生物化學(xué)2蛋白質(zhì)

1、蛋白質(zhì)大綱要求蛋白質(zhì)的重要功能及其元素組成氨基酸 氨基酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及分類必須氨基酸 蛋白質(zhì)的稀有氨基酸氨基酸的性質(zhì) 肽 肽鍵以及肽鏈肽的命名及結(jié)構(gòu)天然存在的活性寡肽蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)和等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的分類 蛋白質(zhì)的分離提純及分子量測量1 .概念簡單蛋白、結(jié)合蛋白、基本氨基酸、等電點(diǎn)、甲醛滴定法、Edman降解、一級結(jié)構(gòu)、肽鍵、構(gòu)

2、型與構(gòu)象、二面角、二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)、亞基、別構(gòu)蛋白、分子病、水化層、雙電層、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性、鹽析與鹽溶2 .氨基酸分類、基本氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類、名稱、符號、化學(xué)反應(yīng)、鑒定、蛋白質(zhì)的水解3 .蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、測定步驟、常用方法、酶二級結(jié)構(gòu) 四種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、數(shù)據(jù)、超二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)主要靠疏水鍵維持四級結(jié)構(gòu)變構(gòu)現(xiàn)象結(jié)構(gòu)與功能的適應(yīng)、結(jié)構(gòu)變化對功能的影響、典型蛋白質(zhì)4 .蛋白質(zhì)的性質(zhì)分子量的測定方法、酸堿性、溶解性、變性、顏色反應(yīng)第一節(jié)蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)的功能（催化、調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)、貯存、運(yùn)動、結(jié)構(gòu)成分、支架作用、防御和進(jìn)攻、 異常功能）氨基酸的序列異構(gòu)

3、是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和物種特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)蛋白質(zhì)和核酸是原生質(zhì)的主要成分，任何生物都含有蛋白質(zhì)。自然界中最小、最簡單的生物是病毒，它是由蛋白質(zhì)和核酸組成的。沒有蛋白質(zhì)也就沒有生命。自然界的生物多種多樣，因而蛋白質(zhì)的種類和功能也十分繁多。概括起來，蛋白質(zhì)主要有以下功能：1 .催化功能 生物體內(nèi)的酶都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，它們有機(jī)體新陳代謝的催化劑。沒有酶， 生物體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)就無法正常進(jìn)行。例如，沒有淀粉酶，淀粉就不能被分解利用。2 .結(jié)構(gòu)功能蛋白質(zhì)可以作為生物體的結(jié)構(gòu)成分。在高等動物里，膠原是主要的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)蛋白，參與結(jié)締組織和骨骼作為身體的支架，占蛋白總量的 1/4。細(xì)胞里的片層結(jié)構(gòu)，如細(xì)

4、 胞膜、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等都是由不溶性蛋白與脂類組成的。動物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構(gòu)成的。3 .運(yùn)輸功能脊椎動物紅細(xì)胞中的血紅蛋白和無脊椎動物體內(nèi)的血藍(lán)蛋白在呼吸過程中起著運(yùn)輸氧氣的作用。血液中的載脂蛋白可運(yùn)輸脂肪，轉(zhuǎn)鐵蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。 一些脂溶性激素的運(yùn)輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結(jié)合球蛋白結(jié)合才能在血液中運(yùn)輸。4 .貯存功能某些蛋白質(zhì)的作用是貯存氨基酸作為生物體的養(yǎng)料和胚胎或幼兒生長發(fā)育的原料。此類蛋白質(zhì)包括蛋類中的卵清蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝 臟中的鐵蛋白可將血液中多余的鐵儲存起來，供缺鐵時使用。5 .運(yùn)動功能肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白是運(yùn)動系統(tǒng)的

5、必要成分，它們構(gòu)象的改變引起肌 肉的收縮，帶動機(jī)體運(yùn)動。細(xì)菌中的鞭毛蛋白有類似的作用，它的收縮引起鞭毛的擺動，從而使細(xì)菌在水中游動。6 .防御功能高等動物的免疫反應(yīng)是機(jī)體的一種防御機(jī)能，它主要也是通過蛋白質(zhì)（抗體） 來實(shí)現(xiàn)的。凝血與纖溶系統(tǒng)的蛋白因子、溶菌酶、干擾素等，也擔(dān)負(fù)著防御和保護(hù)功能。7 .調(diào)節(jié)功能某些激素、一切激素受體和許多其他調(diào)節(jié)因子都是蛋白質(zhì)。8 .信息傳遞功能 生物體內(nèi)的信息傳遞過程也離不開蛋白質(zhì)。例如，視覺信息的傳遞要有視 紫紅質(zhì)參與，感受味道需要味覺蛋白。視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)，只需1個光子即可被激發(fā)，產(chǎn)生視覺。9 .遺傳調(diào)控功能遺傳信息的儲存和表達(dá)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。DNA在儲

6、存時是纏繞在蛋白質(zhì)（組蛋白）上的。有些蛋白質(zhì)，如阻遏蛋白，與特定基因的表達(dá)有關(guān)。3半乳糖甘酶基因的表 達(dá)受到一種阻遏蛋白的抑制，當(dāng)需要合成3 半乳糖昔酶時經(jīng)過去阻遏作用才能表達(dá)。10 .其他功能 某些生物能合成有毒的蛋白質(zhì)，用以攻擊或自衛(wèi)。如某些植物在被昆蟲咬過以后會產(chǎn)生一種毒蛋白。白喉毒素可抑制生物蛋白質(zhì)合成。二、蛋白質(zhì)的分類（一）按分子形狀以及溶解度分類1 .球狀蛋白 外形近似球體，多溶于水，大都具有活性，如酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、蛋白激素、抗體 等。球狀蛋白的長度與直徑之比一般小于10。2 .纖維狀蛋白 外形細(xì)長，分子量大，大都是結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等。 纖維蛋白按溶解性可分為可

7、溶性纖維蛋白與不溶性纖維蛋白。前者如血液中的纖維蛋白原、 肌肉中的肌球蛋白等，后者如膠原蛋白，彈性蛋白，角蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白。3 .膜蛋白：與細(xì)胞的各種系統(tǒng)結(jié)合而存在，疏水氨基酸側(cè)鏈伸向外部。因此不溶于水但能溶于去污溶劑。（二）按分子組成分類1 .簡單蛋白 完全由氨基酸組成，不含非蛋白成分。如血清清蛋白等。根據(jù)溶解性的不同，可將簡單蛋白分為以下 7類：清蛋白、球蛋白、組蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋 白。2 .結(jié)合蛋白（綴合蛋白質(zhì)）由蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成，后者稱為輔基或配體。才如果非蛋白成分是通過共價鍵于蛋白質(zhì)，必須通過水解才能釋放它。如果不是，變性就可以。 根據(jù)輔基的不同，可將結(jié)合蛋白分

