第5章熒光光譜.

1、第第5章章 熒光光譜熒光光譜5.1 基本原理基本原理5.2 熒光探測熒光探測5.3 熒光光譜法的應(yīng)用熒光光譜法的應(yīng)用F 熒光屬于光致發(fā)光熒光屬于光致發(fā)光 F 包括吸收和發(fā)射兩個(gè)過程包括吸收和發(fā)射兩個(gè)過程F 熒光光譜屬于發(fā)射光譜熒光光譜屬于發(fā)射光譜F 光致發(fā)光可以在紫外光致發(fā)光可以在紫外-可見光區(qū)、可見光區(qū)、X射線區(qū)等射線區(qū)等F 我們將關(guān)注紫外我們將關(guān)注紫外-可見光區(qū)，常用于有機(jī)化可見光區(qū)，常用于有機(jī)化合物分析合物分析5.1.1 熒光發(fā)光原理熒光發(fā)光原理光致發(fā)光的能級向下躍遷過程光致發(fā)光的能級向下躍遷過程 無輻射躍遷無輻射躍遷：激發(fā)態(tài)第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級在激發(fā)態(tài)因碰撞以熱的形式損失能量，躍遷

2、到第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級 熒光發(fā)射熒光發(fā)射：第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級基態(tài)能級由第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級躍遷至基態(tài)，光的形式釋放能量，即熒光 磷光發(fā)射磷光發(fā)射：三重態(tài)基態(tài)能級先無輻射躍遷至三重態(tài)，逗留較長時(shí)間后再躍遷至基態(tài)能級，發(fā)射磷光熒光與磷光的區(qū)別熒光與磷光的區(qū)別 從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)的路徑不同 從激發(fā)到發(fā)光的時(shí)間不同，熒光10-910-7s 磷光10-310s (三重態(tài)是亞穩(wěn)態(tài)) 發(fā)光波長不同，熒光波長比磷光波長短5.1.2 熒光光譜與吸收光譜熒光光譜與吸收光譜形狀波長譜帶數(shù)熒光光譜與吸收光譜的比較熒光光譜與吸收光譜的比較 熒光光譜靈敏度高，檢測限可達(dá)ppb量級（10-9） 熒光光譜選擇性

3、好，能吸收光的物質(zhì)不一定能發(fā)射熒光，一定波長下不同物質(zhì)的熒光光譜不同 熒光光譜沒有吸收光譜使用廣泛，許多物質(zhì)不產(chǎn)生熒光，并且熒光對環(huán)境因素非常敏感5.1.3 產(chǎn)生熒光的基本條件產(chǎn)生熒光的基本條件 入射光要能被物質(zhì)粒子吸收，使粒子能夠躍遷到激發(fā)態(tài)，然后經(jīng)第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級，降落到基態(tài)振動(dòng)能級 物質(zhì)粒子要具有高的熒光效率iiAFkkknnFF熒光過程速率常數(shù)，由物質(zhì)粒子本身決定物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與熒光效率物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與熒光效率 具有大共軛雙鍵的分子容易發(fā)射熒光，*躍遷的量子效率高，壽命短（10-910-7 s） 共軛效應(yīng)越大，熒光效率越高，苯 萘 聯(lián)苯 0.18芴聯(lián)苯 取代基也會(huì)影響熒光效率 給電

4、子基(-NH2, OH)會(huì)增強(qiáng)熒光效率（共軛作用） 吸電子基(-NO2, -C=O, -C=NH)會(huì)減弱甚至猝滅熒光 取代基的空間阻礙作用會(huì)減弱熒光5.1.4 影響熒光光譜的因素（外部）影響熒光光譜的因素（外部） 入射光強(qiáng)，熒光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)成正比 溶劑，一般溶劑效應(yīng)，折射率和介電常數(shù)的影響 特殊溶劑效應(yīng)，物質(zhì)分子與溶劑的化學(xué)作用 增大溶劑極性，向長波移動(dòng)，熒光強(qiáng)度增加 溫度，升高溫度 物質(zhì)粒子碰撞增多 減弱熒光 pH值，熒光物質(zhì)本身弱堿或弱酸性時(shí)影響較大 內(nèi)濾光內(nèi)濾光，溶液中存在能吸收熒光的物質(zhì)，減弱熒光 自吸收自吸收，溶液濃度較大時(shí)，部分熒光會(huì)被物質(zhì)本身吸收吸收光譜與熒光強(qiáng)度（激發(fā)的選擇？

