電針穴位刺激對(duì)致癇大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生及行為學(xué)變化影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、電針穴位刺激對(duì)致癇大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生及行為學(xué)變化影響的實(shí)驗(yàn)研究                                作者：王津存，黃遠(yuǎn)桂，溫曉妮，王衛(wèi)東，夏峰，王小木，楊方,吳松笛 【關(guān)鍵詞】  電針    Effect of elec

2、troacupuncture applied at acupoint on neurogenesis in hippocampal dentate gyrus and behavior of rats with lithiumpilocarpine induced status epilepticus    WANG JinCun，HUANG YuanGui，WEN XiaoNi，WANG WeiDong，XIA Feng，WANG XiaoMu，YANG Fang，WU SongDi    Department of Neurolo

3、gy, XijingHospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xian 710033, China    【Abstract】 AIM: To investigate the effect of electroacupuncture applied at Baihui acupoint on the behavior and electroencephalogram of the rats with lithiumpilocarpine induced status epilepticus (SE) and provi

4、de some experimental basis for treating the seizures with acupoint stimulation. METHODS:  Adult male SD rats were subjected to lithiumpilocarpine induced SE model. By using bromodeoxyuridine (BrdU) labeling method and immunohistochemistry, we compared the proliferation rate of neural precursor

5、cells in the dentate gyrus between the intervention group and the control group at 7, 14 and 42 d after SE. The alteration of behaviors was observed. RESULTS:  Electroacupuncture applied at Baihui acupoint significantly increased the number of BrdU labeled cells in the dentate gyrus 7 and 14 d

6、after SE was induced (P<0.01), but did not influence the number of BrdU labeled cells in the 42 d epileptic living rats (P>0.05). Spontaneous recurrent seizures（SRSs） happened less in the intervention group (42 d after epileptic seizure) than in control groups（P<0.05）. CONCLUSION:  Ele

7、ctroacupuncture applied at Baihui acupoint can efficiently increase the proliferation of neural precursor cells in the dentate gyrus after epileptic seizures, indicating that electroacupuncture at Baihui acupoint, to some extent, participates in the alteration of neural plasticity in hippocampus in

8、epileptic rats.    【Keywords】 electroacupuncture stimulation; Baihui acupoint; neurogenesis; epilepsy; lithiumpilocarpine    【摘要】 目的：觀察電針刺激百會(huì)穴對(duì)鋰匹羅卡品誘導(dǎo)致癇大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生及行為的影響，為進(jìn)一步揭示穴位刺激治療癲癇的機(jī)制提供基本的實(shí)驗(yàn)依據(jù). 方法：選用鋰匹羅卡品誘導(dǎo)致癇成年大鼠模型，采用BrdU標(biāo)記分裂細(xì)胞及免疫組織化學(xué)方法比較致癇后7,14,42 d時(shí)電針刺激穴位干預(yù)致癇組大鼠與相

9、應(yīng)對(duì)照組大鼠之間海馬齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖速度，并同時(shí)觀察動(dòng)物行為學(xué)改變. 結(jié)果：電針穴位刺激后，明顯促進(jìn)了大鼠致癇后7 d,14 d時(shí)齒狀回的神經(jīng)發(fā)生水平，BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較相應(yīng)對(duì)照組明顯增加（P<0.01），而致癇后第42日時(shí)兩組大鼠齒狀回BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著性差異（P0.05）. 同時(shí)，電針穴位刺激干預(yù)組大鼠(存活42 d大鼠)平均每周SRSs次數(shù)明顯少于電針刺激對(duì)照組和無(wú)刺激對(duì)照組大鼠. 結(jié)論：電針刺激百會(huì)穴可促進(jìn)癲癇后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平的改變，即電針刺激百會(huì)穴在一定的程度上參與了癲癇后海馬的神經(jīng)可塑性變化.    【關(guān)鍵詞】

