第十章高效液相色譜法

1、1第十章第十章 高效液相色譜法高效液相色譜法2高效液相色譜法：高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法。一、一、HPLC與經(jīng)典與經(jīng)典LC區(qū)別區(qū)別二、二、HPLC與與GC差別差別三、特點三、特點3主要區(qū)別：主要區(qū)別：固定相、輸液設(shè)備和檢測手段固定相、輸液設(shè)備和檢測手段1經(jīng)典經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 柱效低（H，n） 常壓輸送流動相 分析周期長 無法在線檢測2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 柱效高（H，n） 高壓輸送流動相 分析時間大大縮短 可以在線檢測 色譜泵進(jìn)

2、樣器 檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)4相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測 主要差別：主要差別：分析對象、流動相、操作條件分析對象、流動相、操作條件的差別的差別1分析對象分析對象 GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品， 高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品不可檢測高聚物的樣品不可檢測 占有機物的占有機物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，溶解后能制成溶液的樣品， 不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制 分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及

3、高分子分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子 和離子型樣品均可檢測和離子型樣品均可檢測 用途廣泛，用途廣泛，占有機物的占有機物的80%52流動相差別流動相差別GC：流動相為惰性氣體，流動相為惰性氣體，組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用 輸送流動相壓力為220MPaHPLC：流動相為液體，流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用 輸送流動相壓力為0.10.5MPa3操作條件差別操作條件差別 GC：加溫操作加溫操作 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）6三、三、HPLC的特點和應(yīng)用的特點和應(yīng)用“

4、三高三高” “一快一快” “一廣一廣”高柱效n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機化合物，廣泛用于中藥成分分離）7第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀國產(chǎn)P600高效液相色譜儀安捷倫1260高效液相色譜儀8高效液相色譜儀組成高效液相色譜儀組成高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 9液相色譜流程圖液相色譜流程圖 色譜泵進(jìn)樣器 檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)10一、高壓輸液系統(tǒng)一、高壓輸液系統(tǒng)1、 貯液器貯液器（1）作用：）作用：提供足夠數(shù)量的符合要求的流動相以完成分析工作。（2）要求：）要求：必須有足夠的容積，以備重復(fù)分析

5、時保證供液；脫氣方便；能耐一定壓力；所用的材質(zhì)對所使用的溶劑都是惰性的。配有溶劑過濾器 2、 脫氣裝置脫氣裝置（1）作用：）作用：防止流動相從高壓柱流出時，釋放氣泡進(jìn)入檢測器而使噪音劇增。（2）方法：）方法：吹氦脫氣 超聲波脫氣 真空脫氣123、 高壓輸液泵高壓輸液泵 關(guān)鍵部件之一。（1）作用：）作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜分離系統(tǒng)。（2）要求：）要求： 泵體材料能耐化學(xué)腐蝕；能在高壓（3060MPa）下連續(xù)工作；輸出流量穩(wěn)定（ 1%），無脈沖，重復(fù)性高（ 0.5%） ，而且輸出流量范圍寬；適用于梯度洗脫。（3）類型：）類型：恒壓泵、恒流泵。輸液泵操作注意事項：輸液泵操作注意事項

6、：防止固體微粒進(jìn)入泵體防止固體微粒進(jìn)入泵體流動相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)流動相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完不超過規(guī)定的最高壓力不超過規(guī)定的最高壓力流動相一般應(yīng)該先脫氣流動相一般應(yīng)該先脫氣154、梯度洗脫裝置、梯度洗脫裝置（1）作用：）作用：縮短時間，使各組分完全分離。（2）類型：）類型：高壓梯度：高壓梯度：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。低壓梯度：低壓梯度：一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。16（二）（二） 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使

7、用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。 準(zhǔn)備狀態(tài)準(zhǔn)備狀態(tài) 進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)17進(jìn)樣方法進(jìn)樣方法1.1.手動進(jìn)樣手動進(jìn)樣 準(zhǔn)備狀態(tài)準(zhǔn)備狀態(tài) 進(jìn)樣狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)18進(jìn)樣方法進(jìn)樣方法1.1.自動進(jìn)樣（自動進(jìn)樣器）自動進(jìn)樣（自動進(jìn)樣器）19 （三）分離系統(tǒng)（三）分離系統(tǒng)主要部件為色譜柱，一般柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑減小填料粒度和柱徑以提高柱效。色譜柱及柱溫箱20（四）檢測系統(tǒng)（四）檢測系統(tǒng)1、紫外檢測器紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對大部分有機化應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。合物有響應(yīng)?？勺儾ㄩL紫外檢測器（可變波長紫外檢測器（UVD）適于：適于：吸收紫外光的物

8、質(zhì)。特點：特點：靈敏度高； 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm10mm，容積 8L）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。氘燈氘燈190-600nm光柵光柵流通池流通池測量測量光電二極管光電二極管參比參比光電二極管光電二極管分束器分束器21光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器(DAD) 紫外檢測器的重要進(jìn)展；紫外檢測器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。222、蒸發(fā)光檢測器蒸發(fā)光檢測器(ELSD)蒸發(fā)光散射檢測器適合于無紫外吸收、無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。233、示差折光檢測器示差折光檢測器(RID) 除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器。除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器。原理：原理：每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)。可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)折光指數(shù)差值，差值與濃度呈正比。特點：特點：靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。244、熒光檢測器熒光檢測器(FLD)適于