稀土元素共摻羥基磷灰石納米粒子制備及生物成像應(yīng)用

1、武漢理工大學碩士學位論文 稀土元素共摻羥基磷灰石納米粒子制備及生物成像應(yīng)用 謝云飛 武漢理工大學 （申請工學碩士學位論文）稀土元素共摻羥基磷灰石納米粒子制備及生物成像應(yīng)用培養(yǎng)單位：材料科學與工程學院學科專業(yè)：材料科學與工程研究生：謝云飛指導教師：韓穎超 副研究員2016年 5月IV分類號 密 級 UDC 學校代碼 10497 學 位 論 文題 目 稀土元素共摻羥基磷灰石納米粒子的制備及生物成像應(yīng)用 英 文 Prepration of rare earth elements co-doped hydroxyapatite 題 目 nanocrystals and its application

2、in bioimaging 研究生姓名 謝云飛 指導教師姓名 韓穎超 職稱 副研究員 學位 博士 單位名稱 武漢理工大學 郵編 430070 申請學位級別 工學碩士 學科專業(yè)名稱 材料科學與工程 論文提交日期 2016年 5 月 論文答辯日期 2016年5月 學位授予單位 武漢理工大學 學位授予日期 2016年6月 答辯委員會主席 王欣宇 評閱人 王友法 吳慶知 2016年 5月獨 創(chuàng) 性 聲 明本人聲明，所呈交的論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得武漢理工大學或其他教育

3、機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。簽 名： 日 期： 學位論文使用授權(quán)書本人完全了解武漢理工大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即學校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人承諾所提交的學位論文（含電子學位論文）為答辯后經(jīng)修改的最終定稿學位論文，并授權(quán)武漢理工大學可以將本學位論文的全部內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存或匯編本學位論文。同時授權(quán)經(jīng)武漢理工大學認可的國家有關(guān)機構(gòu)或論文數(shù)據(jù)庫使用或收錄本學位論文，并向社會公眾提供信息服務(wù)。（保密的論文在

4、解密后應(yīng)遵守此規(guī)定）研究生（簽名）： 導師（簽名）： 日期中文摘要癌癥的早期診斷是實現(xiàn)有效治療的關(guān)鍵。具有熒光、磁性和放射性等功能的納米材料可以實現(xiàn)腫瘤的標記和早期診斷。基于熒光納米顯影劑的熒光成像技術(shù)應(yīng)用簡便，可以實現(xiàn)腫瘤的定位，提高手術(shù)清除率。羥基磷灰石（HAP）基于其獨特的晶體結(jié)構(gòu)，可作為一種稀土發(fā)光基質(zhì)材料。納米HAP在細胞內(nèi)酸性環(huán)境中表現(xiàn)出良好的可降解性。因此，稀土摻雜納米HAP是一種生物相容、生物降解的熒光成像顯影劑。目前的研究主要致力于增強其熒光，提高成像靈敏度。提高稀土含量或高溫煅燒雖可改善熒光性能，但會帶來細胞毒性和過大的顆粒尺寸。為避免上述問題，本論文基于稀土離子間能量傳遞

5、機制，開展了稀土（REs）共摻雜納米HAP（HAP:REs）的熒光增強研究。（1）基于共沉淀法，研究了REs組合、比例和溫度對HAP:REs熒光性能的影響規(guī)律。結(jié)果表明，在Eu/Tm、Eu/Tb和Eu/Gd組合中，Eu/Gd共摻具有最佳的熒光增強效果。Eu/Gd共摻未改變產(chǎn)物的晶相組成，產(chǎn)物為片狀納米粒子（913×3060nm）；80合成的HAP:Eu/Gd，當Eu/Gd=2:1.5時，表現(xiàn)出最佳的熒光增強效果，相對單摻Eu樣品（HAP:Eu）提高了約150%（394nm激發(fā)）。600煅燒后，樣品整體熒光強度得到大幅提高，且Eu/Gd=2:0.5時表現(xiàn)出最佳的熒光增強效果，相對HAP

6、:Eu提高了約60%，但煅燒造成了晶體團聚和尺寸長大。對于Eu/Gd共摻的熒光增強效應(yīng)，273nm激發(fā)時，6PJ(Gd3+)能級與5HJ(Eu3+)能級間的能量轉(zhuǎn)移起主要作用；394nm激發(fā)時，主要是Eu/Gd的合作上轉(zhuǎn)換和連續(xù)能量轉(zhuǎn)移的共同作用。（2）基于共沉淀法制備HAP:Eu/Gd所優(yōu)化的Eu/Gd比例，又研究了溶膠凝膠法對HAP:Eu/Gd性能的影響。該法中，在450600較低溫度下可以制備出稀土共摻的HAP納米粒子。溶膠凝膠法產(chǎn)物在350nm激發(fā)下，主發(fā)射峰位于576nm，且與600煅燒的沉淀法合成產(chǎn)物（394nm激發(fā)，發(fā)射峰616nm）的熒光強度相當。該法制備過程中，存在的氧化還原

