實驗四肌糖原的酵解作用

1、 山東大學實驗報告 2011年3月30日姓名 張行潤 系年級 2009級生科4班 學號 200900140177 同組者 于潛科目 生物化學實驗 題目 肌糖原的酵解作用 儀器編號 105一、 實驗目的 1.  學習檢定糖酵解作用的原理和方法2.  了解糖酵解作用在糖代謝過程中的地位及生理意義二、 實驗原理在動物、植物、微生物等許多生物機體內，糖的無氧分解幾乎都按完全相同的過程進行，本實驗以動物肌肉組織中肌糖元的酵解過程為例。肌糖元的酵解作用，即肌糖元在缺氧的條件下，經過一系列的酶促反應最后轉變成乳酸的過程。肌肉組織中的肌糖元首先與磷酸化合而分解，經過己糖磷酸脂、丙糖磷酸脂、

2、丙酮酸等一系列中間產物，最后生成乳酸。該過程可綜合在下列反應式：1/n（C6H5O5）nH2O2CH3CHOHCOOH 糖原 乳酸 肌糖元的酵解作用是糖類供給組織能量的一種方式。當機體突然需要大量的能量，而又供氧不足（如劇烈運動時），則糖元的酵解作用暫時滿足能量消耗的需要。在有氧條件下，組織內糖元的酵解作用受到抑制，而有氧氧化則為糖代謝的主要途徑。糖元酵解作用的實驗，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜時，必須在無氧的條件下進行；而肌肉提取液，則可在有氧條件下進行。因為，催化酵解作用的酶系統(tǒng)全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三羧酸循環(huán)）的酶系統(tǒng)，則集中在線粒體中，糖元可用淀粉代替。淀

3、粉存在于綠色植物的多種組織中（種子、塊莖、干果）。糖元是動物和細菌細胞內糖及其所反應的能源的一種儲存形式，其作用與淀粉在植物中的作用一樣，故有“動物淀粉”之稱。糖元或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成來觀察，在除去蛋白質與糖以后，乳酸可以與硫酸共熱變成乙醛，后者再與對羥基聯(lián)苯反應產生紫紅色物質，根據顏色的顯現(xiàn)而加以鑒定。該法比較靈敏，每毫升溶液含1-5µg乳酸即產生明顯的顏色反應，若有大量糖類和蛋白質等雜質存在，則嚴重干擾測定結果，因此，實驗中應盡量除凈這些物質。另外，測定時所用的儀器應嚴格地洗滌干凈。實驗中所用到的化學反應方程式如下：1. 糖原 ( 糖原磷酸化酶 ) 1- 磷酸 - 葡

4、萄糖 6- 磷酸葡萄糖，進入糖酵解。 1/n(C6H10O5)n+H2O 2CH3CHOHCOOH2. 乳酸的鑒定（靈敏度15微克/毫升）紫紅色三、 實驗器材 兔肌肉糜、試管及試管架、移液管（5 ml、2 ml、1 ml、0.5 ml）、滴管、量筒（10 ml）、玻璃棒、恒溫水浴、小臺秤、剪刀及鑷子、冰浴。四、 實驗試劑0.5%糖元溶液（或0.5%淀粉溶液）、20%三氯乙酸溶液、液體石蠟、氫氧化鈣（粉末）、濃硫酸、飽和硫酸銅溶液、1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH7.4）、對羥基聯(lián)苯試劑；五、 實驗步驟1. 制備肌肉糜：將雞殺死后，立即剝皮，割取背部和腿部肌肉，在低溫條件下用剪刀盡量把肌

