生物發(fā)光與仿生學(xué)

1、生物發(fā)光與仿生學(xué)v 生物世界里說到發(fā)光，人們首先會想到螢火蟲，v 生物發(fā)光（bioluminescence）是指生物體發(fā)光或生物體提取物在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)光的現(xiàn)象。它不依賴于有機(jī)體對光的吸收，而是一種特殊類型的化學(xué)發(fā)光，化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿男蕩缀鯙?00%。也是氧化發(fā)光的一種。生物發(fā)光的一般機(jī)制是：由細(xì)胞合成的化學(xué)物質(zhì)，在一種特殊酶的作用下，使化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。生物發(fā)光的分類v 自然界具有發(fā)光能力的有機(jī)體種類繁多。一些細(xì)菌和高等真菌有發(fā)光現(xiàn)象。動物界25個(gè)門中，就有13個(gè)門28個(gè)綱的動物具有發(fā)光現(xiàn)象，從最簡單的原生動物到低等脊椎動物中都有發(fā)光動物，如鞭毛蟲、海綿、水螅、海生蠕蟲、海蜘蛛和魚等。動物的

2、發(fā)光，除其自身發(fā)光即一次的發(fā)光以外，由寄生或共生而產(chǎn)生二次發(fā)光的例子也不少。不同生物體的發(fā)光顏色不盡一致，多數(shù)發(fā)射藍(lán)光或綠光，少數(shù)發(fā)射黃光或紅光。v 螢火蟲的發(fā)光是生物發(fā)光的一種。螢火蟲的發(fā)光原理是：螢火蟲有專門的發(fā)光細(xì)胞，在發(fā)光細(xì)胞中有兩類化學(xué)物質(zhì)，一類被稱作螢光素（在螢火蟲中的稱為螢火蟲螢光素(Firefly luciferin)），另一類被稱為熒光素酶。熒光素能在熒光素酶的催化下消耗ATP ，并與氧氣發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)中產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，當(dāng)氧化熒光素從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)釋放出光子。反應(yīng)中釋放的能量幾乎全部以光的形式釋放，只有極少部分以熱的形式釋放，反應(yīng)效率為95%，甲蟲也因此而不會過熱灼

3、傷。人類到目前為止還沒辦法制造出如此高效的光源。 v 海螢受刺激時(shí)，就把直徑只有萬分之一厘米的熒光素黃色顆粒，和直徑只有萬分之二厘米的無色熒光酶顆粒，以及由發(fā)光腺中產(chǎn)生的粘液一齊排入水中，產(chǎn)生淺藍(lán)色的光。發(fā)光機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)發(fā)光和細(xì)胞外發(fā)光兩類：前者較普遍，以夜光藻為代表；后者為從生物體排放出來的某些腺體中含有能發(fā)光的物質(zhì)。兩者都是通過化學(xué)反應(yīng)將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽?。因放出的能量很微，稱為冷光。節(jié)足動物細(xì)菌細(xì)菌它的反應(yīng)機(jī)制與前三種不同。底物在催化循環(huán)中會形成還原型核黃素磷酸鹽和醛化合物，當(dāng)遇到熒光素酶和氧時(shí)，就會形成一種激發(fā)的絡(luò)合物。絡(luò)合物斷裂時(shí)生成氧化核黃素磷酸鹽、酸、水及一個(gè)光子，波長47050

4、5納米，光為藍(lán)綠色。腔腸動物腔腸動物包括刺絲胞亞門和櫛水母亞門。這種類型發(fā)光具有各種不同的活化反應(yīng)。亞門和綱不同，活化反應(yīng)與激發(fā)特性也不同。此類發(fā)光還可以從一個(gè)發(fā)光種傳遞激發(fā)態(tài)能量給另一個(gè)發(fā)光種，即有敏化生物發(fā)光現(xiàn)象。這種發(fā)光可發(fā)出不同顏色的光，較多地偏向紅色，波長480490納米。過氧化氫生物v包括海筍屬、蚯蚓屬及柱頭蟲屬等。這類發(fā)光包括兩個(gè)過程，蟲熒光素與氧或過氧化物單獨(dú)或兩者作用后先生成超氧陰離子（自由基），然后再激發(fā)。生物發(fā)光的應(yīng)用活體生物發(fā)光成像技術(shù)v 活體動物體內(nèi)光學(xué)成像主要采用生物發(fā)光與熒光(種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記。

5、利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為。通過這個(gè)系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動物以獲得數(shù)據(jù)。1. 標(biāo)記細(xì)胞v (1) 癌癥與抗癌藥物研究v 直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可對癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測和評估。活體生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。精諾真生物成像技術(shù)提高了檢測的靈敏度，即使微小的轉(zhuǎn)移灶也能被檢測到(可以檢測到體內(nèi)102個(gè)細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移)。目前已商品化的腫瘤細(xì)胞株包括：前列

6、腺癌,黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，子宮頸癌和結(jié)腸癌等 BiowareTM細(xì)胞系模型。v將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可用于實(shí)時(shí)觀測活體動物體內(nèi)干細(xì)胞造血過程的早期事件及動力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞，檢測放射及化學(xué)藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制。應(yīng)用可見光活體成像原理標(biāo)記細(xì)胞，建立動物模型，可有效的針對同一組動物進(jìn)行連續(xù)的觀察，節(jié)約動物樣品數(shù)，同時(shí)能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達(dá)的改變。(2) 免疫學(xué)與干細(xì)胞研究v 當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性

7、，細(xì)胞不能發(fā)光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，活化的caspase-3在特異識別位點(diǎn)切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。(3) 細(xì)胞凋亡2. 標(biāo)記病毒標(biāo)記病毒(1) 病毒浸染以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對機(jī)體的侵染過程。(2) 基因治療基因治療包括在體內(nèi)將一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到靶細(xì)胞。可應(yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因用于載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否

8、能夠在試驗(yàn)動物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達(dá)。這種非侵入方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中, 用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況。3. 標(biāo)記細(xì)菌v(1) 細(xì)菌浸染研究v可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌侵染活體動物, 觀測其在動物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應(yīng)。v(2) 抗生素藥物v利用標(biāo)記好的細(xì)菌在動物體內(nèi)對藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機(jī)構(gòu)可用這種成像技術(shù)進(jìn)行藥物篩選和臨床前動物實(shí)驗(yàn)研究。近年來，國際上大型制藥公司紛紛將精諾真技術(shù)在動物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為FDA(美國食品和藥品檢驗(yàn)局)藥物申報(bào)材料中非常重要的臨床前動

9、物實(shí)驗(yàn)部分。v(1) 組織特異性基因表達(dá)v熒光素酶(luciferase)是一類生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識別不同的底物, 一種細(xì)胞可被這兩種熒光素酶標(biāo)記: renilla 熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動子驅(qū)動, 作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化; firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達(dá)活性。v(2) 蛋白質(zhì)相互作用v觀察細(xì)胞中或活體動物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA

10、，然后導(dǎo)入細(xì)胞或動物體內(nèi)表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強(qiáng)相互作用時(shí)，表達(dá)的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑。v(3) 阻斷RNAv通過對比生物發(fā)光的變化，驗(yàn)證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達(dá)。4. 基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用v(1) 基因表達(dá)v為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況，從而實(shí)現(xiàn)對目的基因的研究。可用于研究動物發(fā)育過程中特定基因的時(shí)空表達(dá)情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)，以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。v(2) 各種疾病模型v研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記，同時(shí)轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