7、反應(yīng)所釋放出的熱量利于稀土離子向Ca(II)位置的擴散，主要處于反演中心。與沉淀法相比，雖然同樣帶來了顆粒尺寸長大和團聚，但該法可以更加精準控制產(chǎn)物元素比例。（3）對于沉淀法（80）合成的HAP:Eu/Gd納米粒子，詳細研究了其生物安全性、生物降解性能以及體內(nèi)外的熒光成像能力。結(jié)果證實，HAP:Eu/Gd納米粒子未造成溶血，對L02細胞未表現(xiàn)出毒性，在HepG2細胞內(nèi)72h的降解率達到約60%，共培養(yǎng)4h后，可以被HepG2腫瘤細胞大量內(nèi)吞、可實現(xiàn)細胞內(nèi)熒光顯影成像。體內(nèi)實驗證明（腹腔和尾靜脈注射），可以實現(xiàn)組織內(nèi)熒光成像，但易被RES系統(tǒng)清除，集中于肝、脾等，故后續(xù)需進行表面改性降低RES系

8、統(tǒng)清除率。關(guān)鍵詞：生物成像，Eu/Gd共摻雜，羥基磷灰石，熒光增強，納米顆粒AbstractEarly detection of tumor malignancy is the crucial element for efficient treatment of cancer. Nano materials with properties of fluorescence, radioactivity and magnetism are helpful for labeling and early diagnose of cancer cells. The fluorescent imaging

9、 technology which is based on the luminescent materials is convenient for location of tumor and can improve the clearance of surgery.Hydroxyapatite (HAP) can be used as rare earth luminescence host materials based on its unique crystal structure. Furthermore, nano HAP shows good biodegradation in ac

10、id environment of cells. Therefore, rare earths doped HAP is promising to be a kind of biocompatible and biodegradable fluorescent imaging contrast agent. Current researching is focus on the improvement of fluorescent intensity to obtain higher imaging sensitivity. Calcination at high temperature an

11、d increase rare earth contents can improve luminescent intensity, but overlarge particle size and cytotoxicity will be induced. To avoid those problems, the study on rare earths (REs) co-doped HAP nano crystals (HAP:REs) with luminescence enhanced based on the energy transfer mechanism among rare ea

12、rths was carried out in this paper. (1) Based on co-precipitation, the effect of co-doping group and molar ratios of REs as well as calcination on the luminescent properties of HAP:REs were studied. Results showed that among groups of Eu/Tm, Eu/Tb and Eu/Gd, Eu/Gd co-doping has the best luminescent

13、enhancement efficiency. The crystal composition of products were not changed by REs co-doping, and the obtained HAP:Eu/Gd were plate-like crystals (9-13×30-60 nm) in plain size. For HAP:Eu/Gd synthesized at 80 oC, when Eu/Gd is 2:1.5, HAP:Eu/Gd has the best luminescent enhancement effect, and c

14、omparing to Eu single doped HAP samples (HAP:Eu) the luminescent intensity is improved about 150% (excited at 394 nm). After calcined under 600 oC, the luminescent intensity increased sharply, and when Eu/Gd is 2:0.5, HAP:Eu/Gd shows best luminescent enhancement effect, the luminescent intensity is

15、improved about 60% compared to HAP:Eu, but calcination leaded to the crystals aggregation and overlarge particles size. For the luminescence enhancement mechanism of Eu/Gd co-doping, when excitated at 273 nm, it is mainly induced by energy transfer from 6PJ (Gd3+) to 5HJ (Eu3+); at 394 nm, it is att

16、ributed by the combination of Cooperation Upconversion and Successive Energy Transfer process between Eu and Gd.(2) Based on the optimized Eu/Gd molar ratio of HAP:Eu/Gd prepared by co-precipitation, the properties of HAP:Eu/Gd prepared by sol-gel were studied. At low temperatures of 400-600 oC, HAP

17、:Eu/Gd nano crystals can be obtained. When excited at 350 nm, the main emission peak was observed at 575 nm and the intensity was similar to the products obtained by precipitation and calcined under 600 oC (excited at 394 nm and emission peak at 616 nm). In this preparation method, the processs of R

18、Es diffused to Ca(II) site was accelerated by the existed redox reacton, and REs elements were mainly at the inversion centres. Compared to precipitation, particles aggregation and overlarge size are also appeared, but elements ratios of products can be accurately controlled by this metod.(3) For HA

19、P:Eu/Gd nanocrystals obtained at 80 oC, biosafety, biodegradation and fluorescence imaging in vitro and in vivo were fully evaluated. Results demonstrated that HAP:Eu/Gd nanoparticles didn't cause hemolysis and showed no cytotoxicity to L02 cells. The accumulative degradation rate in HepG2 cells

20、 were about 60%. After co-cultured for 4h with HepG2 cells, HAP:Eu/Gd could be easily uptaken and achieved bioimaging in cells. Animal experiments in vivo (intraperitoneal and tail vein injection) showed that HAP:Eu/Gd can be used for bioimaging in tissues. However, HAP:Eu/Gd were cleared by RES and

21、 mainly accumulated in organs such as liver, spleen et al, so the surface of HAP:Eu/Gd nano crystals should be modified to reduce the clearance rate by RES in further researching works.Key words: bioimaging, Eu/Gd co-doping, hydroxyapatite, fluorescent enhancement目 錄中文摘要IAbstractIII第一章 緒論11.1 納米材料在生

22、物成像領(lǐng)域的應(yīng)用概述11.1.1 熒光量子點11.1.2 有機小分子納米顆粒21.1.3 金屬納米簇21.1.4 稀土摻雜納米材料31.2 羥基磷灰石納米粒子概述41.2.1 HAP的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)41.2.2 HAP納米粒子的合成與制備41.2.3 HAP納米粒子的應(yīng)用71.3 稀土摻雜HAP納米材料用于生物成像的研究現(xiàn)狀81.4 研究內(nèi)容及意義9第二章 稀土共摻HAP納米粒子的沉淀法制備及性能研究112.1 引言112.2 實驗部分112.2.1 原料和儀器112.2.2 沉淀法制備過程122.2.3 材料的性能表征測試方法132.3 結(jié)果與討論分析152.3.1 不同稀土元素組合和比例的熒光