5、肉剪碎即成肌肉糜，低溫保存?zhèn)溆茫ㄅR用前制備）。2. 肌肉的糖酵解:1) 取4支試管，編號后各加入新鮮肌肉糜0.5g。1、2號管為樣品管；3、4號管為空白管。向空白管內加入20%三氯乙酸3ml，用玻璃棒將肌肉糜打散，攪勻，以沉淀蛋白質和終止酶的反應。然后，在每支試管中加入新鮮肌肉糜3ml磷酸緩沖液和1ml0.5%糖原溶液。用玻璃棒充分攪勻，再分別加入少許液體石蠟（試管的3-5mm高度），使它在液面形成一薄層以隔絕空氣，并將4支試管同時放入37恒溫水浴中保溫。2) 1h后，取出試管，立即向樣品管內加入20%三氯乙酸3ml，混勻。將各試管內容物分別過濾，棄去沉淀。量取每個樣品的濾液5ml，分別加入已

6、編號的試管中，然后向每管內加入飽和硫酸銅溶液1ml，混勻，再加0.4g氫氧化鈣粉末，用玻璃棒充分攪勻后，放置10min，并不時振蕩，使糖沉淀完全。將每個樣品分別過濾，棄去沉淀。3. 乳酸的測定:1) 取4支潔凈、干燥的試管，編號，各加入濃硫酸2ml，將試管置于冰浴中冷卻。2) 將每個樣品的濾液一滴或兩滴逐滴加入到已冷卻的上述濃硫酸溶液中，邊加邊搖動冰浴中的試管，避免局部過熱，應注意冷卻。3) 將試管內液體混合均勻，放入沸騰的水浴鍋中煮沸5min，冷卻后，再加入對羥基聯(lián)苯試劑2滴，勿將對羥基聯(lián)苯試劑滴到試管壁上，混勻，比較和記錄各管溶液的顏色深淺，并加以解釋。簡約步驟：表1 肌糖原酵解反應實驗步

7、驟簡表 編號試劑樣品空白1234肌肉靡（g）0.520%三氯乙酸（ml）33磷酸緩沖液（ml）30.5%淀粉溶液（ml）1液體石蠟（ml）充分攪拌，加液體石蠟封口，37水浴1h，后吸出石蠟。20%三氯乙酸（ml）33飽和硫酸銅溶液（ml）1氫氧化鈣粉末（g）分別加0.4g，充分攪拌，分別過濾。六、 注意事項1. 加液體石蠟隔絕空氣，以試管高度的3-5mm為宜；2. 37保溫 1小時；3.在乳酸測定中，試管必須潔凈、干燥，防止污染；4支試管洗凈放入烘箱烘干4.所用滴管大小盡可能一致，減少誤差。0.1毫升管；若顯色較慢，則可將試管放入37恒溫水浴中保溫10min，再比較各管顏色。5.影響顯色的因素

8、：1) 糖的影響：加Ca(OH)2 和CuSO4去除。2) 蛋白質：加三氯乙酸(TCA)沉淀。3) 無機離子：a) Mg2+是許多酶的輔助因子, 必定影響酶促反應速度。b) Cu2+可增強乳酸的顏色反應。七、 實驗結果最終實驗結果：樣品組兩個試管呈紫羅蘭色，而空白組兩個試管基本呈無色透明狀，如下圖所示： 圖1：肌糖原酵解作用實驗結果展示圖（空白組（基本透明無色）兩個試管在左樣品組（紫羅蘭色）兩個試管在右）由圖1可以看出，1、2號樣品管中溶液呈紫羅蘭色，3、4號空白管中溶液無色，通過樣品管與空白管的顏色對照，可判斷1、2號樣品管中發(fā)生了淀粉的酵解，而3、4號空白管未發(fā)生反應，所以從實驗結果來看本次實驗比較成功。八、實驗分析實驗中用淀粉代替了肌糖元，因為淀粉與肌糖元結構類似，均為葡萄糖分子的高聚糖，糖原比淀粉具有更多的分支，所以在酶分解糖原時具有更多的作用位點，分解更快。因此在可適當延長37中的水浴時間，以使反應更徹底，結果更準確。3、4號管在加入了0.5g肉糜后立刻加入了三氯乙酸，三氯乙酸是蛋白質變性劑，可使肉糜中的蛋白質失活，所以3、4號管加入底物淀粉后