8、為以下 7類：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白、 黃素蛋白和金屬蛋白。有些蛋白質(zhì)僅由一條多肽鏈組成，如溶菌酶和肌紅蛋白， 這些蛋白成為單體蛋白質(zhì)。有些是兩條或多條組成的， 如血紅蛋白和己糖激酶，叫做寡聚或多聚蛋白質(zhì)， 其中每條多肽鏈叫做或亞單位。亞基之間通過非共價鍵連接。三、蛋白質(zhì)的元素組成與分子量1 .元素組成 所有的蛋白質(zhì)都含有碳?xì)溲醯姆N元素，有些蛋白質(zhì)還含有硫、磷和一些金屬 元素。蛋白質(zhì)平均含碳50%,氫7%,氧23%,氮16%。其中氮的含量較為恒定，而且在糖和脂 類中不含氮，所以常通過測量樣品中氮的含量來測定蛋白質(zhì)含量。如常用的凱氏定氮：蛋白質(zhì)含量=蛋白氮X 6.25其中6

9、.25是16%的倒數(shù)。2 .蛋白質(zhì)的分子量 蛋白質(zhì)的分子量變化范圍很大，從6000到100萬或更大。這個范圍是人為規(guī)定的。一般將分子量小于6000的稱為肽。不過這個界限不是絕對的，如牛胰島素分子量為5700, 一般仍認(rèn)為是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)煮沸凝固，而肽不凝固。較大的蛋白質(zhì)如煙草花葉病毒，分子量達(dá) 4000萬。四、蛋白質(zhì)的水解氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，這個發(fā)現(xiàn)是從蛋白質(zhì)的水解得到的。蛋白質(zhì)的水解主要有三種方法：1 .酸水解 用6MHC1或4MH2SO4 105c回流20小時即可完全水解。酸水解不引起氨基酸的 消旋，但色氨酸完全被破壞，絲氨酸和蘇氨酸部分破壞，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解。如

10、樣品含有雜質(zhì)，在酸水解過程中常產(chǎn)生腐黑質(zhì)，使水解液變黑。用 3mol/L對甲苯磺 酸代替鹽酸，得到色氨酸較多，可像絲氨酸和蘇氨酸一樣用外推法求其含量。2 .堿水解 用5MNaOH水解1020小時可水解完全。堿水解使氨基酸消旋，許多氨基酸被 破壞，產(chǎn)生DL氨基酸的混合物，稱消旋物。但色氨酸不被破壞。常用于測定色氨酸含量。 可加入淀粉以防止氧化。3 .酶水解酶水解既不破壞氨基酸，也不引起消旋。但酶水解時間長，反應(yīng)不完全。一般用 于部分水解，若要完全水解，需要用多種酶協(xié)同作用。主要用于蛋白質(zhì)分析以獲得蛋白質(zhì)的部分水解產(chǎn)物。第二節(jié)氨基酸一、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類（一）基本氨基酸組成蛋白質(zhì)的 20種氨基酸稱

11、為基本氨基酸。它們中除脯氨酸（亞氨基酸）外都是a - 氨基酸，即在a -碳原子上有一個氨基?；景被岫挤贤ㄊ剑加袉巫帜负腿帜缚s寫 符號。氨基酸在中性 PH時，竣基以 COOH形式存在，氨基以 NH3形式存在，這樣的氨基酸有一個正電荷有一個負(fù)電荷，稱為兼性離子蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸都是L型的，并且阿爾法氨基酸都是白體晶體，熔點(diǎn)很高。每種氨基酸都有自己特殊的結(jié)晶形狀，利用結(jié)晶性狀可以鑒別各種氨基酸。除了胱氨酸和酪氨酸之外，都能溶于水。脯氨酸和羥脯氨酸還能榮譽(yù)乙醇與乙醛。按照氨基酸的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，可分為三類：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和雜環(huán)氨基酸。1 .脂肪族氨基酸 共15種。側(cè)鏈只是燒鏈（中性氨

12、基酸）：Gly （甘氨酸），Ala （丙氨酸），Val （繳氨酸），Leu （亮 氨酸），Ile （異亮氨酸）后三種帶有支鏈，人體不能合成，是必需氨基酸。側(cè)鏈含有羥基：Ser （絲氨酸），Thr （蘇氨酸）許多蛋白酶的活性中心含有絲氨酸，它還在 蛋白質(zhì)與糖類及磷酸的結(jié)合中起重要作用。側(cè)鏈含硫原子：Cys （半胱氨酸），Met （甲硫氨酸）兩個半胱氨酸可通過形成二硫鍵結(jié)合成 一個胱氨酸。二硫鍵對維持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)有重要意義。半胱氨酸也經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的活性中心里。甲硫氨酸的硫原子有時參與形成配位鍵。甲硫氨酸可作為通用甲基供體，參與多種分子的甲基化反應(yīng)。側(cè)鏈含有竣基：Asp （天冬氨酸），Glu

13、 （谷氨酸）側(cè)鏈含酰胺基：Asn （天冬酰胺），Gln （谷氨酰胺）側(cè)鏈顯堿性：Arg （精氨酸）,Lys （賴氨酸）2 .芳香族氨基酸 包括苯丙氨酸（Phe,F）和酪氨酸（Tyr,Y）兩種。酪氨酸是合成甲狀腺素的 原料。3 .雜環(huán)氨基酸 包括色氨酸（Trp,W）、組氨酸（His）和脯氨酸（Pro）三種。其中的色氨酸與芳香 族氨基酸都含苯環(huán)，都有紫外吸收（280nm）。所以可通過測量蛋白質(zhì)的紫外吸收來測定蛋白質(zhì)的含量。組氨酸也是堿性氨基酸，但堿性較弱，在生理條件下是否帶電與周圍內(nèi)環(huán)境有關(guān)。它在活性中心常起傳遞電荷的作用。組氨酸能與鐵等金屬離子配位。脯氨酸是唯一的仲氨基酸，是a -螺旋的破壞者。

14、B是指 Asx,即Asp或Asn； Z是指 Glx,即Glu或Gln?；景被嵋部砂磦?cè)鏈極性分類：非極性氨基酸： Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八種極性不帶電荷： Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr共七種帶正電荷：Arg, Lys, His帶負(fù)電荷：Asp, Glu（二）不常見的蛋白質(zhì)氨基酸某些蛋白質(zhì)中含有一些不常見的氨基酸，它們是基本氨基酸在蛋白質(zhì)合成以后經(jīng)羥化、竣化、甲基化等修飾衍生而來的。也叫稀有氨基酸或特殊氨基酸。如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、鎖鏈素等。其中羥脯氨酸和羥賴氨酸在膠原和彈性蛋白中含量較多。在

