丹參的生物技術(shù).

1、丹參的生物技術(shù)摘要 ：現(xiàn)代生物工程技術(shù)是進行中藥材品質(zhì)改良的可行途徑之一。 本 文對丹參的組織培養(yǎng)、 毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)及基因工程等方面的研究進展 與具體方法以及目前存在的問題做一綜述。關(guān)鍵詞 ：丹參 生物技術(shù) 細胞與組織培養(yǎng) 基因工程 毛壯根培養(yǎng)一、概述中藥丹參是唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物丹參 ( Salvia miltiorrhiza Bunge ) 的干燥根及根莖 , 因其色紅且形狀似參而得 名“丹參” , 又稱血參、紫丹參、紅丹參等。丹參作為一傳統(tǒng)中藥在 我國沿用已久 , 始載于神農(nóng)本草經(jīng) , 被列為上品。本草經(jīng)疏、 本草綱目中都有記載。丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的 功效 ,

2、 主治冠心病、心絞痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)等癥。 近年來研究發(fā)現(xiàn)用來治療心血管疾病 , 療效顯著。丹參屬于用量較大的常用藥材。丹參商品野生、家種均有 (50 年 代以前野生為藥用主要來源，僅有四川一地有家種產(chǎn)品， 60 年代后 全國各地均有引種 ) 。野生資源主要分布于河北、北京、山西、山東、 湖北，湖南、遼寧、江蘇、江西、云南、貴州、甘肅、陜西；家種則 主要分布于河北、天津，江蘇、上海、浙江、安徽、河南、山東、四 川等省。當(dāng)中，以四川中江等地栽培品為最佳。 二、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及研究所取得的成果現(xiàn)代生物技術(shù)是以基因工程、細胞工程、發(fā)酵工業(yè)、酶工程、生化工程以及后來衍生出來的第二代、 第

3、三代的蛋白質(zhì)工程、 抗體工程 和糖鏈工程等為主體的高新技術(shù) , 它被看作是 21 世紀(jì)科學(xué)技術(shù)的核 心?？v觀這一領(lǐng)域 ,生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化首先是從醫(yī)藥領(lǐng)域開始的 , 現(xiàn)代 生物技術(shù)的發(fā)展使醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)生了革命性的變化 。近 10 多年來, 從 天然產(chǎn)物中尋找新的生理活性成分或先導(dǎo)化合物以開發(fā)新藥已成為 全球關(guān)注和研究的熱點。由于野生藥材資源日益枯竭 , 人工栽培品種品質(zhì)不穩(wěn)定 , 生物技 術(shù)的興起對傳統(tǒng)藥材的生產(chǎn)展示了廣泛的應(yīng)用前景。 為了提高品質(zhì) , 滿足市場需求 , 近年來利用細胞工程、 基因工程等現(xiàn)代生物工程技術(shù) 對丹參作了深入的應(yīng)用性研究。（一）離體培養(yǎng)丹參試管苗的增殖蔡朝暉等研究表明：以

4、丹參葉為外植體，接種在附加6-BA 0.5 1 mg/L的MS培養(yǎng)基上出芽效果最好。試管苗轉(zhuǎn)移到 1/2MS附加IBA 0. 2 mg/L 的培養(yǎng)基上生根效果最好。另有報道 ： 在含有不同激素組 合的 B5 固體培養(yǎng)基上建立的丹參不定根培養(yǎng)物在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn) 生了 4種主要的丹參酮類，在IAA或NAA配合有或無6-BA的B5培養(yǎng) 基中不定根生長很快 ; 當(dāng)加入 IBA 于培養(yǎng)基中時得到了丹參酮的最高 生產(chǎn)量 , 液體培養(yǎng)基中不定根培養(yǎng)物的丹參酮含量超過 80mg/g（DW）（6 倍于親體植物根中的含量 ） ；通過丹參的快速繁殖，試管苗移栽到大 田里后 ,6 個月齡的丹參根產(chǎn)生的丹參酮比商品丹