10、 電針刺激; 百會(huì)穴; 神經(jīng)發(fā)生; 癲癇; 鋰匹羅卡品    0引言    近年來(lái)有關(guān)成年腦組織神經(jīng)發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn),缺血、缺氧、外傷、癲癇等許多原因所致的腦損傷均可誘導(dǎo)成年海馬齒狀回神經(jīng)元再生的增加,成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)元再生相關(guān)機(jī)制的研究已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)最激動(dòng)人心的課題1-3. 國(guó)內(nèi)、外相關(guān)研究結(jié)果表明癲癇后的海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生即神經(jīng)可朔性的改變與癲癇的發(fā)生和發(fā)作密切相關(guān)，而祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的理論和實(shí)踐也顯示穴位刺激具有明顯的抑制癲癇發(fā)生與發(fā)作的作用4-5. 因此，在目前我們對(duì)穴位刺激治療癲癇基礎(chǔ)研究領(lǐng)域尚缺乏深入實(shí)驗(yàn)研究的

11、前提下，探討電針穴位刺激是否會(huì)對(duì)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生產(chǎn)生影響無(wú)疑是一個(gè)值得我們關(guān)注的內(nèi)容. 本研究中，我們選用鋰匹羅卡品誘導(dǎo)致癇大鼠模型，對(duì)致癇大鼠電針刺激百會(huì)穴后海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生和行為學(xué)改變進(jìn)行了初步觀察和研究，旨在為進(jìn)一步揭示穴位刺激治療癲癇的機(jī)制提供基本的實(shí)驗(yàn)依據(jù).    1材料和方法    1.1材料成年雄性SD大鼠，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量200250 g. 飼養(yǎng)于1212 h光暗環(huán)境，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食. 選取SE發(fā)作程度依據(jù)Ono J分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)級(jí)（含級(jí)）以上存活大鼠隨機(jī)分為電針穴位刺激干預(yù)組（n=12）, 電針刺

12、激對(duì)照干預(yù)組（n=12），各干預(yù)組大鼠又分別隨機(jī)分為致癇后7，14，42 d 3個(gè)時(shí)間組（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只大鼠）. 參考相關(guān)文獻(xiàn)6-8鋰匹羅卡品癲癇模型制作予造模大鼠腹腔注射氯化鋰（3 meq/kg,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司）,18 h后腹腔注射鹽酸匹羅卡品（30 mg/kg,Sigma公司），所有注射匹羅卡品大鼠均于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)直陣孿性發(fā)作癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE），60 min后腹腔注射地西泮注射液（4 mg/kg）終止發(fā)作，以降低死亡率.    1.2方法    1.2.1分組電針穴位刺激干預(yù)、BrdU給藥方法及腦片標(biāo)本制備 電針穴位

13、刺激組大鼠（電針刺激致癇大鼠百會(huì)穴）和電針刺激對(duì)照組大鼠（電針刺激致癇大鼠百會(huì)穴相臨的非穴位處）均采用G6805型電針治療儀于致癇后第2日開始進(jìn)行電針刺激干預(yù)，共刺激3 d. 電針刺激參數(shù)為：頻率為50 Hz,電流強(qiáng)度20 mA,時(shí)間20 min， 2次/d. 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)前1 d以BrdU 50 mg/kg （Boehringer Mannheim）腹腔注射給藥2次，2 h間隔/次，24 h后予戊巴比妥鈉 (40 mg/kg) 麻醉，經(jīng)升主動(dòng)脈灌注生理鹽水100 mL，40 g/L多聚甲醛液（pH 7.4）500 mL后，斷頭取腦，將腦組織置入40 g/L多聚甲醛后固定過(guò)夜

