、月 - 小鼠小鼠基因組基因組物理圖譜物理圖譜 24. 2002年年12月月 - 小鼠小鼠基因組基因組小鼠小鼠基因組基因組測(cè)序協(xié)會(huì)發(fā)表了一份高質(zhì)量的小鼠測(cè)序協(xié)會(huì)發(fā)表了一份高質(zhì)量的小鼠基因組基因組序列草圖，序列草圖，并且同時(shí)對(duì)并且同時(shí)對(duì)C57BL/6J小鼠株系做了分析。這個(gè)小鼠株系做了分析。這個(gè)基因組基因組大小約為大小約為2.5Gb，比人類，比人類基因組基因組要小，預(yù)計(jì)的基因也少于要小，預(yù)計(jì)的基因也少于30000個(gè)。約有個(gè)。約有40%的小鼠和人類的小鼠和人類基因組基因組序列相高度似性，序列相高度似性，80%的人類基因在小的人類基因在小鼠鼠基因組基因組中能找到相應(yīng)的基因。同時(shí)還有不少文章對(duì)小鼠遺傳組

16、中能找到相應(yīng)的基因。同時(shí)還有不少文章對(duì)小鼠遺傳組成的其它方面做了詳細(xì)討論。在日本成的其它方面做了詳細(xì)討論。在日本RIKEN 基因組基因組科學(xué)實(shí)驗(yàn)室科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的努力下，很多相關(guān)的重要資源都能夠被免費(fèi)獲取。的努力下，很多相關(guān)的重要資源都能夠被免費(fèi)獲取。 小鼠的歷史小鼠的歷史2022-6-1935轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的應(yīng)用基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究基因工程定向育種基因工程定向育種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制 人類疾病小鼠模型與基因治療人類疾病小鼠模型與基因治療藥理學(xué)研究藥理學(xué)研究器官移植器官移植環(huán)境科學(xué)研究環(huán)

17、境科學(xué)研究2022-6-1936基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究基因表達(dá)調(diào)控、基因功能及發(fā)育調(diào)控作用的研究Hox gene(Hox gene(同源異形盒基因）同源異形盒基因）疾病基因疾病基因?qū)W習(xí)與記憶基因?qū)W習(xí)與記憶基因生理周期基因生理周期基因基因表達(dá)有時(shí)空與組織的特異性；外源基因的表達(dá)受特異性有關(guān)順式作用序列的調(diào)控；2022-6-1937基因工程定向育種基因工程定向育種向動(dòng)物體轉(zhuǎn)移外源基因并使之在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，向動(dòng)物體轉(zhuǎn)移外源基因并使之在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，能夠克服物種間固有的生殖隔離，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物育種能夠克服物種間固有的生殖隔離，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物育種之間遺傳物質(zhì)的交換。之間遺傳物質(zhì)的交換。實(shí)質(zhì)是將基

18、因轉(zhuǎn)移與傳統(tǒng)育種方法結(jié)合，各取其實(shí)質(zhì)是將基因轉(zhuǎn)移與傳統(tǒng)育種方法結(jié)合，各取其精華，快速創(chuàng)造新的目的變異和固定擴(kuò)展變異，精華，快速創(chuàng)造新的目的變異和固定擴(kuò)展變異，從而快速培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗逆動(dòng)物品種。從而快速培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗逆動(dòng)物品種。轉(zhuǎn)基因羊、豬、雞、魚、鼠等2022-6-1938轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器概念：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器概念： 將具某種重要應(yīng)用價(jià)值的生物活性蛋白基因?qū)雽⒕吣撤N重要應(yīng)用價(jià)值的生物活性蛋白基因?qū)雱?dòng)物受精卵或早期胚胎，培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使外動(dòng)物受精卵或早期胚胎，培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使外源基因在動(dòng)物的特定組織內(nèi)高效表達(dá)，再?gòu)倪@些源基因

19、在動(dòng)物的特定組織內(nèi)高效表達(dá)，再?gòu)倪@些組織的分泌液、浸出液或血清中分離提取目的基組織的分泌液、浸出液或血清中分離提取目的基因產(chǎn)物。因產(chǎn)物。乳腺乳腺-理想器官理想器官 腎臟和膀胱腎臟和膀胱多肽藥物、蛋白質(zhì)疫苗、酶類多肽藥物、蛋白質(zhì)疫苗、酶類細(xì)菌-動(dòng)物細(xì)胞-轉(zhuǎn)基因動(dòng)物2022-6-1939乳腺生物反應(yīng)器具有以下特點(diǎn)：乳腺生物反應(yīng)器具有以下特點(diǎn)：乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達(dá)的蛋白質(zhì)不回流到血液循乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達(dá)的蛋白質(zhì)不回流到血液循 環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物本身的影響；環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物本身的影響；乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器；乳腺組織是一種有效的蛋白

20、質(zhì)合成器；一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250300Kg，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白2530Kg。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達(dá)的蛋乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達(dá)的蛋 白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性白經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性 接近天然產(chǎn)品；接近天然產(chǎn)品；在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖 生產(chǎn)群體。生產(chǎn)群體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制2022-6-1940轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制轉(zhuǎn)基

21、因動(dòng)物生物反應(yīng)器研制乳腺組織特異表的基因：乳腺組織特異表的基因：具具milk boxmilk box保守序列保守序列 -乳清蛋白基因乳清蛋白基因-b b乳球蛋白基因乳球蛋白基因-酪蛋白基因酪蛋白基因已開發(fā)的產(chǎn)物：已開發(fā)的產(chǎn)物：-血栓治療藥物血栓治療藥物（組織型纖溶酶原激活因子) - -出血性疾病（出血性疾?。蜃覸III，IX）-免疫治療藥物免疫治療藥物（IFN，IL，TNF）-營(yíng)養(yǎng)制劑營(yíng)養(yǎng)制劑(人乳鐵蛋白）2022-6-1941人類疾病小鼠模型與基因治療人類疾病小鼠模型與基因治療癌癥癌癥-肺癌肺癌-p53-p53功能缺陷功能缺陷遺傳病遺傳病-地中海貧血地中海貧血（臨床失敗-細(xì)胞表達(dá)？）AD -對(duì)AD患者死亡后腦部解剖發(fā)現(xiàn)腦部存積了一種淀粉狀蛋白 -將人類淀粉狀蛋白的基因轉(zhuǎn)到大鼠體內(nèi)使其發(fā)病， 再清除淀粉狀蛋白，發(fā)現(xiàn)能夠減