5、參根 （通常來自 3 4 年齡植物 ）高。這些關(guān)于丹參的快速繁殖的研究 , 對丹參的栽培生產(chǎn) 有重要的意義。另外，客紹英 2等比較了不同溫度、不同 pH 值對愈傷組織誘導(dǎo) 的影響，確定以MS為基本培養(yǎng)基，溫度25 C , pH5. 8對丹參莖尖 愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好。趙潔 3 等進一步研究了不同光質(zhì)和溫度對 丹參葉片叢生芽形成的影響 。馮玲玲 等以丹參幼嫩葉片為外植體 進行誘導(dǎo)，測定了在黑暗和光照條件下愈傷組織培養(yǎng)增殖過程中的生 長曲線，并測定了其中可溶性蛋白含量、過氧化物酶活性（POD）和超氧化物歧化酶（SOD活性的變化，表明在光照條件下細胞生長和分化 速度較快 。（二）人工誘導(dǎo)多倍體 多

6、倍體植株由于染色體的加倍，細胞和器官表現(xiàn)出“巨型性”的 特征，因此對外界環(huán)境具有較強的生態(tài)適應(yīng)性和抗逆性。 藥用植物大 多以根、莖和葉等器官為收獲對象，其染色體加倍后，根、莖、葉巨 型化；另一方面， 藥用植物的倍性變化往往能導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物含量 的變化，這就有可能獲得優(yōu)質(zhì)的藥用植物新品種 。高山林 5 等用 10 -50ppm的秋水仙堿已成功誘導(dǎo)出丹參的四倍體株系。 測定結(jié)果表明： 在供試的 10 個多倍體株系中， 3 種丹參酮總含量是對照的 211.1%。 因此，進一步探索采用多倍體技術(shù)培育出高產(chǎn)的丹參多倍體新品種具 有重要的意義。（三）細胞培養(yǎng)陶璐璐 6等用海藻膠包埋丹參愈傷組織細胞，證實

7、了細胞經(jīng)固定 處理后，在培養(yǎng)基中收獲代謝產(chǎn)物是可行性的。 固定化技術(shù)能夠克服 培養(yǎng)過程中的許多缺點諸如細胞過于分散， 不易更換新鮮營養(yǎng)液、 不易挑選優(yōu)質(zhì)細胞系及代謝產(chǎn)物與分散的細胞不易分離等， 因而在生產(chǎn) 中被廣泛應(yīng)用。摸清丹參細胞系在不同生長時期的營養(yǎng)供給條件和相 應(yīng)的激素調(diào)節(jié)是實現(xiàn)用細胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)。 研 究結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基中蔗糖、氮源和硫胺素（VB1）是生產(chǎn)隱丹參酮 和鐵銹醇所必需的，硫酸鹽、MnS04和激動素表現(xiàn)出一些有益的影響， 而MS培養(yǎng)基所有其他成分被認(rèn)為不必需，甚至有抑制作用。B5培養(yǎng)基最適合愈傷的生長，其次是 6,7-V培養(yǎng)基；MS培養(yǎng)基介于兩者之 間

8、。對愈傷懸浮細胞生長的最適蔗糖濃度為3，對迷迭香酸的形成的最適合濃度為 5。植物生長激素 2,4-D 抑制水溶性總酚的形成 , 高濃度的KT能顯著提高總丹參酮的含量。MS+KT1.0mg/L +NAA0.1mg L 對水溶性總酚和丹參酮的形成促進作用最大。WU7 等試驗發(fā)現(xiàn)，以MS為基本培養(yǎng)基時附加0.2mg/LBA 60d后最有利于隱丹參醌的 積累，達到 4.59±0.09mgg 干重。鑒于采取細胞培養(yǎng)在生產(chǎn)次生代 謝產(chǎn)物方面的優(yōu)點， 因此，有必要進一步探索丹參細胞懸浮培養(yǎng)的營 養(yǎng)供給條件， 如培養(yǎng)基中有利的營養(yǎng)成分的最佳配比、 添加量以及添 加的最佳時期與代謝產(chǎn)物的積累規(guī)律之間的