23、增強效果152.3.2 HAP:Eu/Gd納米顆粒的性能表征162.3.3 HAP:Eu/Gd的熒光性能分析242.3.4 煅燒熱處理對HAP:Eu/Gd的性能影響262.3.5 Eu/Gd共摻HAP的熒光增強機理探討302.4 本章小結(jié)33第三章 HAP:Eu/Gd的溶膠凝膠法制備及性能研究353.1 引言353.2 實驗過程353.2.1 原料和儀器353.2.2 HAP:Eu/Gd的溶膠凝膠法制備過程353.3.3 性能及表征363.3 結(jié)果與討論363.3.1 TG-DSC分析363.3.2 相組成和結(jié)構(gòu)373.3.3 熒光性能分析393.3.4 形貌、粒徑分布及元素分析413.3.5

24、 與沉淀制備法的比較433.4 本章小結(jié)44第四章 HAP:Eu/Gd的生物相容性及熒光成像應(yīng)用454.1 引言454.2 實驗部分454.2.1 原料、試劑和儀器454.2.2 實驗方法和步驟464.3 實驗結(jié)果與討論514.3.1 HAP:Eu/Gd納米顆粒的生物安全性514.3.2 細胞對納米顆粒的攝取534.3.3 細胞內(nèi)的熒光成像554.3.4 體外的生物降解評價564.3.5 活體小動物體內(nèi)熒光成像584.3.6 體內(nèi)組織分布594.4 本章小結(jié)60第五章 結(jié)論與展望615.1 全文總結(jié)615.2 研究展望62參考文獻63致謝70攻讀碩士學位期間的研究成果71ii武漢理工大學碩士學

25、位論文第一章 緒論1.1 納米材料在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用概述生物成像是指通過一些成像方式將生物體內(nèi)外的機體組織信息和機體活動變化規(guī)律以一種直觀的圖像信息表達出來的診斷和分析方法1。近年來，許多具有超高的時間和空間分辨率的成像技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用于生物醫(yī)學成像領(lǐng)域，常見的分子成像方法主要包括核醫(yī)學成像方式（如PET、SPECT等）、磁成像方式（如EPRI、MRI）、X射線成像（如CT）、超聲成像（如UEI）和光學成像（如FMT）以及多模成像等2。相比于其他各種成像方式，光學成像具有成像對比度較好、成本低廉、時間/空間分辨率較高以及對生物體損傷性小等優(yōu)點，在生物影像學的研究中受到了越來越廣泛的關(guān)注3。目

26、前，用于光學成像的顯影劑材料主要分為有機小分子熒光素4、稀土摻雜熒光納米顆粒5、量子點6和熒光金屬簇7等幾大類。1.1.1 熒光量子點熒光量子點（QDs）是一種由Cd、Se、Te、In、As、P、Ge和S等元素構(gòu)成的二元納米晶，常見的量子點主要有GaAs、CdSe和SrTe等8。相比于常規(guī)的塊體材料，量子點的尺寸小于激子波爾半徑因而不僅具有獨特的半導體電學性能，還具有特殊的光學性質(zhì)，例如良好的光化學穩(wěn)定性，在UV區(qū)具有寬的吸收譜帶，具有從紫外到近紅外呈對稱分布的熒光光譜9。九十年代以前，量子點的應(yīng)用研究主要集中于電子學與光學領(lǐng)域；在90年代以后，人們開始關(guān)注量子點材料在納米醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用尤其是

27、在細胞及體內(nèi)成像熒光探針方面的應(yīng)用得到了廣泛的關(guān)注10。早在1998年，Chan和Bruchez等11,12在Science雜志報道了關(guān)于水溶性量子點的合成及通過表面修飾來與生物大分子相結(jié)合的研究，成功開啟了量子點納米材料在生物染色和醫(yī)學診斷中的應(yīng)用先河。Pan等13通過聚乙烯二醇-脂質(zhì)體修飾量子點/介孔二氧化硅核殼納米粒子來防止表面的QDs被氧化，從而提高了量子點的生物相容性和穩(wěn)定性，實現(xiàn)了對MCF-7癌細胞的高效熒光標記。Park等14將玻璃酸（HA）和石墨烯量子點（GQD）相結(jié)合制備出了一種具有高效率靶向給藥的GQD-HA納米材料，這種多功能的量子點材料不僅能實現(xiàn)生物熒光成像，還能同時具

28、有靶向給藥與治療等功能。近幾十年來，雖然國內(nèi)外許多研究組針對量子點在生物熒光領(lǐng)域的應(yīng)用展開了一系列的研究，并且已經(jīng)取得了一定的研究成果。然而量子點材料要想成為一種可實際應(yīng)用于生物醫(yī)學的影像材料，其還存在許多問題需要解決，例如量子點的特異性識別能力和水溶性問題5。特別地，當量子點組成中的重金屬成分釋放到體內(nèi)后，會對生物機體帶來長期和短期的重金屬毒性問題，這些生物安全性的問題極大限制了量子點在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用15。1.1.2 有機小分子納米顆粒有機染料（Organic Dyes）小分子具有種類繁多、熒光強度高、吸收截面高等特點，是目前生物成像中應(yīng)用最為廣泛的熒光材料4,16。但是，有機熒光染料作

