northern雜交課件

1、Northern技術Northern技術簡介Northern blot 是一種通過檢測RNA的表達水平來檢測基因表達的方法。 Northern blot 首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補配對的探針雜交來檢測目的片段。Northern blot 在1977年由斯坦福大學James Alwine，David Kemp和George Stark發(fā)明。Northern blotting實際上依照比它更早發(fā)明的一項雜交技術Southern blot（依據(jù)生物學家 EdwinSouthern 名字來命名）來命名.步驟1. RNA1. RNA的提取的提取2

2、. 2. 甲醛甲醛的瓊脂糖凝膠上的瓊脂糖凝膠上RNARNA電電泳泳3. RNA3. RNA轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (尼龍膜尼龍膜) )4.RNA4.RNA探針制備探針制備5.5.預預雜交雜交6.Northern 6.Northern 印跡雜交印跡雜交7.7.放射性自顯影檢測放射性自顯影檢測 步驟按分子量的大小分離RNA檢測RNA是否降解1. RNA1. RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的瓊脂糖凝甲醛的瓊脂糖凝膠上膠上RNARNA電泳電泳3. RNA3. RNA轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (尼龍膜尼龍膜) )4.RNA4.RNA探針制備探針制備5.5.預雜交預雜交6.Northern 6.Northern 印跡雜印跡雜交

3、交7 7. .放射性自顯影檢放射性自顯影檢測測 步驟轉(zhuǎn)移前膠在50mmol/L的NaoH中浸20min膠在20*SSC中浸40min 轉(zhuǎn)膜方法:電轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法細管虹吸印跡法1. RNA1. RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的瓊脂糖凝膠上甲醛的瓊脂糖凝膠上RNARNA電泳電泳3. RNA3. RNA轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (尼龍膜尼龍膜) )4.RNA4.RNA探針制備探針制備5.5.預雜交預雜交6.Northern 6.Northern 印跡雜交印跡雜交7 7. .放射性自顯影檢測放射性自顯影檢測 步驟核酸標記同位素標記(P)地高辛標記探針:DNA探針cDNA探針RNA探針1 1. . RNARNA

4、的提取的提取2. 2. 甲醛的瓊脂糖凝膠上甲醛的瓊脂糖凝膠上RNARNA電泳電泳3. RNA3. RNA轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (尼龍膜尼龍膜) )4.RNA4.RNA探針制備探針制備5.5.預雜交預雜交6.Northern 6.Northern 印跡雜交印跡雜交7.7.放射性自顯影檢測放射性自顯影檢測 步驟預雜交目的: 用非特異性的DNA分子及其他高分子化合物封閉待測核酸分子中的非特異性結合位點,以減少雜交時的非特異性反應.1. RNA1. RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的瓊脂糖凝膠上甲醛的瓊脂糖凝膠上RNARNA電泳電泳3. RNA3. RNA轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (尼龍膜尼龍膜) )4.RNA4.RNA探

5、針制備探針制備5.5.預雜交預雜交6.Northern 6.Northern 印跡雜交印跡雜交7 7. .放射性自顯影檢測放射性自顯影檢測 步驟探針與RNA雜交1.RNA1.RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的瓊脂糖凝甲醛的瓊脂糖凝膠上膠上RNARNA電泳電泳3. RNA3. RNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜膜4.RNA4.RNA探針制備探針制備5.5.預雜交預雜交6.Northern 6.Northern 印跡雜印跡雜交交7.7.放射性自顯影檢測放射性自顯影檢測步驟在膜上壓一張X線膠片,放于含增感屏的暗盒里,零下70度放射自顯影24-48h(暗室中操作)1 1. RNA. RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的瓊脂糖凝甲醛的瓊脂糖凝膠上膠上RNARNA電泳電泳3. RNA3. RNA轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (尼龍膜尼龍膜) )4.RNA4.RNA探針制備探針制備5.5.預雜交預雜交6.Northern 6.Northern 印跡雜印跡雜交交7 7. .放射性