14、，200 g/L蔗糖4沉底，選擇海馬部位應(yīng)用冰凍切片機(jī)冠狀位連續(xù)切片，每隔150 m取腦片1張，腦片厚30 m，收集于0.01 mol/L KPBS中.    1.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)參考有關(guān)文獻(xiàn)9對(duì)腦片進(jìn)行染色，具體步驟如下：取切片入500 g/L甲酰胺（Sigma）/2×SSC中65 2 h，2×SSC漂洗后，入2 mmol/L HCl中37 30 min， 0.01 mol/L硼酸液中和10 min，浸入含0.3 g/L Triton X100的0.01 mol/L KPBS 30 min，之后入小鼠抗BrdU抗體（11000，Sigma）

15、 4孵育48 h，再依次入生物素化的羊抗小鼠IgG (1500, Sigma)室溫2 h、生物素卵白素HRP復(fù)合物（1:500, Sigma）室溫2 h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸鎳胺法呈色. 然后常規(guī)貼片、干燥、脫水、透明、封片. 光鏡觀察. 對(duì)照染色用血清稀釋液代替第一抗體.    1.2.3行為學(xué)觀察記錄各致癇大鼠首次發(fā)作的行為學(xué)改變、首次癲癇發(fā)作平均潛伏期、注射地西泮前強(qiáng)直陣孿發(fā)作次數(shù)和持續(xù)時(shí)間,以及靜默期的長(zhǎng)短. 此后，每天觀察動(dòng)物的行為學(xué)變化4 h，記錄存活42 d大鼠靜默期后出現(xiàn)的Ono J分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)10級(jí)的自發(fā)反復(fù)發(fā)作（SRSs）次數(shù). 同時(shí)在40

16、0倍光鏡下觀察各干預(yù)組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠齒狀回顆粒細(xì)胞層（GCL）、亞顆粒增生帶（SGZ，GCL與門區(qū)之間約2個(gè)細(xì)胞體厚的一層11）及門區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行比較，每只大鼠隨機(jī)選取45個(gè)非連續(xù)的腦片進(jìn)行計(jì)數(shù).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，使用SPSS 11.0軟件包行方差分析, P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.    2結(jié)果    2.1行為學(xué)改變匹羅卡品注射后5 min大鼠開始出現(xiàn)煩躁不安、跑動(dòng)、凝視、站立、點(diǎn)頭、咀嚼樣動(dòng)作、濕狗樣抖動(dòng)等表現(xiàn). 約30 min左右出現(xiàn)面肌抽動(dòng)、前肢震顫、姿勢(shì)失衡、跌倒，繼之發(fā)生全

17、身強(qiáng)直陣攣抽搐，持續(xù)12 min. 發(fā)作間期動(dòng)物呈疲勞狀態(tài). 注射地西泮后，大鼠逐漸停止癲癇發(fā)作，經(jīng)過(guò)520 d的靜默期后，進(jìn)入慢性期的各干預(yù)組致癇大鼠均觀察到Ono J分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)級(jí)的自發(fā)反復(fù)發(fā)作（SRSs）. 各干預(yù)組致癇大鼠首次癲癇發(fā)作平均潛伏期、注射地西泮前強(qiáng)直陣孿發(fā)作次數(shù)和平均持續(xù)時(shí)間無(wú)顯著性差異（表1，P0.05）. 電針穴位刺激干預(yù)組大鼠(存活42 d大鼠)平均每周SRSs次數(shù)明顯少于電針刺激對(duì)照組和無(wú)刺激對(duì)照組大鼠（表1，P<0.05）.百事通     表1各干預(yù)組致癇大鼠癲癇行為學(xué)改變比較(略)    2.2大鼠海

18、馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)致大鼠海馬齒狀回亞顆粒增生帶和顆粒細(xì)胞層內(nèi)可見BrdU陽(yáng)性細(xì)胞分布，高倍鏡（400）下觀察常可見68個(gè)以上BrdU標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞“叢集”在一起，但這些細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)往往不規(guī)則. 而呈單個(gè)或兩個(gè)相鄰的陽(yáng)性細(xì)胞，則細(xì)胞核形態(tài)相對(duì)比較規(guī)則（圖1）.    2.3致癇大鼠齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平的影響各組大鼠齒狀回BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在SGZ，齒狀回顆粒細(xì)胞層與門區(qū)BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞均較少. 電針穴位刺激后，明顯促進(jìn)了大鼠致癇后7，14 d時(shí)齒狀回的神經(jīng)發(fā)生水平，BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較相應(yīng)對(duì)照組明顯增加（P<0.01），而致癇后第4

