SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)_圖文

1、第30卷第11期2011年11月 種子(Seed V01.30No.11Nov.2011經(jīng)驗(yàn)交流SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)戴劍,吳燕(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所,南京210014Attention of SSR Molecular Marker in Experiment摘要:SSR分子標(biāo)記已經(jīng)得到普遍應(yīng)用,初學(xué)者如不能很好地 掌握實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn),就難以在較短時(shí)間內(nèi)成功地獲得試驗(yàn)結(jié) 果。本文分別介紹了DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物等實(shí)驗(yàn)過程中容易被忽視的注意事項(xiàng),以期為普及SSR 分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)。關(guān)鍵詞:SSR;DNA提取;PCR擴(kuò)增;電泳;注意事項(xiàng)中圖分類號(hào):S

2、 131+.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B文章編號(hào)110014705(201111-0122-02SSR(Simple Sequence Repeats又稱微衛(wèi)星DNA, 是一類由幾個(gè)(多為16個(gè)堿基組成的基序(motif 串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列,其長(zhǎng)度一般較短,它們廣 泛分布于整個(gè)基因組的不同位置上,每個(gè)座位上重復(fù) 單位的數(shù)目及重復(fù)單位的序列都可能不完全相同,因 而造成了每個(gè)座位上的多態(tài)性¨J。SSR標(biāo)記數(shù)量豐 富,覆蓋整個(gè)基因組,而且分布均勻,多態(tài)性高,呈共顯 性遺傳,重復(fù)性好,操作簡(jiǎn)便,是一種理想的分子標(biāo)記 技術(shù),被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建基因連鎖圖、分子輔助育種、 品種鑒定、遺傳資源的保存等方面。

3、然而,對(duì)于初學(xué) 者,由于不能較好地掌握實(shí)驗(yàn)操作技能和注意事項(xiàng),往 往不能一次獲得試驗(yàn)的成功,需要經(jīng)過多次反復(fù)的試 驗(yàn)才能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果,這樣不僅耽誤了試驗(yàn)時(shí)間,而 且浪費(fèi)了大量昂貴的分子實(shí)驗(yàn)試劑。然而,大多數(shù)文 獻(xiàn)僅著重分析試驗(yàn)的結(jié)果,只是簡(jiǎn)單地介紹試驗(yàn)方法, 甚至?xí)÷栽囼?yàn)方法,因此,作者根據(jù)多年的實(shí)踐經(jīng) 驗(yàn),對(duì)SSR分子實(shí)驗(yàn)中的一些容易被忽視的注意事項(xiàng) 加以總結(jié),以期能給初學(xué)者提供借鑒。1DNA提取過程中的注意事項(xiàng)目前常用的DNA提取方法有SDS和CTAB法忙J, 也有學(xué)者改進(jìn)了DNA提取方法,有簡(jiǎn)易DNA提取方收稿日期:201l一0625基金項(xiàng)目:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研基金(6110830

4、。作者簡(jiǎn)介:戴劍(1968一,女,江蘇靖江人;副研究員,博士,主要從事 種子質(zhì)量與植物新品種測(cè)試研究工作;E.mail:d畫ian842 。122 法3,41和快速DNA提取方法呤1。無論使用哪種方法, 均需要注意以下常見的操作事項(xiàng)I(1避免試驗(yàn)材料間DNA的交叉污染或外來 DNA的污染。使用冷凍干燥葉片法,可以將每個(gè)樣品 在單獨(dú)的離心管中研磨,研磨使用的小鋼珠球最好是 一次性的,如果是反復(fù)使用的小鋼珠球,必須徹底清洗 干凈。使用液氮和研缽研磨葉片組織時(shí),必須在每次 研磨前徹底清理干凈研缽和研磨棒。(2試驗(yàn)材料應(yīng)選取幼嫩組織,因?yàn)橹参镉啄劢M 織DNA含量高,且多糖、多酚含量少。(3裝入離心管的

5、葉片組織最好不要超過離心管 的1/31/2,否則會(huì)引起細(xì)胞裂解不完全,導(dǎo)致DNA 產(chǎn)量和純度下降。(4使用液氮研磨時(shí),要先將研缽用液氮冷卻,在 加入液氮后,要先將葉片壓碎,研磨時(shí)要快速用力,盡 量使樣品磨成粉末狀。(5水浴前需要確保試管蓋蓋嚴(yán),或使用輔助工 具進(jìn)行加固,以防止水浴時(shí)因溫度較高導(dǎo)致試管蓋 開裂。(6水浴過程中,每隔1015min將離心管取出 振蕩、搖勻,使粉碎的葉片組織盡量與裂解液充分接 觸,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),釋放DNA。(7實(shí)驗(yàn)過程中振蕩動(dòng)作不宜劇烈,移液槍頭最 好使用大孔槍頭,移液動(dòng)作不能太快,以免使DNA 斷裂。(8當(dāng)DNA以小球狀固體沉積在離心管底部后, 傾倒離心管中多余液體

6、時(shí),應(yīng)避免把DNA小球一起倒 出?？稍诘谷ゴ蟛糠忠后w后,改用吸水紙吸取剩余 液體。(9DNA風(fēng)干最好在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行,待乙醇 徹底風(fēng)干后才能加入TE或ddH:O溶解,如果有殘留 的乙醇,可能會(huì)影響PCR反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果。(10如果DNA純度不好i可將DNA粗提物用 1XTE溶液充分溶解,離心后,取上清液再次沉淀萬方數(shù)據(jù)經(jīng)驗(yàn)交流 戴劍等:SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)DNA,可有效除去多糖。2PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)PCR反應(yīng)過程中應(yīng)特別注意不要使樣品相互污 染,以免造成試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,同時(shí)也要注意所加試劑 或樣品必須是經(jīng)過混勻后的液體,這樣才能保證反應(yīng) 液各成分的濃度和體積的均一性。所用試劑