9、關(guān)系等。（四）農(nóng)桿菌介導(dǎo)丹參的遺傳轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法具有簡單易行，成本低，轉(zhuǎn)化率高，拷貝數(shù) 少，遺傳表達穩(wěn)定性較好的優(yōu)點，是一種很有潛力的轉(zhuǎn)化方法。在丹 參研究中，利用轉(zhuǎn)化的組織和器官培養(yǎng)生產(chǎn)丹參中的活性成分是近年 來丹參組織培養(yǎng)的新亮點。宋經(jīng)元、張蔭麟 8 等 , 以根癌農(nóng)桿菌 （ Agrobacterium tumefaciens) 直接感染的方式進行 Ti- 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)丹參冠癭組織 , 篩選 出丹參高產(chǎn)株系 C1,其丹參酮含量是生藥的1.9倍,且在無激素的 67-V 培養(yǎng)基上有利于選擇高產(chǎn)株系 , 并指出利用選出的高產(chǎn)株系在配 合誘導(dǎo)子誘導(dǎo)進行液體靜止培養(yǎng) , 可能是生產(chǎn)丹參酮的

10、可行途徑。王 倩 9 用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來源于構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus midulans) 的HMG基因?qū)氲降⒅?，?jīng)過抗性篩選獲得一批丹參的再生植株。 通過PCR和Southern blotting檢測，證實了 HMG基因已整合到丹參的基因組，并用PT PCR證實了 HMG在mRN水平上的轉(zhuǎn)錄。王麗 娟將采自小麥的抗逆基因 Talea3 整合到丹參基因組中。對轉(zhuǎn)基因丹 參進行耐逆性實驗分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn) Talea3 基因的丹參植株提高了 耐鹽和耐干旱的能力。 上述實驗證實了對丹參進行有目的的遺傳轉(zhuǎn)化 是完全可行的。遺傳轉(zhuǎn)化對丹參的原有特性如株高、產(chǎn)量、生長勢等 是否會造成影響，

11、尚無相關(guān)報道。越來越多的報道表明，一些植物通 過導(dǎo)入外源基因后使其表型發(fā)生變化后， 新獲得的遺傳特性并不都會 穩(wěn)定遺傳， 會發(fā)生轉(zhuǎn)基因失活或轉(zhuǎn)基因沉默的現(xiàn)象， 在丹參的遺傳轉(zhuǎn) 化中是否會發(fā)生這種情況值得關(guān)注。(五) 丹參毛狀根的離體培養(yǎng)黃煉棟 10 等報道利用發(fā)根農(nóng)桿菌 Agrobacterium rhizagenes 誘 導(dǎo)毛狀根，發(fā)現(xiàn)丹參毛狀根可在無外源激素條件下自發(fā)形成再生植 株，生命力旺盛，根系發(fā)達，分枝多。張蔭麟等利用發(fā)根農(nóng)桿菌直接 感染的方式進行 Ri- 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)毛狀根 , 用 Southren 印跡分子雜交 法證實發(fā)根農(nóng)桿菌Ri-質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化到丹參細胞的DNA中,實驗

12、 結(jié)果顯示丹參毛狀根經(jīng) MS+NAA0.1mg/L處理4d后在67-V培養(yǎng)基上 懸浮培養(yǎng) 44 d , 增殖倍數(shù)可達 370.5 倍, 這是常規(guī)培養(yǎng)難以達到的增 殖速度; 而且還證實真菌誘導(dǎo)子對丹參毛狀根丹參酮和隱丹參酮的積 累是有效的 11 。從而顯示毛狀根在生長量的增殖及有效成分的積累方 面的優(yōu)越性。Qiong Yant12等在丹參毛狀根的離體培養(yǎng)過程中，將 添加酵母提取物(YE)、吸收樹脂(X - 5)和半連續(xù)培養(yǎng)模式等多種手段 進行聯(lián)合運用， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛狀根產(chǎn)量可以增加 3 倍以上，而丹參酮的 產(chǎn)量則達到 87.5mgL 培養(yǎng)液，比常規(guī)培養(yǎng)增加了近 15倍。上述研 究表明培養(yǎng)條件和調(diào)控