15、甲狀腺素中還有3,5-二碘酪氨酸。（三）非蛋白質(zhì)氨基酸自然界中還有150多種不參與構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸。它們大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是D-氨基酸或3、 丫、8-氨基酸。這些氨基酸中有些是重要的代謝物前體或中間產(chǎn)物， 如瓜氨酸和鳥氨酸是合成精氨酸的中間產(chǎn)物，3-丙氨酸是遍多酸（泛酸，輔酶A前體）的前體，丫 -氨基丁酸是傳遞神經(jīng)沖動的化學(xué)介質(zhì)。二、氨基酸的性質(zhì)（一）物理性質(zhì)a -氨基酸都是白色晶體，每種氨基酸都有特殊的結(jié)晶形狀，可以用來鑒別各種氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羥脯氨酸還能溶于乙醇或乙醛中。氨基酸可以使水的介電常數(shù)增高，而有機(jī)溶劑則降低。氨基酸在水中主要是以

16、兼性離子或偶極離子的形式存在。除甘氨酸外，a -氨基酸都有旋光性，a -碳原子具有手性。蘇氨酸和異亮氨酸有兩個手 性碳原子。從蛋白質(zhì)水解得到的氨基酸都是L-型。但在生物體內(nèi)特別是細(xì)菌中，D-氨基酸也存在，如細(xì)菌的細(xì)胞壁和某些抗菌素中都含有D-氨基酸。三個帶苯環(huán)的氨基酸有紫外吸收，F(xiàn):257nm, £ =200; Y:275nm, £ =1400; W:280nm, £=5600。通常蛋白質(zhì)的紫外吸收主要是后兩個氨基酸決定的，一般在280nmo氨基酸分子中既含有氨基又含有竣基，在水溶液中以偶極離子的形式存在。所以氨基酸晶體是離子晶體，熔點(diǎn)在 200 c以上。氨基酸是

17、兩性電解質(zhì)，各個解離基的表觀解離常數(shù)按其酸 性強(qiáng)度遞降的順序，分別以 K1'、K2'來表示。當(dāng)氨基酸分子所帶的凈電荷為零時的pH稱為氨基酸的等電點(diǎn)（pI）。等電點(diǎn)的值是它在等電點(diǎn)前后的兩個pK'值的算術(shù)平均值。氨基酸完全質(zhì)子化時可看作多元弱酸，各解離基團(tuán)的表觀解離常數(shù)按酸性減弱的順序，以pK1' 、pK2' 、pK3'表示。氨基酸可作為緩沖溶液，在pK'處的緩沖能力最強(qiáng)，pI處的緩沖能力最弱。氨基酸的甲醛滴定，由于甲醛與氨基酸中的-NH2羥甲基衍生物，降低了氨基的堿性，增強(qiáng)了 nh3的解離，滴定終點(diǎn)由 PH=12左右移至PH9左右。（二）

18、氨基酸的化學(xué)反應(yīng)1. -氨基參加的反應(yīng) （1）?；被膳c?；噭珲Ｂ然蛩狒趬A性溶液中反應(yīng)，生成酰胺。該反應(yīng)在多肽合成中可用于保護(hù)氨基。（ 2）與亞硝酸作用氨基酸在室溫下與亞硝酸反應(yīng)，脫氨，生成羥基羧酸和氮?dú)?。因為伯胺都有這個反應(yīng)，所以賴氨酸的側(cè)鏈氨基也能反應(yīng)，但速度較慢。常用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾、水解程度測定及氨基酸的定量。（ 3）與醛反應(yīng)氨基酸的a -氨基能與醛類物質(zhì)反應(yīng)，生成西佛堿-C=N-。西佛堿是氨基酸作為底物的某些酶促反應(yīng)的中間物。賴氨酸的側(cè)鏈氨基也能反應(yīng)。氨基還可以與甲醛反應(yīng)，生成羥甲基化合物。由于氨基酸在溶液中以偶極離子形式存在，所以不能用酸堿滴定測定含量。與甲醛反應(yīng)后，氨

19、基酸不再是偶極離子，其滴定終點(diǎn)可用一般的酸堿指示劑指示，因而可以滴定，這叫甲醛滴定法，可用于測定氨基酸。（ 4）與異硫氰酸苯酯（PITC） 反應(yīng)a-氨基與PITC在弱堿性條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-AA）,后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（ PTH-AA） 。 這些衍生物是無色的，可用層析法加以分離鑒定。這個反應(yīng)首先為Edman用來鑒定蛋白質(zhì)的 N-末端氨基酸，在蛋白質(zhì)的氨基酸順序分析方面占有重要地位。（ 5）磺?；被崤c5-（二甲胺基）蔡-1-磺酰氯（DNS-Cl）反應(yīng)，生成 DNS氨基酸。產(chǎn)物在酸性條件下 （6NHCl）100 C也不破壞，因

20、此可用于氨基酸末端分析。DNS-M基酸有強(qiáng)熒光，激發(fā)波長在360nm左右，比較靈敏，可用于微量分析。（6）與DNF皈應(yīng)（Sange r反應(yīng)）氨基酸與2,4-二硝基氟苯（DNFB）在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基氨基酸（DNPM基酸）。這一反應(yīng)是定量轉(zhuǎn)變的，產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性100高溫。該反應(yīng)曾被英國的Sanger 用來測定胰島素的氨基酸順序，也叫桑格爾試劑，現(xiàn)在應(yīng)用于蛋白質(zhì)N-末端測定。（ 7）轉(zhuǎn)氨反應(yīng)在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸可脫去氨基，變成相應(yīng)的酮酸。2. 羧基的反應(yīng)羧基可與堿 作用生成鹽，其中重金屬鹽不溶于水。羧基可與醇生成酯，此反應(yīng)常用于多肽合成中的羧基保護(hù)。某些酯有活化作用，可增加羧

21、基活性，如對硝基苯酯。將氨基保護(hù)以后，可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，在多肽合成中用于活化羧基。在氨基酸脫羧酶的催化下，可脫去羧基，放出二氧化碳，形成伯胺。疊氮反應(yīng)，氨基酸的氨基通過酰加以保護(hù)，羧基經(jīng)酯化轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞ィ缓箅潞蛠喯跛岱磻?yīng)即變成疊氮化合物，此反應(yīng)使氨基酸的羧基活化，常用于肽的人工合成。3. 氨基與羧基共同參加的反應(yīng)茚三酮反應(yīng)：氨基酸與茚三酮在微酸性溶液中加熱，引起氨基酸氧化脫羧脫氨，最后茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原茚三酮發(fā)生作用， 成紫色物質(zhì)。用紙層析或柱層析把各種氨基酸分開后，利用苛三酮顯色反應(yīng)可以定性堅定并用分光光度發(fā)在5 7 0納米定量測定各種氨基酸。根據(jù)這個反應(yīng)可通過二氧化