19、2日時(shí)兩組大鼠齒狀回BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著性差異（P0.05，圖2）.A：叢集性分布的BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞；    B：?jiǎn)蝹€(gè)或兩個(gè)分布的BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞. 箭頭所示為BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞.    圖1大鼠致癇后齒狀回亞顆粒增生帶BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布模式×400    圖2大鼠致癇后電針穴位刺激對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)齒狀回BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的影響    3討論    眾所周知，在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的漫長(zhǎng)發(fā)展過(guò)程中積累了大量理論和實(shí)踐

20、經(jīng)驗(yàn)的針灸穴位治療癲癇是一種非藥物性的抗癇治療手段，其療效在眾多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者中已達(dá)成共識(shí)，其具有的安全、簡(jiǎn)便易行且副作用小的特點(diǎn)更是為大家廣泛接受. 但是由于對(duì)針灸穴位刺激治療癲癇的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域目前尚缺乏深入的實(shí)驗(yàn)研究，使得針灸穴位治療癲癇的工作在臨床推廣和提高其療效上受到了極大的限制. 近年來(lái)，人們應(yīng)用BrdU標(biāo)記細(xì)胞分裂的方法，發(fā)現(xiàn)在小鼠、大鼠、兔、豚鼠、鳥、猴及人腦中均有神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象，只不過(guò)這些發(fā)生現(xiàn)象僅局限于腦內(nèi)某些特定區(qū)域，如海馬齒狀回亞顆粒增生帶(subgranular proliferative zone, SGZ)和前腦腦室下帶(subventricular zone, SVZ

21、)等. 在某些生理刺激和包括癲癇發(fā)作在內(nèi)病理狀態(tài)下，這些部位的神經(jīng)發(fā)生水平明顯增高，并且國(guó)內(nèi)、外一些相關(guān)研究結(jié)果也表明癲癇后的海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生即神經(jīng)可朔性的改變可能與癲癇發(fā)作的易感性密切相關(guān). 由于海馬是與癲癇發(fā)作有關(guān)的重要解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，并且針灸穴位刺激所產(chǎn)生的調(diào)節(jié)腦內(nèi)乙酰膽堿(Ach),內(nèi)啡肽(ED),5羥色胺(5HT)等中樞介質(zhì)，以及可以使興奮性氨基酸的含量下降, 抑制性氨基酸水平相對(duì)或絕對(duì)升高等廣泛生理學(xué)效應(yīng)均參與了癲癇后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的過(guò)程4. 因此，我們有理由相信穴位電刺激治療癲癇有可能最終是通過(guò)影響腦內(nèi)與癲癇發(fā)作有關(guān)的解剖學(xué)部位神經(jīng)發(fā)生即可塑性變化而發(fā)揮療效的.由于以往我們進(jìn)

22、行的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果已經(jīng)顯示了電針刺激百會(huì)穴對(duì)改善致癇大鼠腦電圖和行為學(xué)表現(xiàn)的作用，證實(shí)它的抑癇效果. 因此，本研究中我們重點(diǎn)觀察了電針刺激百會(huì)穴對(duì)致癇大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平的影響. 結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)大鼠注射匹羅卡品后均出現(xiàn)癲癇發(fā)作，其行為學(xué)改變大致相同，大鼠停止癲癇發(fā)作經(jīng)過(guò)520 d后進(jìn)入慢性自發(fā)反復(fù)發(fā)作期，在此期間電針穴位刺激干預(yù)組大鼠平均每周SRSs次數(shù)明顯少于電針刺激對(duì)照組和無(wú)刺激對(duì)照組大鼠. 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)各干預(yù)組大鼠齒狀回BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在SGZ，齒狀回顆粒細(xì)胞層與門區(qū)BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞均較少. 電針穴位刺激干預(yù)組大鼠致癇后7 d, 14 d時(shí)齒狀回BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)

