第二章1柱色譜.

1、 第二章第二章 色譜分析色譜分析p柱色譜柱色譜p紙色譜、薄層色譜紙色譜、薄層色譜p氣相色譜氣相色譜p高效液相色譜高效液相色譜1 色譜法概論色譜法概論1.1 色譜分析法的發(fā)展概況色譜分析法的發(fā)展概況(1)色譜法（色譜法（chromatography）：是一種利用物質(zhì)）：是一種利用物質(zhì)的物理化學性質(zhì)建立起來的分離、分析方法。廣的物理化學性質(zhì)建立起來的分離、分析方法。廣泛用于復(fù)雜化合物的分離分析。泛用于復(fù)雜化合物的分離分析。 當流動相流過含有樣品的固定相時，各組分當流動相流過含有樣品的固定相時，各組分以不同的速度移動，從而達到分離。固定相可以以不同的速度移動，從而達到分離。固定相可以是固體，也可以是

2、以被固體或凝膠所支持的液體是固體，也可以是以被固體或凝膠所支持的液體，可以裝入柱中，也可以展成薄層或涂成薄膜。，可以裝入柱中，也可以展成薄層或涂成薄膜。流動相可以是液體，也可以是氣體。流動相可以是液體，也可以是氣體。色譜法的特點：選擇性高；靈敏度高，樣品色譜法的特點：選擇性高；靈敏度高，樣品用量少；分離效率高，分離速度快；應(yīng)用用量少；分離效率高，分離速度快；應(yīng)用范圍廣。范圍廣。 實質(zhì)：分離實質(zhì)：分離目的：目的：定性分析：出峰時間定性分析：出峰時間定量分析：峰面積定量分析：峰面積純度鑒定：出峰數(shù)量純度鑒定：出峰數(shù)量 （2）色譜法的由來：1906年由俄國植物學家Tsweet創(chuàng)立。首先用于植物色素分

3、離。(3)色譜法的發(fā)展色譜法的發(fā)展1931年德國的年德國的Kuhn和和Lederer重復(fù)了重復(fù)了Tswett的某些實驗，用氧化鋁和碳酸鈣的某些實驗，用氧化鋁和碳酸鈣分離了分離了-，-，和，和-胡蘿卜素，此后用這胡蘿卜素，此后用這種方法分離了種方法分離了60多種這類色素。多種這類色素。1938年年Kuhn因研究類胡蘿卜素和維生素獲諾貝因研究類胡蘿卜素和維生素獲諾貝爾化學獎。爾化學獎。30、40年代相繼有了薄層色譜法和紙色年代相繼有了薄層色譜法和紙色譜法。譜法。Martin和和Synge在在1940年提出液液分配色譜法年提出液液分配色譜法，即固定相是吸附在硅膠上的水，流動相是某種有即固定相是吸附在

4、硅膠上的水，流動相是某種有機溶劑。機溶劑。1941年年Martin和和Synge提出用氣體代替提出用氣體代替液體作流動相的可能性，液體作流動相的可能性，11年之后年之后James和和Martin發(fā)表了從理論到實踐比較完整的氣液色譜發(fā)表了從理論到實踐比較完整的氣液色譜方法，因而獲得了方法，因而獲得了1952年的諾貝爾化學獎。年的諾貝爾化學獎。50年代后期出現(xiàn)了氣相色譜年代后期出現(xiàn)了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。60年代末把高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色年代末把高壓泵和化學鍵合固定相用于液相色譜，發(fā)展了高效液相色譜法。譜，發(fā)展了高效液相色譜法。1.2 色譜法基本原理色譜法基本原理 色譜分