22、碳測定氨基酸含量。兩個亞氨基酸，脯氨酸與羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)并不生成氨氣，而是直接生成黃亮色化合物成肽反應(yīng)4. 側(cè)鏈的反應(yīng)酪氨酸的酚基在3 位和 5 位上容易發(fā)生親電取代反應(yīng)，例如碘化或硝化，可以與重氮化合物結(jié)合生成橘黃色化合物，即Pauly 反應(yīng)，可用于檢測酪氨酸。組氨酸也可以發(fā)生此反應(yīng)，只不過顏色稍有差異，呈棕紅色。絲氨酸、蘇氨酸含羥基，能形成酯或苷。半胱氨酸側(cè)鏈巰基反應(yīng)性高：（ 1 ）二硫鍵（disulfide bond）半胱氨酸在堿性溶液中容易被氧化形成二硫鍵，生成胱氨酸。胱氨酸中的二硫鍵在形成蛋白質(zhì)的構(gòu)象上起很大的作用。氧化劑和還原劑都可以打開二硫鍵。在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時，氧化劑過甲酸

23、可以定量地拆開二硫鍵，生成相應(yīng)的磺酸。還原劑如巰基乙醇、巰基乙酸也能拆開二硫鍵，生成相應(yīng)的巰基化合物。由于半胱氨酸中的巰基很不穩(wěn)定，極易氧化，因此利用還原劑拆開二硫鍵時，往往進(jìn)一步用碘乙酰胺、氯化芳、N-乙基丁烯二亞酰胺和對氯汞苯甲酸等試劑與巰基作用，把它保護(hù)起來，防止它重新氧化。（ 2）烷化半胱氨酸可與烷基試劑，如碘乙酸、碘乙酰胺等發(fā)生烷化反應(yīng)。半胱氨酸與Y丙咤反應(yīng)，生成帶正電的側(cè)鏈，稱為S-氨乙基半月氨酸（AECys）。（ 3）與重金屬反應(yīng)微量的某些重金屬離子，如Ag+、Hg2+,就能與疏基反應(yīng)，生成硫醇鹽，導(dǎo)致含疏基的酶失活。5. 以下反應(yīng)常用于氨基酸的檢驗：l 酪氨酸、組氨酸能與重氮化

24、合物反應(yīng)（Pauly 反應(yīng)） ，可用于定性、定量測定。組氨酸生成棕紅色的化合物，酪氨酸為桔黃色。l 精氨酸在氫氧化鈉中與1- 萘酚和次溴酸鈉反應(yīng)，生成深紅色，稱為坂口反應(yīng)。用于胍基的鑒定。l 酪氨酸與硝酸、亞硝酸、硝酸汞和亞硝酸汞反應(yīng)，生成白色沉淀，加熱后變紅，稱為米倫（ Millon ）反應(yīng)，是鑒定酚基的特性反應(yīng)。l 色氨酸中加入乙醛酸后再緩慢加入濃硫酸，在界面會出現(xiàn)紫色環(huán)，用于鑒定吲哚基。（ Ehrlish 反應(yīng)）在蛋白質(zhì)中，有些側(cè)鏈基團(tuán)被包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部，因而反應(yīng)很慢甚至不反應(yīng)。三、氨基酸的光學(xué)活性與光譜分析從蛋白質(zhì)的酸水解液或酶促水解液中分離獲得的氨基酸都屬于L 型旋光物質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)中

25、，只要不對稱原子經(jīng)過對稱狀態(tài)的中間階段，便將發(fā)生消旋作用，并轉(zhuǎn)變?yōu)樾秃蚅 型 的等摩爾，稱外消旋物。內(nèi)消旋物：胱氨酸是一種特殊情況，因為兩個不對稱中心是相同的。其有L- 胱氨酸、D-胱氨酸、以及內(nèi)消旋三種立體異構(gòu)體。氨基酸的旋光符號和大小它的基性質(zhì)，并且與測定溶液PH有關(guān)，這是因為在不同的PH條件下氨基與羧基的解離狀態(tài)不同。紫外光譜：參與蛋白質(zhì)組成的20 多種氨基酸在電磁波譜的可見光區(qū)都沒有光吸收，在紅外區(qū)和遠(yuǎn)紫外區(qū)都有光吸收。核磁共振波譜（NMR）四、氨基酸混合物的分離分析氨基酸分析分離方法主要是基于氨基酸的酸堿性質(zhì)和極性大小。常用的方法主要有離子交換柱層析、高效液相層析（ HPLC等。1

26、. 色譜（ chromatography ）的發(fā)展史最早的層析實(shí)驗是俄國植物學(xué)家U b e t在1903年用碳酸鈣分離葉綠素，屬于吸附層析。40 年代出現(xiàn)了分配層析，50 年代出現(xiàn)了氣相色譜，60 年代出現(xiàn)HPLC， 80 年代出現(xiàn)了超臨界層析，90年代出現(xiàn)的超微量 HPLC可分離ng級的樣品。2 .色譜的分類：按流動相可分為氣相、液相、超臨界色譜等；按介質(zhì)可分為紙層析、薄層層析、柱層析等；按分離機(jī)制可分為吸附層析、分配層析、分子篩層析等3 .色譜的應(yīng)用可用于分離、制備、純度鑒定等。定性可通過保留值、內(nèi)標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法，定量一般用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。氨基酸的分析分離是測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。在分配層析

27、和離子交換層析法開始應(yīng)用于氨基酸成分分析之后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究才取得了顯著的成就。現(xiàn)在這些方法已自動化。氨基酸從強(qiáng)酸型離子交換柱的洗脫順序如下：Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,（NH3）,Arg 第三節(jié)蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是生物大分子， 具有明顯的結(jié)構(gòu)層次性，由低層到高層可分為一級結(jié)構(gòu)（多肽鏈的氨基酸）、二級結(jié)構(gòu)（是值多肽鏈借助氫鍵排列成自己特有的螺旋、折疊，多肽鏈在三維 排列中的一個高級組織層次）、三級結(jié)構(gòu)（多肽鏈在三維排列中的另一高級組織層次）和四 級結(jié)構(gòu)（寡聚的蛋白質(zhì)中各亞基在空間上的相互關(guān)

28、系和結(jié)合方式）。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)由多肽鏈主鏈上連接的氨基酸殘疾所決定的。二級結(jié)構(gòu)和其他高級結(jié)構(gòu)主要是由非共價力如氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水作用決定的。必須強(qiáng)調(diào)的是，一個蛋 白質(zhì)分子為獲得結(jié)構(gòu)所需的全部信息都含于一級結(jié)構(gòu)即多肽鏈的氨基酸序列中。構(gòu)型：是指在具有相同結(jié)構(gòu)式的立體異構(gòu)體中取代基團(tuán)空間的取向，不同的構(gòu)型如果沒有共價鍵的破裂是不能互變的。構(gòu)象：值具有相同結(jié)構(gòu)式和相同構(gòu)型的分子在空間里的可能的多種形態(tài)，構(gòu)象形態(tài)的改變不涉及共價鍵的破裂。 一、肽鍵和肽一個氨基酸的竣基與另一個氨基酸的氨基縮水形成的共價鍵，稱為肽鍵。在蛋白質(zhì)分子中，氨基酸借肽鍵連接起來，形成肽鏈。蛋白質(zhì)和多肽分子中連接氨基酸