29、為生物探針普遍存在以下不足：在生物體內(nèi)易富集、水溶性差、光穩(wěn)定性差和發(fā)光閃爍等17,18。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，利用納米粒子作為載體與有機染料小分子相結(jié)合的方法，不僅可以改善有機染料的水溶性來提高其體內(nèi)的生物相容性，還可以有效解決熒光探針在體內(nèi)易聚集、造成熒光猝滅的問題，大大提高熒光穩(wěn)定性。目前，有機納米顆粒熒光探針的研究主要是采用無機載體（如硅材料或碳材料）或者高分子納米載體（高分子膠束或脂質(zhì)體）來裝載有機染料，同時對載體進行表面修飾18,19。Ramanjaneya等20將胞嘧啶與改性2，1，3-苯并噻二唑熒光標記物通過脂肪鏈連接在一起，制備出了一種生物相容的、能發(fā)射紅色熒光的有機熒光納米顆

30、粒，這種顆粒能有效滲入巨噬細胞、癌細胞，對細胞質(zhì)進行染色，實現(xiàn)了快速且簡便的體內(nèi)長期的熒光標記。Wang等21成功地將一種或幾種有機染料摻入到硅納米顆粒（SiNPs），得到了多功能的SiNPs，能對生物組織進行多重標記。并且硅納米基體材料能有效阻止染料的光漂白和聚集后導致的猝滅效應(yīng)，從而使得這種熒光探針具有較好的生物相容性和光穩(wěn)定性，有望對生物體進行實時和長期的觀察。雖然經(jīng)過與納米載體材料復合后的有機染料具有更好的光穩(wěn)定性和生物安全性，但是有機納米熒光材料作為一種新型生物熒光探針，要成為具有實用價值、成本低廉的生物成像探針，還需對載體的潛在毒性和染料裝載量進行更深入的研究。1.1.3 金屬納米

31、簇金屬納米簇（Metal Nanoclusters，NCs）是由一定數(shù)量的金屬原子以金屬-金屬鍵結(jié)合起來構(gòu)成的具有熒光特性的單分子材料，尺寸一般小于2納米。貴金屬納米簇具有優(yōu)良的光穩(wěn)定性、高熒光強度和大的斯托克斯位移等光學特性和超小納米尺寸，在生物熒光標記和分子檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用前景，尤其以金、銀、鉑為代表的貴金屬納米簇的細胞和活體動物成像應(yīng)用成為近年來人們研究的熱點之一22-24。Li等25合成了牛血清白蛋白（BSA）包裹金納米簇，并首次觀察到了電化學發(fā)光（ELC）現(xiàn)象，還發(fā)現(xiàn)這種BSA包裹Au納米簇對于Hg2+的檢測具有選擇性和較高的靈敏度。Shiang等26發(fā)明了一種用巰基十一烷

32、酸修飾金納米顆粒的方法，基于熒光猝滅原理成功地對雙氧水和葡萄糖等小分子進行有效識別和精準的檢測。Wu等27開發(fā)了一種新型的近紅外金納米簇（AuNPs）顯影劑，成功實現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤細胞的熒光標記，動物體內(nèi)成像結(jié)果表明在EPR效應(yīng)的作用下，這種AuNPs易于富集在腫瘤區(qū)域并能存留較長時間，驗證了AuNPs作為體內(nèi)腫瘤熒光成像顯影劑的可能性。盡管貴金屬納米簇作為新型造影劑顯示出了許多優(yōu)異特性，但金屬納米簇的細胞靶向標記以及與其他生物分子之間的相互作用機理還尚不明確28,29。此外，如何更加便捷地制備出具有光、磁等多功能的金屬納米粒子及其在人體特殊的生理環(huán)境中的新陳代謝過程也還有待進一步的研究30,31

33、。1.1.4 稀土摻雜納米材料稀土摻雜發(fā)光納米材料一般由基質(zhì)材料、敏化離子和激活離子組成。在眾多熒光材料中，稀土摻雜納米材料是一類具有多色發(fā)光性質(zhì)以及其他物理化學特性的光學材料。由于稀土離子特殊的電子層結(jié)構(gòu)，處于內(nèi)層的4fn電子層在外層電子層的屏蔽下不容易受外界晶體場的干擾32，因而稀土離子摻雜納米材料往往展現(xiàn)出優(yōu)異的光學和磁學性能，在體內(nèi)和體外的生物檢測中具有較高的靈敏度、良好的光穩(wěn)定性、窄的發(fā)射譜帶和穩(wěn)定的化學性質(zhì)3,33。通常，稀土納米材料按照尺寸和形貌可以分為稀土摻雜納米棒（NRs）、納米球（NSs）和納米顆粒（NPs）；按照發(fā)光機制的不同，NPs一般可以分為上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs

34、）和下轉(zhuǎn)換納米顆粒（DCNPs）。DCNPs一般是在紫外或可見光的激發(fā)下發(fā)射出可見光或近紅外光，在單一稀土離子或多種離子間的能量傳遞作用下，DCNPs的量子產(chǎn)率可以超過100%；而UCNPs的發(fā)光過程與DCNPs的相反，在吸收紅外光光子后可以發(fā)出紫外到紅外的熒光34,35。傳統(tǒng)上，稀土摻雜納米材料常被應(yīng)用于固體激光器、現(xiàn)實照明設(shè)備等領(lǐng)域，隨著生物納米技術(shù)的發(fā)展，已有越來越多的研究報道了稀土摻雜納米材料在定量分析、體內(nèi)檢測、細胞標記和活體成像等生物方面的應(yīng)用36-39。Wang等40采用改進水熱法首次合成出了同時具有靶向藥物釋放和生物成像雙功能的GaOOH:Cr3+納米粒子。Wu等33制備出了尺