13、因子對丹參毛狀根的生長及其活性成分的積 累具有極大的影響， 所取得的成果為今后利用丹參毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)大 規(guī)模生產(chǎn)藥用活性成分奠定了基礎(chǔ)， 并為其他名貴藥材資源的可持續(xù) 開發(fā)與利用以及綠色原料藥的生產(chǎn)開辟了一條新途徑。 二、研究的具體方法( 一 ) 丹參組培快繁技術(shù)研究1 、方法外植體用0.1 %洗衣粉浸泡20 min,自來水沖洗數(shù)次，在超凈工 作臺內(nèi)用 75 酒精消毒 30S。 0.1 升汞消毒 6-12 min ，然后用無 菌水沖洗 3 4 次。經(jīng)消毒后的嫩莖切成帶一個腋芽的莖段,葉片切 成0.5 X 0.5 cm2，接種到MS培養(yǎng)基上，30d左右獲得無菌苗，待 無菌苗長至34片葉時，在40

14、X解剖鏡下切取0.2-0.4mm莖尖，在 附加激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 丹參莖尖苗用添加多種激素誘導(dǎo),以篩 選最優(yōu)的增殖和生根方式。愈傷組織和叢生芽誘導(dǎo)用 MS培養(yǎng)基(蔗 糖3 %，瓊脂0.65 %），附加不同種類和濃度的激素 pH5.8，于溫度 28C左右，18001X光照12h/d 培養(yǎng)冋。2、結(jié)果不論丹參的莖或葉外植體， 在以上兩種培養(yǎng)基上， 除污染的材料 外，在一個月的誘導(dǎo)培養(yǎng)期內(nèi)，絕大多數(shù)都能發(fā)生愈傷組織。出發(fā)生 的丹參愈傷組織無色透明或稍暗， 組織發(fā)生后生長較快， 一般在 2 個 月內(nèi)均能將其自母體剝離，進行繼代培養(yǎng)。（二）丹參的基因工程1 、丹參抗病基因工程植物抗病基因工程是指通過基

15、因工程的手段 , 將外源或內(nèi)源的 抗病基因?qū)胫参矬w內(nèi)表達以提高轉(zhuǎn)基因后代的抗病能力。 根據(jù)抗病 對象不同 , 可以分為抗病毒、 抗細菌和抗真菌基因工程。 河北農(nóng)林科 學(xué)院利用生物學(xué)、 電鏡觀察、 血清學(xué)和基因序列測定等方法對丹參花 葉病的病原進行了初步研究 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃瓜花葉病毒 14 （Cucumber mosaic virus , CMV）與該病害密切相關(guān)，同時也 對CM丹參分離物 進行了其CP基因序列分析，并與CM其他株系CP基因進行了比較。 隨后的研究也曾提出將該 CP基因的密碼子變成植物不常用的稀有密 碼子后 , 導(dǎo)入植物后可能達到高抗甚至免疫的效果 , 該研究為下一 步進行丹參

16、的抗病毒基因工程育種奠定了良好的基礎(chǔ)。2、丹參抗逆基因工程目前 , 在植物抗逆基因工程研究方面 , 人們利用現(xiàn)代分子生物 學(xué)手段 , 已經(jīng)能夠在基因組成、 表達調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等分子水平上認(rèn) 識和探索植物的抗逆機制 , 并且也克隆出一些抗逆相關(guān)基因 , 如滲 透調(diào)節(jié)物質(zhì)生物合成關(guān)鍵酶脯氨酸合成酶基因、 LEA 蛋白基因、水通 道蛋白(AQP)基因和抗凍蛋白(APF)基因等。但是，目前植物抗逆基因 工程在丹參方面的研究仍然處于起步階段 , 最近 , 韓立敏 15 等成功 克隆了丹參的抗壞血酸過氧化酶基因 (SmA PX)和丹參谷胱甘肽過氧 化酶基因 (SmGPX) ,并詳細分析了這兩種基因在丹參各

17、部位的表達情 況及表達量與不同鹽脅迫時間和濃度之間的關(guān)系 , 從而開展了丹參 體內(nèi)抗氧化保護酶基因的研究 , 為研究植物在逆境下的生長發(fā)育的 分子機制提供了理論基礎(chǔ)。王麗娟 16 等將源自小麥的抗逆基因 TaLea3 整合到丹參基因組中 , 并對轉(zhuǎn)基因丹參進行耐逆性實驗分 析 , 結(jié)果表明 , 轉(zhuǎn)基因丹參植株提高了耐鹽和耐干旱的能力。 由此可 見 , 利用現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗逆基因轉(zhuǎn)入到丹參中 , 從而獲得新型、 抗逆和高品質(zhì)轉(zhuǎn)基因丹參 , 對丹參品質(zhì)改良和進一步提高藥用成分 的產(chǎn)量具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景。3、丹參次生代謝產(chǎn)物基因工程 植物次生代謝產(chǎn)物基因工程是指利用基因工程技術(shù)對植物次生

