胎腎細(xì)胞懸液對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦ERα表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究

1、胎腎細(xì)胞懸液對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦ER表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究    摘要：目的 研究胎腎細(xì)胞懸液對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠下丘腦ER表達(dá)的影響。方法 取未交配健康SD雌性大鼠56只，隨機(jī)分為4組,即A、B、C、D組。A組行假手術(shù),B、C、D組行OVX手術(shù)。術(shù)后8周,A、B組給予生理鹽水,C組給予苯甲酸雌二醇,D組給予胎腎細(xì)胞懸液。藥物治療4周后,通過(guò)觀察骨組織形態(tài)學(xué)判斷骨代謝發(fā)生的變化；用放免法檢測(cè)血清E2，GH水平；用免疫組化和RT-PCR法觀測(cè)ER在下丘腦的表達(dá)。結(jié)果 與A組比較，B組大鼠骨小梁稀疏，排列紊亂，骨小梁間隙明顯增大,ER表達(dá)及血清E2、GH水平明顯下降；

2、與B組相比, C、D組E2水平增高，ER表達(dá)及血清GH水平隨之上升；C組與D組比較，ER表達(dá)及血清激素水平無(wú)明顯差異。結(jié)論 腎虛骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制為腎精不足，骨髓，腦髓失養(yǎng)，表現(xiàn)在下丘腦垂體生長(zhǎng)激素軸的調(diào)控失常，胎腎細(xì)胞懸液具有類(lèi)激素樣作用，可能通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨代謝。關(guān)鍵詞 胎腎細(xì)胞懸液 下丘腦 雌激素受體 骨質(zhì)疏松 Effects of fetal renal cell suspension(FRCS) on expression of estrogen receptor(ER)in hypothalamus DA Chenxing, xi,an 710021 , Z

3、HENG Qinglian, xi,an 710061, Wang Yuqiang, tian jing 300162 , ChinaAbtract: Objective To investigate the effects of fetal renal cell suspension(FRCS) on expression of estrogen receptor(ER)in hypothalamus. Methods Fifty six female SD rats were divided randomly into four groups: SHAM group(group A),OV

4、X group（group B）,OVX+E group(group C),and OVX+ FRCS group(group D).Eight weeks after operation, the rats in group A and group B were treaded with sodium chloride, the group C was treated with estrogen, the group D was treated with FNCS. All of the rats were sacrificed after four weeks.The changes in

5、 bone metabolism were judged by the bone tectology. Immunohistochemistry and RT-PCR methods were used to observer the changes in the expression of ER-.Radioimmunoassay was performed to detect the serum levels of growth hormone and estrogen. Results: Compared with group A, the form of bone trabecula

6、is sparser and mussier and trabecula separation is wider in group B ,meanwhile the expression of ER,and serum levels of incretion was decreased. Compared with group B, estrogen was increased in group C、D, meanwhile the expression of ERand the level of growth hormone were increased. No difference was

7、 shown between group C and group D. Conclusion: Deficiency of kidney-essence resulting in the non-nourishing of marrow and brain as the pathologic mechanism of kidney deficiency type osteoporosis could be revealed, showed as the abnormal regulation of hypothalamus-pituitary-GH core, FRCS can regulat

8、e bone metabolism from neural internal secretion system.Key word FRCS hypothalamus ER Osteoporosis0 引言胎腎屬動(dòng)物類(lèi)補(bǔ)腎中藥，前期從骨轉(zhuǎn)化生化方面，骨形態(tài)計(jì)量學(xué)，骨密度，骨礦含量和骨生物力學(xué)等角度研究了胎腎細(xì)胞懸液防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（OP）的機(jī)理機(jī)制1,2。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)“腎藏精，精生髓，髓充于骨，匯聚為腦”即腎-髓海(腦髓)-骨(骨髓)密切相關(guān)的理論，采用去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的經(jīng)典模型，以胎腎細(xì)胞懸液為試劑，研究補(bǔ)腎藥對(duì)骨代謝的影響與下丘腦雌激素受體、生長(zhǎng)激素水平之間的關(guān)系，是探討“腎主骨”理論的神經(jīng)

9、內(nèi)分泌代謝網(wǎng)絡(luò)可行而有效的途徑。1、  材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組3月齡未交配健康SD雌性大鼠60只,體重(310±20)g,孕19-21天SD大鼠,普通級(jí)，均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件一致。1.2 藥物 胎腎細(xì)胞懸液制備:按照文獻(xiàn)3:將孕19-21天同種SD母鼠,脫臼處死,無(wú)菌取出胎腎,去除腎包膜、腎蒂,并將其剪碎,移入200目尼龍網(wǎng),用5mL注射器針芯研磨,邊研磨,邊用生理鹽水沖洗,收集細(xì)胞懸液。苯甲酸雌二醇:西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn),生理鹽水稀釋配成0.25mg/mL溶液。1.3主要儀器設(shè)備及試劑雌激素(E2)、生長(zhǎng)素（GH）放免試劑盒均購(gòu)自