35、寸小于10納米的EuOF:153Sm顆粒，經(jīng)聚乙二醇表面改性后得到能用于X-CT和SPECT雙模成像的PEG-EuOF:153Sm，進一步的生物實驗表明該材料具有低的長期體內(nèi)毒性和較長的血液滯留時間，初步驗證了其作為一種體內(nèi)生物顯像劑的可行性。1.2 羥基磷灰石納米粒子概述1.2.1 HAP的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HAP）與哺乳動物體內(nèi)的骨骼及牙齒等硬組織中的主要無機質(zhì)具有相似化學組成和結(jié)構(gòu)41。符合化學計量的HAP具有良好熱穩(wěn)定性，Ca/P摩爾比為1.67，可微溶于水和體液中，在水中溶解度約為0.4ppm42。HAP的晶型為六方晶系，具有六方棱柱體的晶體結(jié)構(gòu)，對

36、稱型為L6PC對稱，點群類型屬于P63/m(176)空間群。在HAP的平行六面體單位晶胞結(jié)構(gòu)中，4個Ca2+離子在C3對稱位置，處于6個O原子組成的八面體中心位置，稱為Ca2+(I)離子；6個Ca2+離子在CS對稱位置，處于3個O原子組成的配位體中心，稱為Ca2+(II)離子。2個OH-離子處在HAP晶胞的頂角位置，分別位于Z=l/4和Z=3/4的面上。6個由PO43-形成的PO4配位四面體與Ca-O多面體以共頂或共面的方式相連接，使得HAP具有良好的晶體穩(wěn)定性43。HAP的晶體結(jié)構(gòu)中的Ca2+易于被其他半徑和電荷相近的金屬離子（例如：Sr2+，Cu2+，Zn2+，Al3+等）所取代，形成金屬

37、離子摻雜羥基磷灰石；OH-可被其它種類的陰離子或基團所取代(例如CO32-，SO42-，F(xiàn)-等等)，得到含其他陰離子基團的磷灰石44。在發(fā)生離子取代后，羥基磷灰石的晶格常數(shù)、溶解度和熱穩(wěn)定性可能會有一定的變化，但通常情況下仍然會保持六方晶體結(jié)構(gòu)。1.2.2 HAP納米粒子的合成與制備鑒于納米級的HAP材料具有許多獨特的物理化學以及生物學特性，發(fā)展HAP納米粒子的合成與制備技術(shù)具有非常重要的價值。隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，羥基磷灰石納米粒子的合成制備技術(shù)也已經(jīng)有了長足的進步。目前，HAP納米粒子的制備合成途徑大體可以分為液相法和固相法兩大類，其中固相制備法產(chǎn)量高，容易獲得化學計量的、結(jié)晶度高的產(chǎn)物

38、，但是制備過程往往需要在高溫下進行較長時間的熱處理，而且所獲產(chǎn)物往往團聚成塊體材料，因此需要進一步的研磨才能獲得納米尺度的HAP粒子。液相法可以在較低溫度下，快速且簡便地獲得納米HAP，但是產(chǎn)物結(jié)晶度不高，而且元素比例會偏離化學計量比45。下面主要介紹液相法中制備HAP納米粉體比較常用的方法。1.2.2.1 沉淀法采用沉淀法來制備納米粉體材料是工業(yè)生產(chǎn)上最為常見的方法。該法制備HAP的主要原理是含鈣離子溶液和含磷酸根溶液按照特定的摩爾比在一定條件下相混合后并不斷攪拌，混合溶液發(fā)生反應(yīng)并生成HAP沉淀，然后將所得沉淀產(chǎn)物根據(jù)需要進行熱處理后可得到HAP粉體。在制備過程中需要控制反應(yīng)物濃度、攪拌速

39、度和陳化時間等工藝因素來獲得具有理想的晶體形貌、尺寸大小等的產(chǎn)物粒子。王璐等人46以Ca(NO3)2乙醇溶液和(NH4)2HPO4水溶液為前驅(qū)體，用化學沉淀法制備了HAP納米粉體，發(fā)現(xiàn)pH值過高或過低都會使產(chǎn)物的Ca/P嚴重偏離1.67，pH為10.5時，可獲得組分單一的HAP納米顆粒。Murtaza等47通過化學沉淀法，以Ca(OH)2和H3PO4為原料合成出了HAP納米粒子并在不同溫度下熱處理，發(fā)現(xiàn)鈣磷比和晶粒尺寸受煅燒溫度影響，在600以下能得到比較純凈的HAP。沉淀法制備HAP納米粒子具有操作簡便、成本低等優(yōu)點，但是制備出來的HAP納米粒子往往結(jié)晶度低，并且鈣磷比偏低。因此往往需要將沉

40、淀產(chǎn)物進行煅燒處理，由此帶來的納米粒子團聚問題以及晶體尺寸問題對其在生物學的應(yīng)用造成了一定的阻礙。1.2.2.2 水熱法水熱法常用來制備結(jié)晶度高、Ca/P比接近化學計量值的HAP納米材料，其主要過程是：以水或其他液體為反應(yīng)介質(zhì)，在反應(yīng)釜中的高溫高壓條件下，反應(yīng)物發(fā)生化學反應(yīng)生成的產(chǎn)物結(jié)晶得到HAP，水熱法所制備的HAP的結(jié)晶度往往較高。徐光亮等人48以一定的Ca/P摩爾比混合CaCO3和CaHPO4，通過水熱合成制備了粒度小于100納米、分散性好、晶體發(fā)育完整的HAP粉體。Yang等49采用一種簡便的水熱合成法合成了HAP納米粒子，通過調(diào)控反應(yīng)參數(shù)得到了具有不同形貌的粒子，并對HAP納米粒子的