5、）吸收光譜與熒光強(qiáng)度（激發(fā)的選擇？）波長波長強(qiáng)度強(qiáng)度吸收光譜吸收光譜波長波長強(qiáng)度強(qiáng)度熒光光譜熒光光譜 吸收強(qiáng)度越大，被激發(fā)到高能級的粒子數(shù)越多，則向下躍遷產(chǎn)生的熒光越強(qiáng)5.2.1 熒光探測裝置熒光探測裝置吸收光譜吸收光譜熒光光譜熒光光譜兩點(diǎn)區(qū)別：在入射光的垂直方向探測1. 探測器前還有一個(gè)單色器F-4500熒光光度計(jì)光路圖（日立）熒光光度計(jì)光路圖（日立）5.2.2 熒光團(tuán)熒光團(tuán) 許多物質(zhì)不會(huì)發(fā)射熒光或熒光效率低 需要利用強(qiáng)熒光發(fā)射的熒光團(tuán)（或熒光探針分子） 熒光探針分子需滿足兩個(gè)條件： (1) 能與待測物質(zhì)某個(gè)微區(qū)專一而牢固的結(jié)合 (2) 這種結(jié)合不會(huì)破壞物質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象一些典型的熒光

6、團(tuán)一些典型的熒光團(tuán)色氨酸 348 nm4,6-二脒基-2-苯基吲哚461 nm 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白509 nm四甲基羅丹明 576 nm染料 667 nm 染料染料cy3的吸收、發(fā)射光譜的吸收、發(fā)射光譜最大激發(fā)波長 550 nm最大發(fā)射波長 570 nm (黃綠光)綠色熒光蛋白（綠色熒光蛋白（GFP） GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能，GFP是一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白5.2.3 熒光探測方法熒光探測方法 同步熒光光譜技術(shù) (1) 在同時(shí)掃描激發(fā)單色器和發(fā)射單色器波長的情況下測量熒光光強(qiáng)，由測得的熒光強(qiáng)度對發(fā)射或激發(fā)波長作圖 (2) 兩種同步掃描形式固定波長和固定能量固定波長和固定能量 (3)

7、固定波長：激發(fā)波長與發(fā)射波長間隔固定 (4) 固定能量：激發(fā)光波光子能量與發(fā)射光波光子能量差固定 (5) 特點(diǎn)特點(diǎn)： 與激發(fā)光譜及發(fā)射光譜都有關(guān)系，能使選擇性進(jìn)一步改善 能夠增強(qiáng)強(qiáng)帶而減小弱帶的干擾 它可以消除瑞利散射信號(hào)的干擾，也能夠使拉曼強(qiáng)度降低，但同時(shí)會(huì)把拉曼吸收峰拉寬 (6) 波長間隔的選擇非常重要！利用同步熒光光譜分離色氨酸利用同步熒光光譜分離色氨酸1、酪氨酸、酪氨酸2和苯丙氨酸和苯丙氨酸3的重疊熒光峰的重疊熒光峰一般熒光光譜同步熒光光譜(波長差70nm) 時(shí)間分辨熒光光譜技術(shù) (1) 時(shí)間分辨熒光技術(shù)用于測量熒光發(fā)光過程（很短的衰減過程） (2) 用短脈沖信號(hào)激發(fā)熒光，取樣積分探測