10、天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。 ER一抗，二抗，免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。引物由陜西先鋒生物有限公司設(shè)計(jì)并合成,ER其上下游引物序列分別為5-CGCCGCCTACGAGTTCAAC-3, 5-TCGCTGCTGCTGGAGAGTC-3,擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度為354bp,-actin為內(nèi)對(duì)照。其上下游引物序列分別為5-ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC-3, 5-CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG-3,擴(kuò)增的基因片段長(zhǎng)度為148bp。Taq酶為北京鼎國(guó)生物有限公司, TaKaRa Reverse Transcriptanse M-

11、MLV，Trizol均為上海Sagaon生物工程公司產(chǎn)品提供。1.4模型的建立 將56只大鼠隨機(jī)分為2組, 其中一組14只為假手術(shù)組（A）,另一組46只為造模組。參照文獻(xiàn)4建立去卵巢骨質(zhì)疏松模型。1.5 動(dòng)物分組及給藥術(shù)后1周,將造模組存活的健康大鼠42只稱(chēng)重后,隨機(jī)分為模型組14只(B)、雌激素組16只(C)、胎腎組16只（D），術(shù)后8周開(kāi)始給藥，A、B組予理鹽水按2 mL/kg尾靜脈注射,C組按0.1mL/kg苯甲酸雌二醇劑量肌注 ,D組按2 mL/kg劑量，尾靜脈注射胎腎細(xì)胞懸液。各組每周2次，連續(xù)干預(yù)處理4周。1.6 指標(biāo)測(cè)定及主要實(shí)驗(yàn)方法激素水平測(cè)定：動(dòng)物麻醉后，由右心室抽取血液 8

12、-10mL，離心分離血清，放免法測(cè)定E2 ，GH水平。骨組織形態(tài)學(xué)觀察：取大鼠左側(cè)股骨遠(yuǎn)端1/3，HE染色觀察骨形態(tài)學(xué)變化。 大鼠下丘腦ER表達(dá)檢測(cè)：各組大鼠中隨機(jī)選取8只做免疫組織化學(xué)。采用左心室灌注固定法取材，完整剝離出大鼠腦組織，截取由視角叉至乳頭體一段腦組織，經(jīng)固定，脫水，浸蠟，包埋后，冠狀面連續(xù)切片，每只動(dòng)物挑選1張切片，S-P法做免疫組化，在10×40高倍視野下觀察ER的陽(yáng)性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野應(yīng)用倒置顯微鏡觀察并拍照，并利用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性目標(biāo)積分光密度分析。 大鼠下丘腦ER-mRNA表達(dá)檢測(cè)：RT-PCR法取下丘腦組織，

13、按照TRIZOL方法說(shuō)明書(shū)提取RNA。紫外分光光度計(jì)下測(cè)定，A280/A260RNA的比值鑒定總RNA純度，均在1.72.0之間，并行瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性；取1g總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)；在反應(yīng)體系中加入反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，dNTP，Taq酶，上游引物和下游引物，對(duì)ER-、-actin進(jìn)行同管擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94預(yù)變性,2min, 94變性,30S，退火57,30S，延伸72,1min,共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，然后72延伸10min停止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5瓊脂糖凝膠電泳，紫外線(xiàn)下拍照。并用Hema凝膠成像分析系統(tǒng)行條帶OD值檢測(cè)，計(jì)算目標(biāo)帶與內(nèi)參的OD比值并記錄。1.7 統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)分析處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( )表示,采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組間單因素方差分析，兩兩間比較用LSD法。2 結(jié)果2.1 胎腎細(xì)胞懸液對(duì)骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的影響 光鏡下HE染色切片可見(jiàn)假手術(shù)組骨小梁聯(lián)結(jié)成網(wǎng)，排列整齊，骨小梁間隙較小。與假手術(shù)組比較，模型組空白組骨小梁稀疏，排列紊亂，間隙增大。胎腎組和雌激素組骨小梁連接成網(wǎng)，排列整齊，與假手術(shù)組比較骨小梁間隙較大，與模型空白組比較骨小梁間隙明顯縮小，與雌激素陽(yáng)性對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異。 2.2 各組大鼠血清激素水平( ) 與假手術(shù)組比較，模型組血清E2 ，GH明顯降低（P<0.01），雌激素組可以提高去卵巢

15、大鼠E2 ，GH水平（P<0.01），胎腎組亦能提高去卵巢大鼠E2 ，GH水平（P<0.01），與雌激素組比較，胎腎組與其無(wú)顯著差異（P>0.05）。見(jiàn)表1表1 各組大鼠血清激素水平 n=14                項(xiàng)目            假手術(shù)組(A)   

16、         去勢(shì)組(B)            雌激素組(C)            胎腎組(D)              

17、;      E2（pmol/l）            390.552 119.65            86.143 14.094            183.216 34

18、.955            154.302 13.437                    GH(ug/l)            3.249 0.71

19、9            2.148 0.229            3.102 0.271            3.012 0.587        &#