41、形貌形成機理進行探討，為HAP納米粒子及其他納米材料的可控合成提供了思路。然而，水熱合成法能耗高，合成的產(chǎn)物粒徑分布通常較寬。1.2.2.3 溶膠-凝膠法溶膠-凝膠法（sol-gel）制備HAP納米粉體的主要工藝過程是：首先將鈣鹽均勻分散在含磷的有機溶劑（一般為醇）中，然后鈣離子在溶劑中發(fā)生水解形成絡(luò)合體得到溶膠，隨著溶劑的蒸發(fā)減少，溶膠逐漸聚合膠化形成濕凝膠，濕凝膠在干燥后變成干凝膠，此時的干凝膠成分一般為無定型磷酸鈣和未反應(yīng)的前驅(qū)物，所以往往需要在低溫下熱處理才能獲得具有良好結(jié)晶度的純HAP粉體，但經(jīng)過燒結(jié)后，顆粒呈團聚狀態(tài)，需要經(jīng)過研磨之后才能得到納米HAP。Sol-gel法所需的煅燒溫

42、度較低，產(chǎn)物粒子的化學均勻性和表面活性較好，化學計量比精準，適合于制備元素摻雜材料。劉昌勝等50將硝酸鈣和磷酸三甲酯溶解在乙醇水溶液中，經(jīng)陳化得到溶膠，干燥后的凝膠在低溫下快速生成HAP晶體，粒徑在50nm左右，研究還發(fā)現(xiàn)溶劑中合適的乙二醇含量和pH值有助于形成穩(wěn)定、均一的溶膠。秦湘閣等51用溶膠-凝膠法制備了納米HAP，研究了煅燒溫度和時間等因素對產(chǎn)物的影響，并結(jié)合第一性原理計算和實驗結(jié)果，計算了該法制備的HAP粉末經(jīng)熱處理的晶體結(jié)構(gòu)特性。溶膠凝膠制備方法具有化學均勻性好，煅燒溫度低等優(yōu)點，但制備過程中磷酸鹽易發(fā)生分解，且制備的粉體易團聚52。1.2.2.4 自燃燒法自燃燒法是在溶膠凝膠法基

43、礎(chǔ)上衍生出來的一種新型的納米HAP制備方法，其基本原理是利用硝酸鈣與羧酸在低溫下發(fā)生氧化還原反應(yīng)，反應(yīng)物實現(xiàn)自發(fā)燃燒同時快速生成產(chǎn)物粉末。相比于溶膠-凝膠法，自燃燒法的制備周期較短，實驗過程簡便。反應(yīng)物在合成過程中處于原子或分子水平的分散狀態(tài)，使得產(chǎn)物具有精準的化學計量比。加之自燃燒法的化學反應(yīng)在低溫下快速進行，因此所得產(chǎn)物同時具有較小的粒徑且粒子分布均勻。王欣宇和韓穎超等53,54首次采用自燃燒法，以硝酸鈣、磷酸氫二銨、檸檬酸為反應(yīng)原料，調(diào)節(jié)pH到3左右，在低溫下發(fā)生自燃燒，經(jīng)750煅燒后合成出了純相HAP，平均粒徑為85nm，分布均勻，并進一步對自燃燒法合成HAP的工藝參數(shù)以及合成機理進行

44、了分析探討。1.2.2.5 微乳液法微乳液法制備HAP納米粉體的工藝原理是：在表面活性劑、助表面活性劑、油和水所形成的穩(wěn)定水包油或者油包水型微乳液體系中，以微小水池作為反應(yīng)容器，反應(yīng)物的水溶液在微小水池中發(fā)生化學反應(yīng)并生成低結(jié)晶度的磷酸鈣納米粒子，經(jīng)過水和乙醇的反復洗滌以去除雜質(zhì)后，并在一定溫度下進行熱處理，最終得到HAP納米粒子。通過選擇不同的表面活性劑及助劑，可得到不同形貌的粒子，且形貌單一均勻。另外，通過微乳液法合成出的HAP粒子具有分散均勻性好、晶體尺寸小的優(yōu)點。李世普等55在AOT/異辛烷/正辛醇/水微乳液體系中，將Ca(H2PO4)2溶液與飽和Ca(OH)2水溶液發(fā)生反應(yīng)得到了HA

45、P，納米顆粒呈單分散的圓球狀，實現(xiàn)了對HAP的形貌可控合成。郭廣生等56以吐溫-80/正丁醇/環(huán)己烷為微乳液反應(yīng)體系制備的HAP納米粉體具有柱狀形貌、單分散特性，粒子直徑在2025nm，長2864nm。微乳液制備法能實現(xiàn)粒子的形貌可控合成，極大地改善粒子的分散性從而減少團聚，但是其反應(yīng)體系的組成比較復雜，微乳液中含有多種化合物，給合成產(chǎn)物的分離及提純提高帶來了一定困難，操作復雜所需成本較高。1.2.3 HAP納米粒子的應(yīng)用納米尺度的HAP粒子不僅具有良好的生物學性能，而且對小分子物質(zhì)、金屬離子等也表現(xiàn)出了非常好的吸附能力。目前，HAP納米粒子除了在臨床上用于骨修復和骨替代材料，在藥物載體，污水