5、析的目的：將樣品中各組分彼此色譜分析的目的：將樣品中各組分彼此分離。分離。 兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距兩峰間的距離必須足夠遠，兩峰間的距離是由組分在兩相中的分配系數(shù)決定的，離是由組分在兩相中的分配系數(shù)決定的，與色譜過程的熱力學性質(zhì)有關(guān)。與色譜過程的熱力學性質(zhì)有關(guān)。 兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很兩峰間雖有一定距離，如果每個峰都很寬，以致彼此重疊，仍然不能分離。峰的寬，以致彼此重疊，仍然不能分離。峰的寬窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴散行為寬窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴散行為決定的，即與色譜過程的動力學性質(zhì)有關(guān)決定的，即與色譜過程的動力學性質(zhì)有關(guān)。 1.3 色譜法分類色譜法分類a 按兩相

6、分子的聚集狀態(tài)分按兩相分子的聚集狀態(tài)分 流動相流動相 固定相固定相 類型類型 液體液體 固體固體 液液-固色譜固色譜 液體液體 液體液體 液液-液色譜液色譜 氣體氣體 固體固體 氣氣-固色譜固色譜 氣體氣體 液體液體 氣氣-液色譜液色譜 b 按固定相的使用形式分按固定相的使用形式分柱色譜：柱色譜： 填充柱色譜、毛細管柱色譜填充柱色譜、毛細管柱色譜 平面色譜：平面色譜： 紙色譜、薄層色譜、高分子薄紙色譜、薄層色譜、高分子薄膜色譜膜色譜c 按分離機制分按分離機制分：v分配色譜分配色譜(partition chromatography)：固定相是固定液，利用固定液對各組分分配系數(shù)的大小不同而實現(xiàn)分離

7、。v吸附色譜吸附色譜（adsorption chromatography）：利用吸附劑對各組分的吸附力大小不同而實現(xiàn)分離。v離子交換色譜離子交換色譜(ion exchange chromatography，IEC)：利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而實現(xiàn)分離。v空間排阻色譜空間排阻色譜（steric exclusion chromatography，SEC）：以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同實現(xiàn)物質(zhì)分離。v親和色譜親和色譜：利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力實現(xiàn)生物分子的分離純化。 2 柱色譜柱色譜2.1 吸附柱色譜吸附柱色譜

8、是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。同而使混合物中各組分分離的方法。 特點：吸附劑來源豐富，價格低廉，特點：吸附劑來源豐富，價格低廉，易再生，裝置簡單，具較高分辨率，應(yīng)用易再生，裝置簡單，具較高分辨率，應(yīng)用廣泛。廣泛。a 原理原理 吸附作用：固體表面的分子與固體內(nèi)吸附作用：固體表面的分子與固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相等。部分子所受的吸引力不相等。 吸附、解吸、吸附、解吸、 再吸附、再解吸的過程再吸附、再解吸的過程b 洗脫方法與洗脫曲線洗脫方法與洗脫曲線溶劑洗脫法：采用一種或幾種混合溶劑作為洗脫劑。溶劑洗脫法：采用一種或幾種混合溶劑作為

9、洗脫劑。置換法：所用洗脫劑是一種溶液，該溶液中含有吸附置換法：所用洗脫劑是一種溶液，該溶液中含有吸附力比被吸附物更強的物質(zhì)。力比被吸附物更強的物質(zhì)。前緣洗脫法：連續(xù)向吸附柱內(nèi)加入樣品溶液，即洗脫前緣洗脫法：連續(xù)向吸附柱內(nèi)加入樣品溶液，即洗脫劑為樣品溶液本身。劑為樣品溶液本身。溶劑洗脫法的洗脫曲線溶劑洗脫法的洗脫曲線置換法的洗脫曲線置換法的洗脫曲線前緣洗脫法的洗脫曲線前緣洗脫法的洗脫曲線c 吸附劑和洗脫劑的選擇吸附劑和洗脫劑的選擇 吸附劑的選擇：是吸附層析的關(guān)鍵。吸附劑的選擇：是吸附層析的關(guān)鍵。 分為無機分為無機(氧化鋁、活性炭、硅膠、碳氧化鋁、活性炭、硅膠、碳酸鹽、白土等酸鹽、白土等)和有機吸