7、需從正規(guī) 商家購進(jìn),以保證試劑的質(zhì)量。(1盡量使用一次性手套、專用整套移液器、成套 試劑和其他必需品,避免外來DNA污染反應(yīng)體系。 (2DNA模板應(yīng)稀釋為適宜的濃度,使加入PCR 反應(yīng)的DNA樣品體積最好在45肛l。如果DNA模 板樣品量太少,僅有12礎(chǔ),不僅實(shí)驗(yàn)操作難度大,而 且如果操作時(shí)間長(zhǎng),會(huì)導(dǎo)致DNA反應(yīng)液部分或全部蒸 發(fā)掉,影響PCR反應(yīng)結(jié)果。(3可以先將DNA樣品加到PCR管底部,再加其 他PCR反應(yīng)混合液。加樣時(shí)選擇不同的方位加DNA 模板和其他PCR反應(yīng)混合液,這樣槍頭靠壁加樣時(shí)不 會(huì)交叉污染。(4加樣完畢后,蓋上蓋子,混勻反應(yīng)液,再低速 離心片刻(1min左右。如果不是立即進(jìn)

8、行PCR擴(kuò) 增,需將PCR反應(yīng)混合液置于一20保存?zhèn)溆谩?(5PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的酶不能長(zhǎng)時(shí)間放置于室 溫下,須隨用隨取,使用完畢后立即放回一20冰箱。 否則,酶易失活。(6PCR反應(yīng)的退火溫度應(yīng)根據(jù)不同的引物來確 定最佳退火溫度,以確保擴(kuò)增的條帶中雜帶少,目標(biāo)帶 明顯,引物退火溫度一般按照Tm=4(G+C+2 (A+T公式計(jì)算。3電泳操作注意事項(xiàng)(1對(duì)于緩沖系統(tǒng),在沒有離子存在時(shí),電導(dǎo)率最 小,DNA不遷移,或遷移極慢,在高離子強(qiáng)度的緩沖液 中,電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱,可能導(dǎo)致DNA變性,因此應(yīng)注意 緩沖液濃度的正確使用。(2電泳所需溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用,配制10%AP(過 硫酸銨時(shí),可大量配好后,分裝到

9、1.5IIll的離心管 中,在一20條件下保存,每次使用前解凍所需使用 量即可5|。(3DNA遷移率取決于凝膠的濃度、遷移分子的 形狀及大小,制備凝膠根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分子量的大 小范圍來決定凝膠的濃度。(4在制膠時(shí)應(yīng)避免有殘留氣泡,拔梳子時(shí),要先 將緩沖液漫過加樣孔,避免空氣進(jìn)入,并且要垂直向上 拔出梳子。(5樣品的加樣量多少根據(jù)加樣孔的大小及DNA 中片段的數(shù)量和大小而定,量過多會(huì)造成加樣孔超載, 從而導(dǎo)致拖尾和彌散,對(duì)于分子量較大的DNA,此現(xiàn) 象更明顯。(6加樣的時(shí)間不能太長(zhǎng),否則會(huì)導(dǎo)致樣品擴(kuò)散 而被稀釋,影響電泳效果。(7在使用電壓一致的情況下,電泳效果的好壞, 與電泳時(shí)間有著很大關(guān)

10、系,電泳時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增 條帶間的距離大,不利于讀帶,而且條帶的清晰度也會(huì) 下降,甚至?xí)a(chǎn)生電熱效應(yīng),促使擴(kuò)增條帶出現(xiàn)“微 笑”o情況。電泳時(shí)間過短,會(huì)降低電泳條帶的分辨 率。一般聚丙烯酰胺凝膠最佳電泳時(shí)間為6090 min,瓊脂糖凝膠電泳的時(shí)間根據(jù)DNA片段大小和瓊 脂糖凝膠濃度而定,一般為40120min。(8使用合適的電壓和電流進(jìn)行電泳,常使電壓 恒定在200V下進(jìn)行電泳,瓊脂糖凝膠電泳的電壓一 般不超過5V/cm。 . (9冰醋酸、硝酸銀、氫氧化鈉、甲醛等染色試劑, 對(duì)環(huán)境與人體都有污染、毒害作用,染色須在通風(fēng)櫥中 或在空氣流通良好的環(huán)境中進(jìn)行,硝酸銀溶液需避光 保存,或現(xiàn)用現(xiàn)配。丙

11、烯酰胺為神經(jīng)性毒劑,操作時(shí)必 須戴手套。(10要盡量減少每次染色的凝膠片數(shù)量,太多會(huì) 造成重疊,使染色不徹底。(11用水沖洗終止反應(yīng)后的凝膠時(shí),要特別小 心,避免水直接沖到凝膠表面,使膠破碎。倒掉沖洗水 時(shí),最好用一個(gè)漏網(wǎng)擋著,防止凝膠被倒出。參考文獻(xiàn):1陳佩度.作物育種生物技術(shù)M.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001:126143.2戴劍,洪德林,張大棟,等.一種快速高效的DNA提取方法 研究J.麥類作物學(xué)報(bào),2011,31(3:437442.3孫林靜,馬忠友,蘇京平,等.一種簡(jiǎn)單快速的DNA提取方 法在水稻上的應(yīng)用J.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,14(3: 14.4盧振宇,李明順,謝傳曉,等.玉米葉片DNA快速提取方法 改進(jìn)研究J.玉米科學(xué),2008,16(2:5053.5吉家敏,夏志強(qiáng),鄒枚伶,等.木薯SSR標(biāo)記非變性聚丙烯 酰胺凝膠電泳條件的優(yōu)化J.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,16 (6