29、殘基共價鍵肽鍵之 外，還有一個比較常見的是兩個半胱氨酸殘基側(cè)鏈之間形成的二硫鍵。它可以使單獨(dú)的肽鏈共價交聯(lián)起來，或使一條鏈的某一部分成環(huán)。最簡單的肽由兩個氨基酸組成，稱為二肽。含有三、四、五個氨基酸的肽分別稱為三肽、四肽、五肽等。肽鏈中的氨基酸由于形成肽鍵時脫水，已不是完整的氨基酸，所以稱為殘基。肽的命名是根據(jù)組成肽的氨基酸殘基來確定的。一般從肽的氨基端開始，稱為某氨基酰某氨基酰某氨基酸。肽的書寫也是從氨基端開始。肽鍵象酰胺鍵一樣，由于鍵內(nèi)原子處于共振狀態(tài)而表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。在肽鍵中C N單鍵具有約40%雙鍵性質(zhì)，而 C=O雙鍵具有40%單鍵性質(zhì)。這樣就產(chǎn)生兩個重要結(jié)果：（1）肽鍵的亞氨基在

30、 pH 0-14的范圍內(nèi)沒有明顯的解離和質(zhì)子化的傾向；（2）肽鍵中的C- N單鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，具有平面性，使蛋白質(zhì)能折疊成各種三維構(gòu)象。（3）肽鏈中的肽鍵一般是反式構(gòu)型，而 Pro的肽鍵可能出現(xiàn)順兩種結(jié)構(gòu)。（順式構(gòu)型會引起 R之間的空間位阻，Pro是因為四氫口比咯環(huán)引起的空間位阻消除了反式構(gòu)型的優(yōu)勢。除了蛋白質(zhì)部分水解可以產(chǎn)生各種簡單的多肽以外，自然界中還有長短不等的小肽，它們具有特殊的生理功能。動植物細(xì)胞中含有一種三肽，稱為谷胱甘肽，即8-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。因其含有前基，故常以GSHB表示。它在體內(nèi)的氧化還原過程中起重要作用。腦啡肽是天然止痛劑。 肌肉中的鵝肌肽是一個二肽，即3-丙氨酰組

31、氨酸。肌肽可作為肌肉中的緩沖劑，緩沖肌肉產(chǎn)生的乳酸對pH的影響。一種抗菌素叫做短桿菌酪肽，由 12種氨基酸組成，其中有幾種是 D-氨 基酸。這些天然肽中的非蛋白質(zhì)氨基酸可以使其免遭蛋白酶水解。許多激素也是多肽，如催產(chǎn)素、加壓素、舒緩激肽等。二、肽的理化性質(zhì)短肽的理化性質(zhì)與氨基酸類似。 許多小肽已經(jīng)結(jié)晶。晶體的熔點(diǎn)很高，說明是離子晶體， 在水溶液中以偶極離子存在。肽鍵的亞氨基不解離，所以肽的酸堿性取決于肽的末端氨基、竣基和側(cè)鏈上的基團(tuán)。 在長肽或蛋白質(zhì)中， 可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈上的。肽中末端竣基的pK'比自由氨基酸的稍大，而末端氨基的pK'則稍小。側(cè)鏈基團(tuán)變化不大。肽的滴定曲線

32、和氨基酸的很相似。肽的等電點(diǎn)也可以根據(jù)它的pK'值確定。一般小肽的旋光度等于各個氨基酸旋光度的總和，但較大的肽或蛋白質(zhì)的旋光度不等于其組成氨基酸的旋光度的簡單加和。肽的化學(xué)性質(zhì)和氨基酸一樣，但有一些特殊的反應(yīng)，如雙縮月尿反應(yīng)（是肽和蛋白質(zhì)所特 有的）。一般含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都能與CuSO硼性溶液發(fā)生雙縮月尿反應(yīng)而生成紫紅色或藍(lán)紫色的復(fù)合物。利用這個反應(yīng)借助可見光度計，可以測定蛋白質(zhì)的含量。三、天然存在的活性肽除了蛋白質(zhì)部分水解可以產(chǎn)生長短不一的各種肽段之外，生物體內(nèi)還有很多活性肽游離，它們具有各種特殊的生理功能，很多激素是屬于肽類物質(zhì)。有些抗生素也屬于肽類或肽的。小的活性肽

33、中一類稱腦啡肽的物質(zhì)。-鵝膏蕈堿（肽類化合物）四、一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指肽鏈的氨基酸組成及其排列順序。氨基酸序列是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，它決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。 現(xiàn)在大多數(shù)的氨基酸序列是根據(jù)編碼蛋白質(zhì)的核甘酸序 列推導(dǎo)出來的一級結(jié)構(gòu)可用氨基酸的三字母符號或單字母符號表示，從N-末端向C-末端書寫。采用三字母符號時，氨基酸之間用連字符（-）隔開。測定步驟測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，要求樣品必須是均一的（純度大于97%）而且是已知分子量的蛋白質(zhì)。一般的測定步驟是：1 .通過末端分析確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目：根據(jù)蛋白質(zhì) N-末端或C-末端殘基的摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量可以確定蛋白質(zhì)分子

34、中多肽鏈數(shù)目2 .拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈，并分離純化：如果是寡聚蛋白質(zhì)，多肽鏈之間是借助非共價相互作用締合的，則可用變性劑如8mol/L尿素，6mol/L的鹽酸月瓜或高濃度鹽酸處理，就能夠使寡聚蛋白質(zhì)的亞基分開。如果多肽鏈之間是通過共價二硫橋交聯(lián)的，則可用氧化劑或還原劑將二硫鍵斷裂。3 .斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵4 .分析每一多肽鏈的氨基酸組成：肽鏈的一部分樣品進(jìn)行完全水解，測定其氨基酸組成和比例。5 .肽鏈的另一部分樣品進(jìn)行N末端和C末端殘基的鑒定。6 .裂解多肽鏈成較小的片段：用兩種或幾種不同的斷裂方法（指斷裂點(diǎn)不一樣）將每條多肽 鏈樣品降解成兩套或幾套重疊的肽段或稱肽碎片。每套肽段進(jìn)行分離純