8、隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度 (3) 時(shí)間分辨熒光技術(shù)可以對發(fā)射光譜重疊但壽命有差異的組分進(jìn)行測定，也可以測量熒光衰減曲線及壽命 相位分辨熒光光譜技術(shù) (1) 也可以用于測量熒光壽命 (2) 基本原理：用正弦（或余弦）方式調(diào)制激發(fā)光光強(qiáng)，這樣發(fā)射光強(qiáng)也會(huì)被正弦（或余弦）調(diào)制，由于吸收和發(fā)射之間的時(shí)間延遲，所以發(fā)射光的調(diào)制信號(hào)相比于激發(fā)光存在相位延遲，測量該相位延遲就可以得到熒光壽命 (3) 相分辨熒光技術(shù)是一種穩(wěn)態(tài)測量技術(shù)，相比于時(shí)間分辨熒光技術(shù)，其靈敏度更高。5.3.1 元素分析（無機(jī)離子）元素分析（無機(jī)離子） 能發(fā)射熒光的無機(jī)離子很少，一般不能直接測量 無機(jī)離子的熒光分析法：直接法、熒光猝滅法、催

9、化熒光法 直接法直接法：無機(jī)離子與有機(jī)熒光試劑形成能發(fā)熒光的絡(luò)合物，直接測量絡(luò)合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度，很多元素可用該法，過渡金屬離子除外 熒光猝滅法熒光猝滅法：無機(jī)離子本身不能形成熒光絡(luò)合物，但可從金屬-有機(jī)熒光試劑絡(luò)合物中奪取金屬或有機(jī)試劑，形成更穩(wěn)定的絡(luò)合物，使金屬-有機(jī)熒光試劑絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度降低 ，比如：S, Fe, Co, Ag, Ni 催化熒光法催化熒光法：某些無機(jī)離子形成熒光絡(luò)合物的速度很慢或熒光微弱而難于測定，但在微量金屬離子催化下可使反應(yīng)迅速進(jìn)行，這時(shí)可由給定時(shí)間內(nèi)測定的熒光強(qiáng)度來測量該金屬離子濃度常用有機(jī)熒光試劑常用有機(jī)熒光試劑待測離子待測離子熒光試劑熒光試劑吸收波長吸收波長熒

10、光發(fā)射波長熒光發(fā)射波長Al3+，F(xiàn)e-茜素紫醬R470 nm500 nmB4O22-苯偶姻370 nm450 nmSn4+黃烷醇400 nm470 nmLi+8-羥基喹啉370 nm580 nm5.3.2 有機(jī)物分析有機(jī)物分析 脂肪族有機(jī)化合物脂肪族有機(jī)化合物 具有高度共軛體系的或脂環(huán)化合物能發(fā)射熒光，維生素A、蘿卜素 結(jié)構(gòu)簡單的脂肪族化合物本身能發(fā)射熒光的不多，需與有機(jī)試劑形成熒光化合物，可參考講義中“熒光分析法測定丙三醇”的例子 芳香族化合物芳香族化合物 具有共軛不飽和體系結(jié)構(gòu)，易于吸光，其中分子龐大而結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物在紫外光輻射下能產(chǎn)生熒光 熒光較弱的芳香族化合物可與有機(jī)試劑反應(yīng)獲得熒光

11、較強(qiáng)的物質(zhì) 蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe） 熒光強(qiáng)弱：Trp Tyr Phe 激發(fā)和發(fā)射波長：Trp Tyr Phe 色氨酸和酪氨酸的熒光最大發(fā)射波長分別為348和302 nm 熒光峰存在重疊，可利用同步熒光光譜分離，60 nm的同步熒光光譜為色氨酸的特征5.3.3 定量分析定量分析 定量分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)AFIIbcAII100bcFII100bcIIF0303. 2熒光與吸收光強(qiáng)：朗伯-比爾定律：稀溶液近似 分析方法可借用紫外分析方法可借用紫外-可見光譜法中的直接比較法、標(biāo)準(zhǔn)曲可見光譜法中的直接比較法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法、差示法等線法、差示法等課堂練習(xí)課堂練習(xí)1氧氣在760 nm附近的吸收截面約為10-27 cm2，假設(shè)在一個(gè)光程為1 m的氣體容器中充入氧氣，測得吸光度為0.1