10、附劑和有機吸附劑(蔗糖、乳糖蔗糖、乳糖、淀粉、纖維素等、淀粉、纖維素等)。 一般來說，非極性物質(zhì)易被非極性表面一般來說，非極性物質(zhì)易被非極性表面吸附，極性物質(zhì)易被極性表面吸附，溶液吸附，極性物質(zhì)易被極性表面吸附，溶液中溶解度越大的溶質(zhì)越難被吸附。中溶解度越大的溶質(zhì)越難被吸附。選擇吸附劑時，注意選擇吸附劑時，注意:r吸附劑應(yīng)有適當?shù)奈搅?，表面積大；吸附劑應(yīng)有適當?shù)奈搅?，表面積大；r顆粒均勻，在操作時穩(wěn)定，不會破裂；顆粒均勻，在操作時穩(wěn)定，不會破裂；r對被吸附物的吸附應(yīng)是可逆的，即在一定條件下對被吸附物的吸附應(yīng)是可逆的，即在一定條件下可以解吸，以便洗脫；可以解吸，以便洗脫；r對被分離物有足夠的

11、分辨力，即對不同物質(zhì)的吸對被分離物有足夠的分辨力，即對不同物質(zhì)的吸附力有所不同；附力有所不同；r吸附劑不應(yīng)含有雜質(zhì)，否則需經(jīng)預(yù)處理后使用。吸附劑不應(yīng)含有雜質(zhì)，否則需經(jīng)預(yù)處理后使用。如：如：氧化鋁于氧化鋁于400高溫下加熱高溫下加熱6h，除去吸附的水分。，除去吸附的水分。 活性炭于活性炭于150 加熱干燥加熱干燥45h，除去被吸附的氣體。，除去被吸附的氣體。洗脫劑選擇洗脫劑選擇:考慮樣品在溶劑中的溶解度；考慮樣品在溶劑中的溶解度；溶劑一般需無水溶劑，而且不與水互溶；溶劑一般需無水溶劑，而且不與水互溶；溶劑的沸點要適宜，一般以溶劑的沸點要適宜，一般以4080為宜；為宜；不與吸附劑起化學反應(yīng)，不會使

12、吸附劑溶解；不與吸附劑起化學反應(yīng)，不會使吸附劑溶解；洗脫劑的純度要高，免受雜質(zhì)影響；洗脫劑的純度要高，免受雜質(zhì)影響；當一種溶劑對某一物質(zhì)吸附作用過強時，洗脫困當一種溶劑對某一物質(zhì)吸附作用過強時，洗脫困難，過弱時不能產(chǎn)生滿意的色譜圖，可采用多元難，過弱時不能產(chǎn)生滿意的色譜圖，可采用多元混合溶劑系統(tǒng)，調(diào)整洗脫能力?；旌先軇┫到y(tǒng)，調(diào)整洗脫能力。3 分配色譜分配色譜 是利用各組分的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)是利用各組分的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離的方法。分離的方法。v分配系數(shù)：一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的分配系數(shù)：一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度

13、比值。在層析條件確定后溶劑中的濃度比值。在層析條件確定后分配系數(shù)是一常數(shù)。分配系數(shù)是一常數(shù)。 組分在流動相中的濃度組分在固定相中的濃度Kv固定相：多孔性固體支持物（如濾紙、硅固定相：多孔性固體支持物（如濾紙、硅膠、纖維素粉、硅藻土等）吸著一種溶劑膠、纖維素粉、硅藻土等）吸著一種溶劑，此溶劑在層析過程中始終固定在多孔支，此溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。持物上。v流動相：與固定相溶劑互不相溶的溶劑，流動相：與固定相溶劑互不相溶的溶劑，可沿固定相流動?？裳毓潭ㄏ嗔鲃?。 當混合物在流動性攜帶下通過固定相當混合物在流動性攜帶下通過固定相時，由于各組分的分配系數(shù)不同，經(jīng)過多時，由于各組分的分配系