20、160;    2.3胎腎細(xì)胞懸液對(duì)下丘腦ER表達(dá)的影響( ) 見(jiàn)附圖一ER陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，模型組下丘腦ER顯著低于假手術(shù)組（P<0.01），給予雌激素和胎腎細(xì)胞懸液后ER水平增高（P<0.05），與雌激素組比較，胎腎組與其無(wú)顯著差異（P>0.05）。見(jiàn)表2 表2 各組大鼠下丘腦ER免疫反應(yīng)陽(yáng)性目標(biāo)擊分光密度分析 n =8                項(xiàng)目  

21、60;         假手術(shù)組（A）            去勢(shì)組(B)            雌激素組(C)            胎腎組(D)&

22、#160;                   ER                              

23、;                               2.4 胎腎細(xì)胞懸液對(duì)下丘腦ERmRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)附圖二PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后ERmRNA分別于354bp（ER），148bp（-actin）見(jiàn)到條帶，與設(shè)計(jì)引物相符。半定量RTPCR分析，模型組下丘腦ERmRNA顯著低于假手

24、術(shù)組（P<0.01），給予雌激素和胎腎細(xì)胞懸液后ERmRNA水平增高（P<0.01），與雌激素組比較，胎腎組與其無(wú)顯著差異（P>0.05）。 見(jiàn)表3 表3 各組大鼠下丘腦ERm RNA表達(dá)水平分析 n=6                項(xiàng)目            假手術(shù)組（A）  

25、          去勢(shì)組(B)            雌激素組(C)            胎腎組(D)             

26、;       ERm RNA            1.529 0.48102            0.761 0.237            1.497 0.52

27、68            1.45633 0.528             3 討論本實(shí)驗(yàn)證明，胎腎細(xì)胞懸液能夠明顯提高血清E2 、GH水平，以及 ER在下丘腦的表達(dá)，從而增強(qiáng)神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能，改善OP的病理狀態(tài)，其作用機(jī)理，根據(jù)目前國(guó)內(nèi)成果分析可能與以下因素有密切關(guān)系。下丘腦是重要的神經(jīng)內(nèi)分泌中樞，能夠合成分泌多種神經(jīng)遞質(zhì)和肽類(lèi)物質(zhì)，對(duì)骨的生長(zhǎng)，

28、代謝亦具有重要作用。免疫組化方法顯示大鼠下丘腦廣泛分布有雌激素受體免疫反應(yīng)物(ER immunoreactivity, ER-IR)5，存在ER、ER兩種類(lèi)型，雌激素主要通過(guò)與ER結(jié)合發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)大鼠E2水平明顯下降，下丘腦ER表達(dá)隨之減少。可能由于卵巢切除造成E2缺乏，無(wú)法調(diào)節(jié)ER的生物合成,導(dǎo)致受體下調(diào)或退用性萎縮,最終引起功能異常6。給予雌激素和胎腎細(xì)胞懸液后，ER含量明顯增加，與雌激素組比較，胎腎組與之無(wú)顯著差異，說(shuō)明胎腎細(xì)胞懸液具有“類(lèi)激素”樣作用。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠去卵巢后與假手術(shù)組比較，血清中GH水平明顯下降，給予雌激素和胎腎細(xì)胞懸液后，GH水平升高。其原因可

29、能是下丘腦ER能夠誘導(dǎo)GH的分泌。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，雌激素能夠改變成年動(dòng)物神經(jīng)元結(jié)構(gòu)7。生長(zhǎng)素釋放激素神經(jīng)元主要集中于下丘腦，其神經(jīng)纖維伸入正中隆起，對(duì)垂體前葉GH的合成及分泌進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)。而大部分生長(zhǎng)素釋放激素神經(jīng)元內(nèi)含雌激素受體，是雌激素在下丘腦的靶細(xì)胞之一8。去卵巢后大鼠GH水平明顯下降，推測(cè)由于去卵巢后E2水平降低，造成生長(zhǎng)素釋放激素神經(jīng)元中的ER減少，使生長(zhǎng)素釋放激素的靶細(xì)胞水平下降，從而導(dǎo)致腺垂體細(xì)胞分泌GH減少9。而GH對(duì)骨的生長(zhǎng)、代謝及骨量維持具有重要作用。其不僅能夠直接刺激成骨細(xì)胞的增殖、分化，同時(shí)也能促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性，亦可通過(guò)誘導(dǎo)腎(或肝)臟自分泌或旁分泌胰島素生長(zhǎng)因子I的合成，作用于成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞,促進(jìn)膠原和硫酸軟骨素的合成及沉積。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中胎腎細(xì)胞懸液能夠明顯改善去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型的病理狀態(tài)，與苯甲酸雌二醇效果相似，推論其機(jī)制，可能為胎腎細(xì)胞懸液具有類(lèi)激素樣作用，通過(guò)提高下丘腦ER的表達(dá)水平，影響下丘腦-垂體-生長(zhǎng)激素軸，刺激GH分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨代謝。可見(jiàn)，胎腎細(xì)胞懸液既可以直接作用于骨組織,亦可以通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)間接作用于骨，構(gòu)成相互制約，極其復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。同時(shí)也將中醫(yī)理論中的腎，腦，骨，生殖有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，使中醫(yī)理論的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵被不斷地揭示和豐富。參 考 文 獻(xiàn)1