綜合大實(shí)驗(yàn)(二改

1、基因工程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 成員：潘嘉立，危威，劉禮彪， 張睿，譚娟，鄧文靜基因工程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一、 目的基因的獲取Arabis hirsuta isolate Ahirs2-1 alcohol dehydrogenase gene, complete cdsGenBank AF110444.1硬毛南芥Ahirs2-1酒精脫氫酶ORIGIN1 ATGATTACCA CCGGACAGAT TATTCGATGC AAAGCTGCTG TGGCATTTGA AGCCGGAAAA61 CCACTGGTTA TGGAGGAAGT AGAGGTTGCT CCGCCGCAAA AAAATGAAGT TCGTATCAAG1

2、21 ATCCTCTTCA CTTCTCTTTG TCACACCGAT GTTTACTTCT GGGAGGCAAA GGGACAAACA181 CCGTTGTTTC CTCGTATCTT CGGTCATGAA GCTGGAGGGA TTGTGGAGAG TGTTGGAGAA241 GGTGTGACTG ATCTTGCACC AGGAGATCAT GTGTTACCGA TCTTCACCGG AGAATGTGGT301 GATTGTCCTC ATTGTCACTC TGAGGAATCA AACATGTGTG ATCTTCTCAG GATCAACACC361 GAACGAGGAG TGATGATAAA

3、 CGACGGTGAA TCGAGGTTCT CTATTGATGG GAAACCGATT421 TATCATTTTG TTGGGACATC AACGTTTAGT GAATACACTG TGGTTCACTC TGGTCAAGTC481 GCTAAGATCA ATCCTGATGC TCCTCTTGAT AAAGTCTGCA TTGTTAGTTG TGGTTTATCT541 ACTGGGNTAG GAGCTACTTT GAATGTTGCT AAACCGAAAA AGGGTCAAAG TGTTGCGATT601 TTCGGACTCG GTGCTGTTGG TTTAGCCGCT GCTGAAGGTG C

4、TAGAATCGC TGGTGCTTCT661 AGGATCATTG GTGTTGATCT CAACTCGAAG AGATTCGATG AAGCTAAGAA ATTCGGTGTG721 ACCGAGTTTG TGAACCCGAA AGACCATGAC AAACCTGTTC AACAGGTGAT CGCTGAGATG781 ACGGATGGTG GAGTTGACCG GAGTGTGGAG TGTACTGGAA GCGTTCAGGC CATGATTCAA841 GCATTTGAAT GTGTTCACGA TGGTTGGGGT GTTGCGGTGC TTGTTGGTGT GCCAAGCAAA901

5、GACGATGCCT ACAAGACTCA TCCAATGAAT TTCCTGAATG AGAGAACTCT CAAGGGTACT961 TTCTTTGGGA ACTACAAACC AAAAACTGAC ATTCCCGGGC TTGTCGAAAA GTACATGAAC1021 AAGGAGCTGG AGATTGAGAA ATTCATCACT CACACAGTGC CATTCTCGGA GATCAACAGG1081 GCCTTTGATT ACATGTTGAA GGGAGAGGGT ATCCANTGCA AAATCACCAT GGGTGCTTGA二、引物設(shè)計(jì)正向引物: 5'-CCCAAGC

6、TTATGATTACCACCGGACAGAT -3' (66.7 ) 反向引物： 5'-CGCGGATCCTCAAGCACCCATGGTG-3' (70) 三、強(qiáng)堿法提取pUC-19 質(zhì)粒DNA試劑：1、溶液1（GTE）：50mmol/l 葡萄糖、10mmol/l EDTA-Na2、 25mmol/l Tris-Cl（pH8.0）、4mg/ml 溶菌酶溶液2：200mmol/l NaoH、1%SDS溶液3：5mol/l KAC 60ml、冰乙酸 11.5ml、ddH2O 28.5ml2、 苯酚-氯仿3、 異丙醇（或95%乙醇，100%乙醇）4、 70%乙醇5、 TE（p