18、 代謝途徑的遺傳特性進行修飾或改造， 進而改變目標(biāo)次生代謝物質(zhì)的 量。目前 , 該類研究主要包括代謝關(guān)鍵酶基因工程及其轉(zhuǎn)錄因子或調(diào) 節(jié)基因的基因工程兩個方面通過基因工程途徑， 提高控制某一特定次 生代謝物合成的限速酶活性或在植物中引入新的次生代謝物合成途 徑，可提高轉(zhuǎn)基因植物目標(biāo)次生代謝物的量和合成全新的外源次生代 謝產(chǎn)物。為了能將植物次生代謝產(chǎn)物基因工程技術(shù)也應(yīng)用于丹參 ,以便其藥用活性成分能更進一步積累, 了解丹參藥用活性物質(zhì)的代謝合成途徑的分子機制及其調(diào)控模式, 從分子水平上闡述丹參藥用活性物質(zhì)的代謝途徑和積累規(guī)律成為目前研究的重點 17 。（三）丹參毛狀根培養(yǎng)利用丹參的無菌苗作為試驗材

19、料， 用發(fā)根農(nóng)桿菌 15834 直接感染 的方式進行 Ri- 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)毛狀根。將所獲的丹參毛狀根先在固體 67V-培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)使之增殖。丹參毛狀根10g球狀氣升式反 應(yīng)器培養(yǎng)時，將整個反應(yīng)器裝置連結(jié)好后用0.12Mpa,120 C高壓蒸氣滅菌 20min 冷卻后于超凈工作臺上接入 3.68g 的丹參毛狀根， 并加入 7500ml經(jīng)121 C高壓蒸氣滅菌20min后冷卻至室溫的67V-液體培養(yǎng) 基。反應(yīng)器的通氣量為0.05vvm三角瓶培養(yǎng)是采用1000ml玻璃三角 瓶，內(nèi)裝 250ml 67V- 液體培養(yǎng)基。三角瓶培養(yǎng)培養(yǎng)基的滅菌方法及 毛狀根接種方法與球狀氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)時相同，接

20、種量為 0.12g， 在轉(zhuǎn)速為 150rmp/min 的搖床上進行振蕩培養(yǎng)。所有培養(yǎng)工作都在 25 C和弱光下進行18。（四）丹參的多倍體育種1、化學(xué)誘導(dǎo)異源多倍體 將已鑒定為雜交種的代株系作為材料 , 誘導(dǎo)多倍體的培養(yǎng)基為 MS添加5,15,30,45,60卩g/g 5種不同濃度 的秋水仙堿,2535d后獲得的愈傷組織切成0.5cm直徑團塊接種到 MS+0.4mg/L 62BA,0.1 mg/L IAA 的繁殖培養(yǎng)基上，置于（25 士 1） C 下 光照培養(yǎng) 1 個月。2、生根培養(yǎng) 將試管苗從繁殖培養(yǎng)基上取出 , 分成單株或單芽接種到生根培養(yǎng)基 (1/2MS +0.2 mg/L IBA+0.

21、1 mg/LBA) 上 15d 后即陸 續(xù)長出幼根形成植株 19 。四、目前存在的問題（一）丹參的組織和細胞培養(yǎng)：1、長期以來 , 有用次生代謝物的獲得方法主要是從植株中提取 , 但是, 這種方法必然會導(dǎo)致野生資源逐漸匱乏和滅絕。盡管目前已經(jīng) 有一些重要的藥用物質(zhì)可以采取化學(xué)合成的方法獲得 , 但往往存在工 藝流程復(fù)雜、成本高及易污染環(huán)境等缺點 , 且還有不少結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物 質(zhì)（如人參皂苷 ） 尚難以合成。2、丹參細胞系培養(yǎng)過程中存在許多缺點諸如細胞過于分散 , 不易 更換新鮮營養(yǎng)液、 不易挑選優(yōu)質(zhì)細胞系及代謝產(chǎn)物與分散的細胞不易 分離等 , 。利用固定化技術(shù)可以克服這些缺點。細胞經(jīng)固定處理后,