35、化， 并對每一純化了的肽段進(jìn)行氨基酸組成和末端殘基的分析7 .測定每個肽段的氨基酸順序 ：目前最常用的肽段測序方法是 Edman降解法，并有自動序列 分析儀可供利用。此外尚有酶解法和質(zhì)譜法。8 . 重建完整多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)：利用兩套或多套肽段的氨基酸序列彼此間有交錯重疊可以拼湊出原來的完整多肽鏈的氨基酸序列。9 . 測定原來的多肽鏈中二硫鍵和酰胺基的位置。末端分析方法N 末端1 .二硝基氟苯（DNF豉FDNB法：蛋白質(zhì)的末端氨基與 2,4-二硝基氟苯（DNFB）在弱堿性溶 液中作用生成二硝基苯基蛋白質(zhì)（DNP毒白質(zhì)）。產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性100c高溫。水解時，肽鏈斷開，但 DNP基并不月落。D

36、NP-M基酸能溶于有機(jī)溶劑（如乙醍）中，這樣可與其 他氨基酸和e -DNP賴氨酸分開。再經(jīng)雙向濾紙層析或柱層析，可以鑒定黃色的 DNPM基酸。2 .丹磺酰氯（DNS法：是更靈敏的方法。蛋白質(zhì)的末端氨基與5-（二甲胺基）蔡-1-磺酰氯（DNS-Cl）反應(yīng)，生成 DNS蛋白質(zhì)。DNS氨基酸有強(qiáng)熒光，激發(fā)波長在360nm左右，比DNFB法靈敏 100 倍。3 .苯異硫氟酸苯酯（PITC）法：目前應(yīng)用最廣泛的是異硫鼠酸苯酯（PITC）法。末端氨基與PITC 在弱堿性條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物而從肽鏈上掉下來。產(chǎn)物可用氣- 液色譜法

37、進(jìn)行鑒定。這個方法最大的優(yōu)點(diǎn)是剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重復(fù)測定新生的N 末端氨基酸?，F(xiàn)在已經(jīng)有全自動的氨基酸順序分析儀，可測定含20 個以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。缺點(diǎn)是不如丹磺酰氯靈敏，可與之結(jié)合使用。4 .氮肽酶法：N末端氨基酸也可用酶學(xué)方法即氨肽酶法測定。氮肽酶是一類外切酶或叫外肽酶，它們能從多肽鏈的N逐個向里切。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出水酶解所釋放的氨基酸的種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和殘基釋放量作動力學(xué)曲線，就能知道N-末端殘基序列。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶。C末端1 .還原法：C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的a氨基醇。肽鏈水解后，再用層析 法鑒定。有斷裂干擾。2 .腫解

38、法：是目前測定 C末端最重要的方法。多肽與腫在無水條件下加熱，可以斷裂所有 的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰腫化合物。腫解下來的C末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。3 .竣肽酶法：最有效、最常用。將蛋白質(zhì)在pH 8.0, 30 C與竣肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序?？㈦拿窤水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，竣肽酶 B水解精氨酸和賴氨酸。二硫鍵的拆開和肽鏈的分離一般情況下，蛋白質(zhì)分子中肽鏈的數(shù)目應(yīng)等于N 末端氨基酸殘基的數(shù)目，可根

39、據(jù)末端分析來確定一種蛋白質(zhì)由幾條肽鏈構(gòu)成。必須設(shè)法把這些肽鏈分離開來，然后測定每條肽鏈的氨基酸順序。如果這些肽鏈之間不是共價交聯(lián)的，可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理蛋白質(zhì)，把肽鏈分開。如果肽鏈之間以二硫鍵交聯(lián)，或肽鏈中含有鏈內(nèi)二硫鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開。主要是過氧化法和 疏基化物還原法， 最普遍的方法是 用過量的疏基乙醇 處理，是S-S 定量還原成-SH , 然后用碘乙酸保護(hù)生成的半胱氨酸的疏基，防止重新氧化。二硫鍵拆開后形成的個別肽鏈，可用紙層析、離子交換柱層析、電泳等方法進(jìn)行分離。肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定。在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組成和比

40、例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，2 4 小時即可完成。蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每摩爾蛋白質(zhì)中所含的氨基酸殘基的摩爾數(shù)表示，或用每1 0 0 g中氨基酸的克數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相差很大。肽鏈的部分水解和肽段的分離當(dāng)肽鏈的氨基酸組成及 N末端和C末端已知后，隨后的步驟是肽鏈的部分水解。 這是測序工作的關(guān)鍵步驟。這一步通常用專一性很強(qiáng)的蛋白酶來完成。酶裂解法： 最常用的是胰蛋白酶（ trypsin ） ， 它專門水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵，所以生成的肽段之一的C末端是賴氨酸或精氨酸。用丫丙咤處理，可增加酶切位點(diǎn)（半胱氨酸） ；

41、用馬來酸酐（順丁烯二酸酐）保護(hù)賴氨酸的側(cè)鏈氨基，或用1,2- 環(huán)己二酮修飾精氨酸的胍基，可減少酶切位點(diǎn)。經(jīng)常使用的還有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、 色氨酸等疏水殘基的羧基形成的肽鍵。其他疏水殘基反應(yīng)較慢?；瘜W(xué)裂解法： 溴化氰處理，可斷裂甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。水解后甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)镃末端高絲氨酸殘基。以上三種方法經(jīng)常使用。胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。前者水解疏水殘基之間的肽鍵，后者水解疏水殘基的氨基形成的肽鍵。胃蛋白酶與糜蛋白酶不同的是酶作用的最適PH,前者是2,后者是8-9,由于二硫鍵在酸性條件下穩(wěn)定，所以經(jīng)常用胃蛋白酶確定蛋白質(zhì)二硫橋的位置。金葡菌蛋白酶，又稱谷氨酸蛋白酶或V8 蛋白酶

42、，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽鍵， 但受緩沖液影響。在醋酸緩沖液中只水解谷氨酸，在磷酸緩沖液中還可水解天冬氨酸。梭狀芽孢桿菌蛋白酶，水解精氨酸羧基形成的肽鍵，又稱精氨酸蛋白酶。耐變性劑，可經(jīng)受6M尿素2小時?？捎糜谒獠灰兹芙獾牡鞍?。凝血酶，水解Arg-Gly 肽鍵。羥胺可水解Asn-Gly ，但 Asn-Leu 和 Asn-Ala 也能部分裂解。以上方法中，酶不能水解脯氨酸參與形成的肽鍵。多肽部分水解后，降解成長短不一的小肽段，可用層析或電泳加以分離提純。經(jīng)常用雙向?qū)游龌螂娪痉蛛x，再用茚三酮顯色，所得的圖譜稱為肽指紋譜。多肽鏈中氨基酸順序的測定多肽鏈中部分水解得到的肽段可用E dm a