46、處理，癌癥治療等方面的應(yīng)用也成為了人們的研究熱點。1.2.3.1 骨替代材料國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，利用人工合成HAP納米粉體與生物高分子材料相結(jié)合的復合材料既具有良好的生物可降解性、骨誘導性和骨組織結(jié)合性，又能獲得較好的抗彎曲、韌性和抗疲勞性等優(yōu)點，在骨替代材料領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景57。武漢理工大學王欣宇等人58將含有Na-Ca-Mg-P系統(tǒng)生物玻璃的納米HAP粉末與檸檬酸混合均勻并壓制成型，在一定的燒結(jié)工藝下制備出多孔HAP陶瓷，這種仿骨材料具有貫通的孔隙且孔隙的大小和分布呈梯度分布，與天然骨結(jié)構(gòu)類似。崔福齋等59利用仿生法制備出了納米HAP/膠原復合材料，與天然骨有類似的成分和微結(jié)構(gòu)，大白兔的體

47、內(nèi)植入實驗表明復合材料植入體與骨組織間能形成界面化學鍵合，表現(xiàn)出了良好的生物兼容性。1.2.3.2 腫瘤治療藥物大量研究表明，HAP納米粒子對某些腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用的同時對正常細胞幾乎沒有不良影響，其本身就有望成為一種抗癌藥物。國外學者Li等60將不同濃度HAP溶液與HL-60細胞體外共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞出現(xiàn)大量凋亡現(xiàn)象。Savic R等61發(fā)現(xiàn)納米粒子在進入癌細胞后主要分布在細胞質(zhì)、細胞膜和細胞核四周等位置，有少量分布在溶酶體、線粒體、高爾基體等細胞器官上。曹獻英等62報道了納米HAP在體外對Bel-7402人肝癌細胞有明顯的抑制作用，但對正常的細胞沒有明顯的增殖抑制作用，并分析抑

48、制癌細胞的作用機理認為HAP納米顆粒進入癌細胞后，胞內(nèi)鈣元素急劇上升，改變了細胞質(zhì)的微環(huán)境，使腫瘤細胞增值過程中停滯在G1期而無法繼續(xù)進入S期，從而抑制癌細胞的增殖。1.2.3.3 藥物載體材料納米HAP作為一種新型藥物載體展現(xiàn)出了許多特點：納米HAP比表面積高，具有非常強的吸附和承載能力，對多種藥物分子都有很好的吸附和承載效果；納米HAP能容易地透過細胞膜進入細胞，作為藥物載體時能有效增加對藥物的吸收能力，還能顯著提高藥物的療效；HAP對人體細胞無毒害作用，是一種可應(yīng)用于生物體內(nèi)的材料。Chardra等63人結(jié)合水熱法和微波法合成了Fe3+摻雜納米HAP，藥物釋放曲線表明載體在裝載抗生素和抗

49、癌藥物后具有很好的藥物緩釋效果并且沒有表現(xiàn)出生物毒性和溶血作用。1.2.3.4 環(huán)境功能材料隨著生態(tài)環(huán)境的惡化，各種新型環(huán)境功能材料的開發(fā)成為人們的研究熱點。納米HAP由于其特殊的化學和晶體特性在水溶液中對有機小分子和金屬離子有非常好的吸附作用，因此在廢水中的重金屬回收和處理等方面的應(yīng)用受到人們的關(guān)注。劉羽等64研究了人工合成HAP納米材料對水溶液中Pb+、Cd2+和Hg2+等離子的吸附容量和吸附平衡時間，結(jié)果表明，納米HAP對溶液中的多種重金屬離子有著良好的吸附和交換作用，與天然磷礦石相比，人工合成的納米HAP對污水中的重金屬處理效果更好，溶液pH值、HAP納米粒子的形貌及濃度等因素都會對吸

50、附效果造成影響。1.3 稀土摻雜HAP納米材料用于生物成像的研究現(xiàn)狀HAP納米粒子早已被證明是一種生物相容性好、生物活性高和生物可降解的材料，在臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于硬組織修復材料。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注HAP納米材料在新型生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是作為生物熒光成像或磁成像的顯像劑材料。然而，HAP納米粒子本身并沒有磁性能或光學性能等特性，一般是通過與其他功能材料復合或者用帶有某些特性的元素進行摻雜來得到功能化的HAP納米粒子。特別地，許多稀土元素因其特殊的4f電子層結(jié)構(gòu)而擁有優(yōu)異的光學或者磁性能。而HAP的晶體結(jié)構(gòu)適合于稀土離子摻雜，摻雜某種或多種稀土元素后的羥基磷灰石能夠具有熒光或

51、磁性，從而有望應(yīng)用于生物成像材料。目前，已有許多研究者在稀土摻雜HAP的合成及成像應(yīng)用等方面做了大量的研究工作。Li等65利用Tb3+對HAP納米粒子進行改性，改性后的離子在488nm激發(fā)光下能發(fā)射出穩(wěn)定的綠色熒光，與MSCs細胞共培養(yǎng)后通過激光共聚焦顯微鏡下檢測到了胞內(nèi)材料發(fā)出的熒光，但其沒有證明Tb離子是存在于HAP晶格中還是吸附在HAP表面。Han等66制備了Eu3+摻雜HAP并對Bel-7402人體肝癌細胞進行了標記，標記后的細胞分別在藍光和綠光的激發(fā)下觀察到了明顯的綠色和紅色熒光信號，與細胞共培養(yǎng)6.5h后，由于胞內(nèi)溶酶體對HAP的溶解作用，胞內(nèi)的熒光強度開始減弱。Liu等67通過水