22、在培養(yǎng)基中收獲代謝產(chǎn)物是可行的。 摸清丹參細胞系在不同生長時期 的營養(yǎng)供給條件和相應(yīng)的激素調(diào)節(jié)是實現(xiàn)用細胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)次 生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)。3、植物組織和細胞培養(yǎng)與微生物發(fā)酵相比 , 生長速度慢、 活性物 質(zhì)產(chǎn)量低。4、適合植物組織和細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器尚有待研究解決。這 里需要指出的是 : 問題的關(guān)鍵不是受制造生物反應(yīng)器工程技術(shù)的制約 而是人們對植物組織和細胞在離體培養(yǎng)條件下的生長與發(fā)育的規(guī)律 了解甚少。在設(shè)計生物反應(yīng)器中濃度較高時 , 培養(yǎng)液成非牛頓流體 , 如何解決充分混合與均一供氧 , 如何克服剪切力對培養(yǎng)細胞造成的傷害等一系列設(shè)計基礎(chǔ)理論研究課題。5、對植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑及所

23、參與反應(yīng)的各種酶的了解 不多, 有的甚至連有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)尚未明確 , 因此對次生代謝的 調(diào)控存在著很大的盲目性。（二）丹參的基因工程 ：目前, 盡管國內(nèi)外在丹參的基因工程研究方面已開展了大量的工 作, 同時也取得了令人鼓舞的成果 , 如丹參抗病毒基因工程和抗逆基 因工程也已經(jīng)逐漸開展、 丹參次生代謝途徑獲得進一步的明確以及利 用生物信息學(xué)方法分離克隆丹參功能基因也步入成熟階段。但是 , 在 丹參基因過程改良研究方面仍然存在著以下幾方面問題 :1、丹參水溶性及脂溶性藥用活性成分生物合成途徑詳細過程亟 待進一步明確和闡明。目前 , 各功能基因在生化合成途徑中的功能雖 部分得到證實 ,但整體而言

24、仍缺乏系統(tǒng)的研究 , 而合成代謝途徑中其 他一些關(guān)鍵酶基因也有待開發(fā)和研究。與此同時 , 在利用基因工程技 術(shù)對植物次生代謝途徑的遺傳特性進行改造 , 進而改變次生代謝物質(zhì) 在植物體中的產(chǎn)量方面 , 對丹參的研究尚屬空白。2、利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法分析丹參品質(zhì)相關(guān)基因的 研究工作 , 不管從覆蓋面和基因數(shù)目方面都十分有限 , 基因的克隆與 分析及其后續(xù)的功能鑒定都有待進一步深化 , 因此, 更多的相關(guān)基因 需要被分離和克隆。3、對于丹參土傳病害的防治仍然停留在化學(xué)農(nóng)藥水平 , 這不僅危 害環(huán)境, 而且會大幅度降低藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。植物抗病基因工程作 為一種新型、清潔的技術(shù) ,正在越來越

25、受到重視 , 然而目前丹參抗病基 因工程研究仍然進展緩慢 , 利用基因工程技術(shù)培育抗病蟲害的優(yōu)良丹 參品種具有極大的開發(fā)潛力。五、研究發(fā)展前景與展望自 1997 年 , 天津天士力集團生產(chǎn)的復(fù)方丹參滴丸首次領(lǐng)取美新 藥“綠卡”，成為世界范圍內(nèi)通過FDA進行新藥臨床開發(fā)預(yù)審的唯一 治療心血管疾病的傳統(tǒng)植物藥以來 ,2000 年該藥又成功通過俄羅斯 衛(wèi)生部批準(zhǔn)的第一例治療心血管疾病的復(fù)方天然植物的處方用藥注 冊 , 獲準(zhǔn)在俄羅斯上市 , 這些都表明中藥作為治療藥物已引起全球 醫(yī)藥界的重視和支持 , 逐步為國際社會所接受。 同時 , 由于我國中藥 在國際中草藥市場上的占有額僅為 3%,因此丹參有廣闊