14、數(shù)不同，經(jīng)過多次分配、再分配，分配系數(shù)小的組分先流次分配、再分配，分配系數(shù)小的組分先流出，分配系數(shù)大的組分后流出。出，分配系數(shù)大的組分后流出。4 離子交換柱層析離子交換柱層析 是利用離子交換劑上的可解離基團（是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。到分離目的的一種層析分離方法。4.1 離子交換劑離子交換劑 是含有若干活性基團的不溶性高分子是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制上引入若干可解離基團（活性

15、基團）而制成。成。t按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑分為按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。陽離子交換劑和陰離子交換劑。 引入酸性基團的交換劑可離解出引入酸性基團的交換劑可離解出H+，與其它陽離子交換，屬于陽離子交換劑。與其它陽離子交換，屬于陽離子交換劑。 引入含氨基堿性基團的交換劑，可與引入含氨基堿性基團的交換劑，可與OH-結(jié)合后，與其他陰離子交換，屬于陰結(jié)合后，與其他陰離子交換，屬于陰離子交換劑。離子交換劑。 4.2 離子交換柱層析操作離子交換柱層析操作選擇樹脂選擇樹脂預(yù)處理預(yù)處理裝柱定型裝柱定型上柱上柱洗脫收集洗脫收集再生再生n選擇樹脂：陽離子只能被陽離子交換

16、劑吸附，反之選擇樹脂：陽離子只能被陽離子交換劑吸附，反之；親和力大的易于吸附，難于洗脫，親和力小的難；親和力大的易于吸附，難于洗脫，親和力小的難于吸附，易于洗脫；相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)用交聯(lián)于吸附，易于洗脫；相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)用交聯(lián)度高的樹脂進行交換，分子較大的宜用交聯(lián)度低的度高的樹脂進行交換，分子較大的宜用交聯(lián)度低的交換樹脂，高分子膠體物質(zhì)宜用纖維素類交換劑。交換樹脂，高分子膠體物質(zhì)宜用纖維素類交換劑。n預(yù)處理：使用前用水浸泡預(yù)處理：使用前用水浸泡2h以上使之充分吸水膨脹以上使之充分吸水膨脹。如使用幾次后，雜質(zhì)增加，一般用酸堿處理。如使用幾次后，雜質(zhì)增加，一般用酸堿處理。n裝柱：交換劑必須在

17、柱內(nèi)分布均勻，嚴防有氣泡或裝柱：交換劑必須在柱內(nèi)分布均勻，嚴防有氣泡或裂縫產(chǎn)生。干法和濕法。裂縫產(chǎn)生。干法和濕法。v上柱：離子交換劑經(jīng)轉(zhuǎn)型成所需離子，用上柱：離子交換劑經(jīng)轉(zhuǎn)型成所需離子，用溶劑或緩沖液進行平衡。然后將樣品液加溶劑或緩沖液進行平衡。然后將樣品液加進交換柱。上柱時要注意樣品的進交換柱。上柱時要注意樣品的pH值、溫值、溫度、離子濃度和流速等。度、離子濃度和流速等。v洗脫和收集：原則上洗脫液應(yīng)含有與交換洗脫和收集：原則上洗脫液應(yīng)含有與交換劑的親和力較大的離子，以便把吸附在交劑的親和力較大的離子，以便把吸附在交換劑上的樣品離子交換下來。換劑上的樣品離子交換下來。v梯度洗脫法：按一定規(guī)律變

18、化的洗脫液進梯度洗脫法：按一定規(guī)律變化的洗脫液進行洗脫。濃度梯度，行洗脫。濃度梯度，pH梯度。梯度。v再生：先經(jīng)酸堿處理，然后再進行轉(zhuǎn)型處再生：先經(jīng)酸堿處理，然后再進行轉(zhuǎn)型處理。理。5 凝膠色譜凝膠色譜 又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。5.1 原理原理 運動：垂直向下地移動和無定向地分子擴散運動：垂直向下地移動和無定向地分子擴散運動運動(布朗