7、H8.0）：10mmol/l Tris-Cl（pH8.0）、1mmol/l EDTA-Na26、 RNase 1mg/ml 、Amp 100ug/ml實(shí)驗(yàn)步驟：1、挑取一單菌落的Ecoli InvaF（pUC-19）菌種接種到含Amp100ug/ml的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、 吸1.4ml菌液至Ep管中，在高速臺(tái)式離心機(jī)上5000r離心2min，倒去培養(yǎng)基。3、 重復(fù)一次，盡可能倒出培養(yǎng)基并將管倒置于紙帕上，以吸干管壁上殘留的培養(yǎng)基，收集細(xì)菌。4、 將細(xì)菌懸于500ul冰冷的溶液1中，于離心機(jī)上5000r離心2min.5、 倒去溶液1，再懸于200ul冰冷的溶液1中。6、 加入

8、300ul新配制的溶液2，冰浴5min。7、 加入300ul冰冷的溶液3，中和，輕輕振蕩，至冰浴5min。8、 于離心機(jī)上，10000r離心5min。9、 加入等體積的飽和酚快速抽提，10000r離心5min取上清液。10、 再加入等體積的氯仿抽提，10000r離心5min取上清液。11、 加入750ul異丙醇，沉淀質(zhì)粒DNA，10000r離心10min。12、 倒去異丙醇，用70%乙醇洗滌沉淀，10000r離心5min。13、置冰箱內(nèi)開蓋干燥，懸浮于40ul去離子水或TE中。四、硬毛南芥植物總RNA提取實(shí)驗(yàn)步驟1. 稱取材料0.1g，剪成約2mm長(zhǎng)段，加入液氮研磨成細(xì)粉狀。2. 加入0.2g

9、異硫氰酸胍和2ml CSB緩沖液，繼續(xù)研磨成勻漿。3. 將勻漿轉(zhuǎn)移至兩個(gè)eppendorf管中，加入0.12ml NaAc，加蓋后反復(fù)顛倒離心管20次。4. 每管加入1ml酚：氯仿：異戊醇，混勻后劇烈震動(dòng)10sec，冰浴15min。5. 10，000g，4離心15min。6. 小心將上層水相轉(zhuǎn)移至新管中，注意不要吸動(dòng)中間層。中間層富含蛋白質(zhì)和DNA。7. 加入等體積的異丙醇，混勻后置-20放置30min以沉淀RNA。8. 10，000g，4離心20min沉淀RNA。9. 棄上清，將RNA沉淀懸浮到0.5ml CSB溶液中，搖動(dòng)溶液至RNA溶解。10. 加入等體積的酚:氯仿:異戊醇重新抽提一次，

10、即重復(fù)48的步驟。11. 離心后棄上清，沉淀用0.5ml預(yù)冷的75%乙醇漂洗一次。離心后棄上清，真空初步干燥沉淀。12. RNA溶解在0.2ml  DEPC水中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm、280nm、及230nm波長(zhǎng)的光密度，獲得RNA的濃度和純度。五、RT-PCR擴(kuò)增目的基因1. cDNA的合成總RNA1ug（約5-10ul）Oligo（dT）160.5ug（也可使用特異下游引物50-100pmol）Rnasin20U5xRT緩沖液4 ul10mmol/LdNTPs1 ulAMV逆轉(zhuǎn)錄酶10ul加水到20ul42保溫30-60分鐘，冰上冷卻，離心數(shù)秒鐘，然后進(jìn)行PCR2. P

11、CR 擴(kuò)增目的基因5ml反應(yīng)管中，按照以下順序加入各種成分。使反應(yīng)總體積為50ul：H2O28ul10×PCR緩沖液+5 ul10×dNTPs（2.0mmol/L）5 ul擴(kuò)增引物混合物（2umol/L）5 ulcDNA模板5 ulTaqDNA聚合酶（1.5U）2 ul在冰上輕輕混勻后，加石蠟油50ul，離心數(shù)秒鐘，放置于冰上，準(zhǔn)備上機(jī)擴(kuò)增。2.上機(jī)先在DNA擴(kuò)增儀上設(shè)置好循環(huán)程序：94預(yù)變性2分鐘；94變性30秒，60退火30秒，72延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；72延伸5分鐘。反應(yīng)管放在DNA擴(kuò)增儀的插孔中。按“START”鍵，循環(huán)開始。3.循環(huán)完畢，取出反應(yīng)管，放置于4冰