26、的國際市場前 景和發(fā)展?jié)摿Α?隨著丹參市場的擴大、 需求量的劇增 , 野生丹參資源 已遠遠不能滿足市場的需求 , 而栽培資源只種不選的狀況又使各地 產(chǎn)丹參質(zhì)量參差不齊 , 品質(zhì)退化嚴(yán)重 , 有效成分含量低 , 成為丹參 作為高品質(zhì)植物藥大規(guī)模進軍國際市場的一個最大障礙。 20 因此有必 要應(yīng)用植物細胞工程和基因工程等現(xiàn)代生物工程技術(shù) , 結(jié)合和利用 前人的研究成果 , 通過尋找優(yōu)良產(chǎn)地、 篩選和推廣優(yōu)良品種、 提高有 效成分的含量等有效措施以保證丹參藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性和優(yōu)良性 , 解決丹參供求矛盾、 擴大我國丹參的市場份額及保護丹參的野生資源 促進藥用植物和地區(qū)經(jīng)濟的良性發(fā)展。迄今為止，在丹參生

27、物工程研究方面開展了大量的工作 ，丹參 離體條件下的再生系統(tǒng)已經(jīng)比較成熟、 丹參細胞培養(yǎng)過程中的代謝產(chǎn) 物積累規(guī)律和調(diào)控措施有了初步了解、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已有了一定基礎(chǔ)以及對丹參酮類物質(zhì)生物合成的重要前體物質(zhì)和相關(guān)催化 酶基因也有 了新的認(rèn)識，這些新的成果無疑為利用現(xiàn)代生物工程技 術(shù)來提升丹參的科技含量，最終更好地為人類服務(wù)奠定了基礎(chǔ)21。 但是要想真正利用生物技術(shù)手段來規(guī)?；a(chǎn)丹參酮類藥用活性物 質(zhì)及培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆的丹參新型品系，還有不少研究工作需要開 展，具體如下：(1)進一步了解丹參酮類物質(zhì)生物合成的詳細過程， 闡明其生物合成的代謝規(guī)律和分子機理；(2)借鑒模式植物如擬南芥 及水

28、稻等基因組研究的最新成果，將分子生物學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié) 合，加快丹參品質(zhì)相關(guān)基因的分離克隆與功能鑒定；(3)充分利用成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，大規(guī)模開展丹參的遺傳轉(zhuǎn) 化工作，進行有針對性 的遺傳改良。 隨著丹參生物工程研究的不斷深入，相信在不遠的將 來，利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)大規(guī)模、高效率、低成 本地生產(chǎn)丹參活 性成分的目標(biāo)一定能夠?qū)崿F(xiàn)?！?】蔡朝暉丹參組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的研究，J 中國藥科大學(xué)學(xué)報，1991,22 (2) : 65【2】客紹英，石洪波，馬作東等 利用正交試驗優(yōu)化丹參愈傷組織培養(yǎng)，J 中 藥材，28(2) 82 - 83【3】趙潔，陳志勝，萬鈞丹參葉片無性系快速繁殖及植株再生研，J 華

29、中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1999, 33(1): 108-111【4】馮玲玲，周詩毅，楊春艷等黑暗和光照對丹參培養(yǎng)細胞生長和生理生化特性的影響，J.生物學(xué)雜志，2005，22(2): 24 - 26【5】張愛民，常莉，薛建平藥用植物多倍體誘導(dǎo)研究進展，J.中國中藥雜志，2005，30(9): 645-649【6】陶璐璐，袁靜明丹參愈傷組織細胞固定化及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的特征，J.生物工程學(xué)報，1990, 6(3) : 218223【7】Chin-Tung W U, Vanisree MULABAGAL , Satish Manoha NALAWADE, et al.Isolation and quantitative analysis of cryptotans- inone, an active quinoid diterpene formed in callus of Salvia miltiorrhiza Bunge,J. Bio1 . Pharm. Bull, 2003, 26(6): 845-848【8】宋經(jīng)元，張蔭麟，祁建軍，等丹參冠癭組織丹參高產(chǎn)株系選擇和丹參酮的產(chǎn)生，J.生物工程學(xué)報，1997 , 13 (3