19、運動布朗運動)分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng):小分子物質(zhì)自由進入網(wǎng)孔，線路長，移動慢，最小分子物質(zhì)自由進入網(wǎng)孔，線路長，移動慢，最后流出。后流出。大分子物質(zhì)不進入網(wǎng)孔，線路短，移動快，最先大分子物質(zhì)不進入網(wǎng)孔，線路短，移動快，最先流出。流出。大小適中的物質(zhì)，選擇性地進入網(wǎng)孔，按分子大大小適中的物質(zhì)，選擇性地進入網(wǎng)孔，按分子大小有序流出。小有序流出。 為了定量的衡量樣品中各組分的流出順序，為了定量的衡量樣品中各組分的流出順序，常用分配系數(shù)常用分配系數(shù)Ka來度量：來度量：Ka=（VeVo)/ViVe 為洗脫體積，為洗脫體積，Vo為外體積，為外體積，Vi為內(nèi)體積為內(nèi)體積Ka=0時，該組分子完全不進入凝膠顆粒微

20、孔，洗時，該組分子完全不進入凝膠顆粒微孔，洗脫時最先流出；脫時最先流出； Ka=1時，小分子物質(zhì)自由進入網(wǎng)孔，洗脫時最后時，小分子物質(zhì)自由進入網(wǎng)孔，洗脫時最后流出；流出；Ka在在0和和1之間，分子介乎大分子和小分子之間，之間，分子介乎大分子和小分子之間，洗脫時洗脫時Ka值小的先流出，值小的先流出，Ka值大的后流出。值大的后流出。5.2 凝膠地選擇與處理凝膠地選擇與處理 干膠溶漲干膠溶漲(懸浮于懸浮于510倍量的洗脫液中，常倍量的洗脫液中，常溫，熱法溫，熱法/還可達到消毒滅菌和排除凝膠內(nèi)氣還可達到消毒滅菌和排除凝膠內(nèi)氣泡的目的泡的目的)，抽真空去氣泡，配樣品的溶液與，抽真空去氣泡，配樣品的溶液與

21、洗脫液要使用同一溶劑同一緩沖液。裝柱，加洗脫液要使用同一溶劑同一緩沖液。裝柱，加樣與洗脫。樣與洗脫。常用的凝膠：常用的凝膠：p葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠p瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠p聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠p在有機溶劑中使用的凝膠在有機溶劑中使用的凝膠5.3 應(yīng)用應(yīng)用a 蛋白質(zhì)，酶，激素等大分子的分離純化；蛋白質(zhì)，酶，激素等大分子的分離純化；b 蛋白質(zhì)溶液脫鹽，脫糖，脫脂；蛋白質(zhì)溶液脫鹽，脫糖，脫脂；c 蛋白質(zhì)，酶，激素等大分子的分子量測定蛋白質(zhì)，酶，激素等大分子的分子量測定。5 親和色譜親和色譜5.1 原理原理 利用分子與配基之間所具有的專一而又利用分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使分

22、子分離純化的技術(shù)?？赡娴挠H和力，而使分子分離純化的技術(shù)。 酶與底物，酶與競爭性抑制劑，酶與輔酶與底物，酶與競爭性抑制劑，酶與輔助因子，抗原與抗體，助因子，抗原與抗體，RNA與互補的與互補的RNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。因此，親和層析在酶親和力的生物分子對。因此，親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用。的分離純化中有重要應(yīng)用。吸附色譜吸附色譜離子交換色譜離子交換色譜空間排阻色譜空間排阻色譜分配色譜分配色譜定義定義 利用吸附劑對利用吸附劑對各組分的吸附各組分的吸附力不同而實現(xiàn)力不同而實現(xiàn)分離分離 利用離子交換劑上利用離子交換劑上的可解離基團（活的可解離基團（活性基團）對各種離性基團）對各種離子的親和力不同而子的親和力不同而實現(xiàn)分離實現(xiàn)分離 以各種凝膠為固定相，利以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質(zhì)的用流動相中所含各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量不同而實現(xiàn)相對分子質(zhì)量不同而實現(xiàn)物質(zhì)分離物質(zhì)分離 利用各組分的分配系利用各組分的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分