12、箱備用。6、 DNA的回收與純化試劑：低熔點(diǎn)瓊脂糖、TE、苯酚、氯仿、EB、無(wú)水乙醇、70%乙醇、3mol/lNaAc步驟：1、配制1%的瓊脂糖凝膠，加入EB至0.5ug/ml2、加樣電泳一段距離，在紫外燈下檢測(cè)，當(dāng)DNA片段充分分開后停止電泳3、在紫外燈下用小刀在所要回收帶前挖一個(gè)長(zhǎng)方形小洞4、將1%的融化的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠（LMA）灌入洞內(nèi)，凝固后繼續(xù)電泳5、待目的帶完全進(jìn)入LMA后停止電泳，將含目的帶的LMA切下裝入EP管中6、加入5倍體積的TE混勻7、65水浴10min，搖晃，使膠融化8、加入等體積的苯酚抽提，10000g離心5min9、加入等體積的氯仿抽提，10000g離心5min1

13、0、加入3mol/lNaAc至最終濃度為0.2mol/l，用2倍體積的無(wú)水乙醇在-20沉淀2小時(shí)11、12000g離心15min，用70%乙醇洗滌沉淀，真空干燥12、溶于適量的TE中，取少量電泳或紫外檢測(cè)7、 將Ahirs2-1構(gòu)建到pUC-19上（一）酶切Ahirs2-1DNA和質(zhì)粒試劑 Hind 限制性內(nèi)切酶、BamH 限制性內(nèi)切酶 10×buffer：50mmol/l Na cl 10mmol/l Tris-cl 10mmol/l Mgcl2 1mmol/l DTT（二硫蘇糖醇）步驟：1. 將DNA樣品1ug溶解在16ul重蒸水中2. 加入2ul 10×buffer3

14、. 加入1-2U的限制性內(nèi)切酶Hind 和BamH 4. 混合反應(yīng)液后稍離使液體聚集，置37溫育1小時(shí)5. 終止反應(yīng)加入0.5mol/l EDTA-Na2，至終濃度為10mol/l6. 進(jìn)行電泳檢查酶切結(jié)果7. 切膠回收目的片段和載體（二）DNA的重組連接試劑:10T4DNA連接酶緩沖液660mmol/l Tris-HCl(pH7.5)50mmol/l MgCl250mmol/lDDT50mmol/lATP電泳試劑：電泳緩沖液5TEB pH8.0（使用濃度為0.5）54.0gTris、27.5g硼酸、20ml 500mmol/LEDTA、加800ml重蒸水，加熱溶解后，再加入重蒸水定容至100

15、0ml實(shí)驗(yàn)步驟：1、取3只EP管，一管做重組連接，一管做pUC19未經(jīng)CIP的處理的自連2、用微量進(jìn)樣器按下表分別取樣各溶液預(yù)EP管中DNA酶切反應(yīng)物10T4連接緩沖液ddH2OT4DNA連接酶總體積pUC19EcoR-CIP 5ul(100ng)5.4KbEcoR片段 5ul（約400ng）2ul7ul1ul(2U)20ulpUC19EcoR-CIP 3ul(60ng)2ul14ul1ul(2U)20ulpUC19EcoR 3ul(60ng)2ul14ul1ul(2U)20ul加樣順序?yàn)閐dH2O、10T4連接緩沖液、DNA片段，最后加入T4連接酶（放于冰浴中）連接酶取好立即放回-20備存3

16、、蓋緊蓋子用手指彈勻EP管，于臺(tái)式離心機(jī)上轉(zhuǎn)2s，以集中樣品4、將3管連接樣品放入溫度16溫水浴鍋中，過(guò)夜5、第二天上午各管取約25ng的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察連接反應(yīng)效果，電泳時(shí)要加入pUC19EcoR酶切段做電泳對(duì)照8、 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化1、 實(shí)驗(yàn)材料：E.coli InvaF(受體) pUC-19質(zhì)粒DNA2、 實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及試劑儀器、器皿：平板、三角瓶、EP離心管試劑：LB培養(yǎng)基：酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、Nacl 10g/l 、1L水、瓊脂2% 氨芐青霉素100mg/ml 、 0.1mol/lCaCl2溶液X-gal 20mg/l(用甲酰胺