23、胞數(shù)目較相應(yīng)對(duì)照組明顯增加，而致癇后第42日時(shí)兩干預(yù)組大鼠齒狀回BrdU免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著性差異. 這一結(jié)果表明電針刺激百會(huì)穴可促進(jìn)癲癇后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平的改變，即電針刺激百會(huì)穴在一定的程度上參與了癲癇后海馬的神經(jīng)可塑性變化. 而相對(duì)于致癇后第42日時(shí)兩干預(yù)組大鼠齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平無(wú)顯著性差異這一現(xiàn)象，我們認(rèn)為它的出現(xiàn)可能與進(jìn)入慢性期后對(duì)照干預(yù)致癇大鼠SRSs次數(shù)明顯多于電針穴位刺激治療干預(yù)大鼠有關(guān)，是這種多次的自發(fā)反復(fù)發(fā)作對(duì)齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響干擾了結(jié)果，還是電針穴位刺激治療的時(shí)效性導(dǎo)致這一現(xiàn)象，我們尚不清楚.根據(jù)以往的研究結(jié)果，我們知道癲癇后海馬的神經(jīng)可塑性改變除了神經(jīng)發(fā)生以外，

24、還包括了苔蘚纖維出芽以及突觸重建等多種組織結(jié)構(gòu)的變化，所有的這些可塑性的改變都有可能導(dǎo)致局部異常放電神經(jīng)元的功能和結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期改變，從而參與糾正清楚中樞神經(jīng)系統(tǒng)中業(yè)已形成的異常放電的錯(cuò)誤行為印跡的過(guò)程，進(jìn)而影響癲癇的進(jìn)程和結(jié)局12-13，但從另一個(gè)層面來(lái)講局部神經(jīng)元的功能和結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期改變又可導(dǎo)致新的異常放電形成，增強(qiáng)易感性. 總之，致癇后海馬局部神經(jīng)可塑性的改變是一個(gè)異常復(fù)雜的過(guò)程，據(jù)包括我們實(shí)驗(yàn)在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步認(rèn)定電針穴位刺激治療癲癇的解剖學(xué)基礎(chǔ)可能與海馬部位存在的神經(jīng)發(fā)生有著密切的聯(lián)系，但它們之間的關(guān)聯(lián)性還有待我們進(jìn)一步探索.    【參考文獻(xiàn)】1 Eri

25、ksson PS, Perfilieva E, BjorkEriksson T, et al. Neurogenesis in the adult human hippocampusJ. Nat Med, 1998,4（11）:1313-1317.2 Dash PK, Mach SA, Moore AN. Enhanced neurogenesis in the rodent hippocampus following traumatic brain injuryJ. J Neurosci Res, 2001,63(4):313-319.3 Wang WD, Jiang W, Wang HD,

26、 et alStudy of neurogenesis in the dentate gyrus after global ischemia reperfusion in ratsJ. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,23(8):673-677.4 郭向陽(yáng)，郭英民，郭誠(chéng)杰.針灸治療癲癇的研究進(jìn)展J.上海針灸雜志,1999,18(6):41-46.5 金淵真，李忠仁.針灸治療癲癇研究概況J. 針灸臨床雜志,2004,20（5）：63-64.6 李國(guó)良,肖波,謝光潔，等. 匹羅卡品顳葉癲癇大鼠模型J.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003,28(1):29-32.7 Jones DM, Esmaeil N, M

27、aren S, et al. Characterization of pharmacoresistance to benzodiazepines in the rat Lipilocarpine model of status epilepticusJ. Epilepsy Res， 2002,50(3):301-312.8 Loscher W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and diseasemodifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and poststatus epilepticus models of temporal lobe epilepsyJ. Epilepsy R