52、熱法合成了Gd3+摻雜HAP納米棒，T1弛豫率達到5.49 s-1/mM，可以作為一種MRI造影劑。進一步的動物體內(nèi)實驗表明，HAP:Gd納米棒進入體內(nèi)后可以快速被單核巨噬細胞所清除，24h后肝臟和肺中的納米棒基本被清除掉，但脾臟中仍存在HAP:Gd顆粒。Chen等68人制備了Eu3+/Gd3+共摻雜的HAP納米棒，這種HAP:Eu/Gd納米棒同時擁有熒光性能和磁性能，熒光強度和磁飽和強度可以通過改變Eu和Gd的摻雜量進行調(diào)整，通過裸鼠體內(nèi)的熒光成像和MRI成像實驗表明，這種雙功能的稀土共摻HAP在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大優(yōu)勢。1.4 研究內(nèi)容及意義熒光標記探針在癌細胞的早期成像診斷及治療應(yīng)

53、用上，越來越受到人們的廣泛關(guān)注。然而傳統(tǒng)的熒光探針往往存在著光穩(wěn)定性差、生物毒性等各種問題。因此，獲得一種標記效果好、生物相容好的熒光材料是目前研究的主要目的。HAP因其較好的生物活性、良好的體內(nèi)外生物安全性和生物可降解性等特點，在臨床上已經(jīng)成功應(yīng)用于骨替代和骨修復工程。HAP晶格中Ca2+易于被某些金屬離子Mx+(如Sr2+、Zn2+、Mg2+等）所取代，形成離子摻雜改性的HAP，從而實現(xiàn)HAP的功能化。稀土離子具有與Ca2+相近的離子半徑和電荷，很容易取代Ca2+摻入到晶格中占據(jù)Ca2+位點形成發(fā)光中心，同時不明顯改變HAP的物理化學性質(zhì)。目前，已有大量的研究工作報道了不同稀土元素單一摻雜

54、羥基磷灰石熒光粒子的制備及在生物成像應(yīng)用。然而，單一稀土摻雜的HAP在細胞成像中仍有許多問題有待完善，最重要的是如何進一步提高稀土摻雜HAP材料的熒光信號以便更易于被檢測到。傳統(tǒng)上，提高稀土摻雜HAP材料的熒光性能主要方法有兩種。一種是提高稀土離子的摻雜量以便獲得更強熒光輸出；另一種是提高材料煅燒溫度和延長煅燒時間來增加材料結(jié)晶度以獲得良好熒光信號。然而，大量提高稀土離子含量不僅可能導致稀土離子的熒光猝滅還容易造成材料的細胞毒性增加；隨著煅燒溫度和時間的增加，雖然材料結(jié)晶度得到提高會有效增強熒光強度，但同時材料晶粒尺寸會過度長大，同時顆粒硬團聚嚴重，導致材料很難通過細胞內(nèi)吞的方式進入細胞內(nèi)。這

55、些問題都對稀土摻雜HAP在生物熒光探針應(yīng)用及定量檢測分析應(yīng)用上提出了挑戰(zhàn)。因此，在本課題中，基于稀土元素之間的敏化發(fā)光現(xiàn)象，通過一種敏化稀土離子協(xié)同增強另一種激活稀土離子的熒光，實現(xiàn)在低稀土含量下的高熒光強度。本論文中，從不同稀土元素組合中篩選出Eu/Gd元素共摻雜羥基磷灰石，制備出的HAP:Eu/Gd納米粒子與單摻Eu的HAP相比，熒光強度得到提高，在外磁場下還表現(xiàn)出了一定的磁響應(yīng)性。進一步的體外生物實驗對其生物相容性和降解性進行了評價，最后驗證了體內(nèi)標記和體外熒光標記的可行性，為其在腫瘤細胞成像及其他生物醫(yī)學應(yīng)用提供了可能性。本論文的主要研究內(nèi)容為：（1）從不同稀土元素組合中篩選出具有最佳

56、熒光增強效果的稀土元素組合Eu/Gd。采用XRD、SEM、XPS等手段對沉淀法合成出的HAP:Eu/Gd納米粒子進行了表征分析，同時研究了600煅燒后HAP:Eu/Gd性能變化。文中還對Eu/Gd共摻雜的熒光增強機理進行了探討。（2）采用PAA溶膠凝膠法合成了HAP:Eu/Gd，對熒光性能、相組成和機構(gòu)、形貌和粒徑大小、分散性等進行了表征分析，探索了煅燒溫度和時間等工藝因素對HAP:Eu/Gd的性能影響，并和沉淀法制備方法進行對比分析。（3）針對沉淀法制備的HAP:Eu/Gd納米粒子進行了生物相容性和生物降解性評價，最后對其作為細胞熒光標記和體內(nèi)熒光成像應(yīng)用進行了評估。75第二章 稀土共摻HAP納米粒子的沉淀法 制備及性能研究2.1 引言HAP是一種生物相容的無機材料，在臨床上作為骨科和牙科材料已經(jīng)被廣泛使用。HAP納米材料所表現(xiàn)出來的良好吸附性能和離子交換能力，使得它在基因和藥物載體、環(huán)境污染治理以及生物成像標記等方面也展現(xiàn)出了潛在的巨大應(yīng)用價值。目前，已有許多