43、 n化學(xué)降解法（最初用于N-末端分析，稱苯異硫氟酸酯法 PITC）或酶法（氨肽酶或竣肽酶）測序，然后比較用不同方法獲得的兩套肽段的氨基酸順序，根據(jù)它們彼此跨國切口重疊的部分（重疊肽），確定每個肽段的適當(dāng)位置，拼湊出整個多肽鏈的氨基酸順序。還有質(zhì)譜法以及根據(jù)核苷酸序列的推定法。二硫鍵位置的確定一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，從部分水解產(chǎn)物中分離出含二硫鍵的肽段，再拆開二硫鍵，將兩個肽段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位置。常用胃蛋白酶， 因其專一性低，生成的肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用（ pH2） ，此時二硫鍵穩(wěn)定。肽段的分離可用對角線電泳，將混合物點(diǎn)到濾紙的

44、中央，在pH6.5 進(jìn)行第一次電泳，然后用過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對含半胱氨磺酸的肽段。將濾紙旋轉(zhuǎn)90 度后在相同條件下進(jìn)行第二次電泳，多數(shù)肽段遷移率不變，處于對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段因負(fù)電荷增加而偏離對角線。用茚三酮顯色，分離，測序，與多肽鏈比較，即可確定二硫鍵位置。蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物學(xué)功能在不同生物體中行使或相似功能的蛋白質(zhì)稱同源蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性，這種相似性稱作同源性，通過比較同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親緣關(guān)系進(jìn)化，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，同源的氨基酸順序差異越大。據(jù)估計，氨基酸以某個恒定的速率進(jìn)化，來自任兩個物種的同

45、源蛋白質(zhì)，序列間的氨基酸差異數(shù)目與這些物種間的系統(tǒng)發(fā)生差異成比例的，也即在進(jìn)化上相差越遠(yuǎn)，氨基酸序列之間的差別越大。血液凝固與氨基酸序列的斷裂在生物體內(nèi)的某些生物化學(xué)過程中，蛋白質(zhì)分子的部分肽鏈必須按照特定的方式斷裂才能呈現(xiàn)生物學(xué)，例如血液凝固血纖蛋白原和凝血酶原的復(fù)雜變化，消化液中很多蛋白水解酶原的激活以及許多蛋白質(zhì)和多肽激素前體轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘募に囟紝儆谶@種，蛋白質(zhì)的這一特性有著它的重要生物學(xué)意義，它是在生物進(jìn)化過程發(fā)展起來的，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能具有統(tǒng)一性的表現(xiàn)血液凝固涉及凝血因子的活化，一般情況下凝血因子并不處于活化狀態(tài)，而是以活性的前體或酶原形式存在，當(dāng)機(jī)體受傷流血時，這些前體立即被，使

46、傷口的血液凝固。血液凝固是一個極其復(fù)雜的生物化學(xué)過程，它是涉及氨基酸序列斷裂的一系列被激活的。酶促激活的級聯(lián)放大使血迅速寧塊成為可能。血漿中有12種凝血因子，有七種是絲氨酸蛋白酶。血液凝固存在兩條途徑外在凝血途徑：內(nèi)在凝血途徑：以及最后的共同凝血途徑肽與蛋白質(zhì)的人工合成多肽的人工合成有兩種類型，一種是由不同氨基酸按照一定順序排列的控制合成，另一種是由一種或兩種氨基酸聚合或共聚合?？刂坪铣傻囊粋€困難是進(jìn)行接肽反應(yīng)所需的試劑，能同時和其他官能團(tuán)反應(yīng)。因此在接肽以前必須首要得到較長的肽鏈就必須每步都有較高的產(chǎn)率。如果每一步反應(yīng)產(chǎn)率都是90%，那么 30 次反應(yīng)后總產(chǎn)率只有4.24%。保護(hù)基必須在接肽

47、時起保護(hù)作用，在接肽后容易除去，又不引起肽鍵斷裂。最常用的氨基保護(hù)基 Y是芳氧甲?；?，可用催化加氫或用金屬鈉在液氨中處理除去。其他還有三苯甲基、叔丁氧甲?；龋捎孟←}酸或乙酸在室溫下除去。羧基一般以鹽或酯的加以保護(hù)。保護(hù)基Z 通常用烷基，如乙基，可在室溫下皂化除去。如用芐基，可用催化加氫除去。在正常條件下，羧基和氨基之間的肽鍵不能自發(fā)形成，因此這兩個基團(tuán)中必須有一個轉(zhuǎn)變?yōu)楦踊顫姷臓顟B(tài)；通常是把羧基活化，在這樣的羧基活化中，共同的驅(qū)動力就是碳原子的親電特性。羧基活化的方法：最早的方法是酰氯法，即把氨基保護(hù)后的氨基酸用五氯化磷處理。方法反應(yīng)條件劇烈，現(xiàn)在已經(jīng)不采用1. 疊氮法：由小肽進(jìn)一步縮合

48、成大肽時，常用疊氮法。此法不引起消旋，因此產(chǎn)物的光學(xué)純度較高2. 活化酯法：氨基被保護(hù)的氨基酸對硝基苯酯能與另一個氨基酸的氨基縮合成肽，此法作用溫和，產(chǎn)率高。3. 混合酸酐法：氨基酸被保護(hù)的氨基酸，在低溫且有叔氨的存在下與氯甲酸乙酯生成混合酸酐，能與另一氨基酸酯縮合成肽。缺點(diǎn)是容易產(chǎn)生消旋，但在無水溶劑中消旋可以保持較低水平。還常用縮合劑促進(jìn)肽鍵形成。接肽用的縮合劑最有效的是N,N -二環(huán)己基碳二亞胺（DCCI）。DCCI從兩個氨基酸分子中奪取一分子水，自身變?yōu)椴蝗艿?N,N'-二環(huán)己基月尿，從反應(yīng)液中沉淀出來，可過濾除去。接肽反應(yīng)除用縮合劑以外，還可用分別活化參加形成肽鍵的羧基和氨基

49、的方法。氨基活化一般不需特殊手段，通常在接肽時加入有機(jī)堿，如三乙胺，保證氨基在自由狀態(tài)即可。合成牛胰島素的主要途徑是先分別合成A 鏈二十一肽和B 鏈三十肽，再將A、 B 兩條鏈經(jīng)還原、氧化連接成牛胰島素。近年來固相多肽合成迅速發(fā)展。在固相合成中，肽鏈的逐步延長是在不溶的聚苯乙烯樹脂小圓珠上進(jìn)行的。合成多肽的羧基端先和氯甲基聚苯乙烯樹脂反應(yīng)，形成芐酯。第二個氨基酸的氨基用叔丁氧甲?；Ｗo(hù)后，以DCCI 為縮合劑，接在第一個氨基酸的氨基上。重復(fù)這個方法，可使肽鏈按一定順序延長。最后把樹脂懸浮在無水三氟乙酸中，通入干燥HBr，使多肽與樹脂分離，同時除去保護(hù)基。整個合成過程現(xiàn)在已經(jīng)可以在自動化固相多肽