17、溶液配制)使用濃度為40ug/mlIPTG 20mg/l(用無(wú)菌水配制)使用濃度為40ug/ml3、 實(shí)驗(yàn)步驟1、 從甘油保存菌種中接種一環(huán)E.coli InvaF至LB平板上，37道指培養(yǎng)過(guò)夜2、 挑取2-3mm直徑的單菌落接種至50mlLB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)4-6h(搖床轉(zhuǎn)速200r/min)當(dāng)OD600為0.6左右即可3、 吸取1.4ml菌液至離心管，5000g 2min，棄上清液，并倒置于紙帕4、 重復(fù)步驟3一次5、 將細(xì)菌懸浮液于750ul預(yù)冷的0.1mol/lCaCl2溶液，冰浴放置10min6、 5000g離心2min，收集細(xì)菌7、 將細(xì)菌重懸于200ul預(yù)冷的0.1mo

18、l/lCaCl2溶液冰浴放置30min8、 每管加入質(zhì)粒DNA50ng/10ul，輕輕混勻冰浴放置20min，設(shè)計(jì)一不加質(zhì)粒DNA的對(duì)照9、 將管置于42水浴鍋中2-3min,不要搖動(dòng)10、 迅速轉(zhuǎn)移至冰浴2min11、 加入700ulLB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)45min，以便轉(zhuǎn)化菌表達(dá)抗性12、 接種到含100ul/ml Amp的LB冷平板上13、 將平板倒置放入37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜14、 確信對(duì)照無(wú)菌落時(shí)，在Amp培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落即是轉(zhuǎn)化子八、菌落PCR檢測(cè)- 1、PCR mix（PCR預(yù)混液）的制備  菌落 Taq buffer（10×）

19、60;    20 L  dNTP（2.5 mmol/L）       5  L  Primer Forward（50 mmol/L）    10 L  Primer Reverse（50 mmol/L）    10 L ddH2O       &#

20、160;147 L Taq（2U/L）     8  L total        200 L  將上述溶液混勻，10L每管分裝于20L PCR管中。  2、常溫下隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取少量菌體，在LB瓊脂糖平板上輕點(diǎn)，做一拷貝；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數(shù)下（管子做好記號(hào)，將平板上點(diǎn)的克隆標(biāo)號(hào)與管子上的對(duì)應(yīng)起來(lái)，以便篩選到克隆后進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)），蓋緊管子。&#

21、160; 3、將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規(guī)條件擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序根據(jù)具體的引物設(shè)置，參考下列程序： 95，3 min 95，30 s 56，30 s 72，50 s 30個(gè)循環(huán) 72，10 min。 4、凝膠電泳檢測(cè)菌落PCR結(jié)果 5、將已經(jīng)接種有菌落的平板置37培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，使菌落擴(kuò)增，次日挑選陽(yáng)性克隆做進(jìn)一步篩選或培養(yǎng)。九、酶切檢測(cè) 步驟：1、 將菌落PCR擴(kuò)增目的帶的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)2、 提取質(zhì)粒2、加入2ul 10×buffer3、加入1-

22、2U的限制性內(nèi)切酶Hind 和BamH 4、混合反應(yīng)液后稍離使液體聚集，置37溫育1小時(shí)5、終止反應(yīng)加入0.5mol/l EDTA-Na2，至終濃度為10mol/l6、進(jìn)行電泳檢查酶切結(jié)果7、電泳檢測(cè)是否得到目的片斷。8、菌種保存10、 測(cè)序1、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物 1. 將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中。 2. 加入25 l醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4離心30 min，小心棄上清。 3. 加70%(V/V)的乙醇50 l洗滌沉淀2次。12 000 r/min于4離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀1015 min。2、電泳前測(cè)序PCR產(chǎn)物的處理 1. 加入12 l的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。 2. 將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。 3. 在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95 2 min)，冰中驟冷，待上機(jī)。3、上機(jī)操作 1. 按儀器操作說(shuō)明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和建立運(yùn)行的測(cè)序順序文件。 2. 儀器將自動(dòng)灌膠至毛細(xì)管，1.2 kV預(yù)電泳5 min，按編程次序自動(dòng)進(jìn)樣，再預(yù)電泳(1.2 kV，2