50、合成儀上進(jìn)行。平均合成每個肽鍵只需三小時。此法可用于醫(yī)藥工業(yè)。人工合成的催產(chǎn)素沒有混雜的加壓素，比提取的天然藥品好。已經(jīng)成功合成含124 個殘基的蛋白。第一個人工合成的酶是牛胰核糖核酸酶。第四節(jié)蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的多肽鏈并不是線形伸展的，而是按一定方式折疊盤繞成特有的空間結(jié)構(gòu)，并且一個特定蛋白質(zhì)形式其功能的能力通常是由它的三維結(jié)構(gòu)或構(gòu)象決定的。蛋白質(zhì)的這種天然折疊結(jié)構(gòu)決定于三個因素：1. 與溶劑分子（一般是水）的相互作用2.溶劑的PH和離子組成3.蛋白質(zhì)的氨基酸序列，最后一個是最重要的因素。蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象，也稱空間結(jié)構(gòu)或高級結(jié)構(gòu)，是指蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在三維空間上的排列、分布及肽鏈的

51、走向。高級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)表現(xiàn)其生物功能或活性所必須的，包括二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。Primary structure, secondary, tertiary, quaternary structure至今研究蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)取得的成就主要是應(yīng)用間接的X射線衍射法取得的研究溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的光譜學(xué)方法有：紫外差光譜熒光和熒光偏振圓二色性核磁共振穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力穩(wěn)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的作用力主要是一些所謂弱的相互作用或稱非共價鍵或次級鍵，包括氫鍵、范德華力、疏水作用和鹽鍵（離子鍵），這些弱的相互作用也是穩(wěn)定核酸構(gòu)象、生物膜結(jié)構(gòu)的作用力。此外共價二硫鍵在穩(wěn)定某些蛋白質(zhì)的構(gòu)象方面也起著重要作用。氫

52、鍵：多肽主鏈上的羰基氧和酰胺氫之間形成的氫鍵，它們是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要作用力。除此之外，氫鍵還可以在側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與介質(zhì)水、主鏈肽基與側(cè)鏈或主鏈肽基與水之間形成。大多數(shù)蛋白質(zhì)所采取的折疊策略是使主鏈肽基之間形成最大數(shù)目的分子內(nèi)氫鍵（如-螺旋， 折疊） 與此同時保持大多數(shù)能成氫鍵的側(cè)鏈處于蛋白質(zhì)分子的表面將于水相互作用。范德華力：包括 3 種比較弱的作用力，即定向效應(yīng)、誘導(dǎo)效應(yīng)、分散效應(yīng)定向效應(yīng)：發(fā)生在極性分子或極性基團(tuán)之間，它是永久偶極間的靜電相互作用，氫鍵被認(rèn)為可以屬于這種范德華力。誘導(dǎo)效應(yīng)：發(fā)生在極性物質(zhì)與非極性物質(zhì)之間，這是永久偶極與由它誘導(dǎo)而來的誘導(dǎo)偶極之間的靜電相互作用，分散

53、效應(yīng)：在多數(shù)情況在多數(shù)情況下起主要作用的范德華力；它是非極性分子或基團(tuán)間僅有的一種范德華力即下一的范德華力，也稱London 分散力， 通常范德華力就是值這種力。雖然就個別來說范德華力是很弱的，但是范德華相互作用數(shù)量大并且具有加和效應(yīng)和位相效應(yīng)（當(dāng)分子或基團(tuán)相同時，其瞬時偶極矩同位相，從而產(chǎn)生最大的相互作用），因此就成為一種不可忽視的作用力。疏水效應(yīng)（熵效應(yīng)）水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊縱使傾向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部。這一現(xiàn)象被稱為疏水作用或疏水效應(yīng)。疏水基團(tuán)或疏水側(cè)鏈出自避開水的需要而被迫接近。蛋白質(zhì)溶液系統(tǒng)的熵增加是疏水作用的主要動力。疏水基團(tuán)的聚集（相互作用）本事是有序化的過程，造成熵

54、減少.當(dāng)疏水化合物或基團(tuán)計入水中，它周圍的水分子將排列成剛性的剛性結(jié)構(gòu)，即所謂籠型結(jié)構(gòu)， 這種結(jié)構(gòu)認(rèn)為比冰更加有序化。與此相反的過程（疏水作用）， 排列有序的水分子（籠型結(jié)構(gòu)）將被破壞，這部分水分子被排入到自由水中，這樣水的混亂度增加，即熵增加，因 此疏水作用是熵驅(qū)動的自發(fā)過程。疏水作用在生理溫度范圍內(nèi)隨溫度升高而加強(qiáng)，但超過一定溫度，又趨漸減弱。因為超 過這個溫度，疏水基團(tuán)周圍的水分子有序度降低，因而有利于疏水基團(tuán)進(jìn)入水中。非極性溶劑、去污劑是破壞疏水作用的試劑，因此是變性劑。尿素和鹽酸胍既能破壞氫 鍵，又能破壞疏水作用，因此是強(qiáng)變性劑。鹽鍵又稱鹽橋或離子鍵，是正電荷與負(fù)電荷之間的一種靜電相

55、互作用。鹽鍵的形成不僅是靜電心音而且也是熵增的過程。升高溫度時，因而增加鹽橋的穩(wěn)定性，此外，鹽鍵因加入非極性溶劑而加強(qiáng)，加入鹽類而減弱。二硫鍵二硫鍵的形成并不規(guī)定多肽鏈的折疊，然而蛋白質(zhì)一旦采取了它的三維結(jié)構(gòu)則二硫鍵的形成將對此構(gòu)象起穩(wěn)定作用。假如蛋白質(zhì)中所有二硫鍵相繼被還原，將引起蛋白質(zhì)天然構(gòu)象改變和生物活性丟失。某些二硫鍵是生物活性必須的，有一些則不是必須的，但與維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定有關(guān)，在絕大多數(shù)情況下，二硫鍵是在多肽鏈的轉(zhuǎn)角附件形成的。多肽鏈折疊的空間限制因為肽鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，所以肽鍵的四個原子和與之相連的兩個a碳原子共處一個平面， 稱肽平面。肽平面內(nèi)的 C=O與Nl- H呈反式排列，各原子間的鍵長和鍵角都是固定的。肽鏈 可看作由一系列剛性的肽平面通過a碳原子連接起來的長鏈，主鏈的構(gòu)象就是由肽平面之間的角度決定的。主鏈上只有a碳原子連接的兩個鍵是單鍵，可自由旋轉(zhuǎn)。繞Ca - N1旋轉(zhuǎn)的角稱，而繞Ca C2旋轉(zhuǎn)的角稱W。這兩個角稱為二面角。規(guī)定當(dāng)旋轉(zhuǎn)鍵兩側(cè)的肽鏈成順式時為 0 度。 取值范圍是正負(fù)180 度， 當(dāng)二面角都是180 度時肽鏈完全伸展。由于空間位阻，實(shí)際的取值范